CN103205388A - 一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法，它包括以下步骤：菌种选择、斜面种子培养、固体种子培养、固体发酵培养、发酵产物烘干和发酵产物闪蒸。本发明的培养基原料都是采用农副产品，成本低，配方合理，能够满足菌种繁殖营养需要。特别是加入碳酸钙缓冲培养过程中培养基的pH值变化，能大大提高了固体发酵的地衣芽孢杆菌有效活菌含量，实验及生产证明利用本发明方法制备的地衣芽孢杆菌的有效活菌数可达1000亿/克，产品杂菌率低于5%，且芽孢率高，达90%以上，能大大降低企业的生产成本，满足微生物菌剂生产的需要。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法。
背景技术
地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）是芽孢杆菌属的一种，单个细胞，0.6~0.8×1.5~3微米，细胞形态和排列呈杆状、单生，细胞内无聚-β-羟基丁酸盐颗粒，革兰氏阳性杆菌。产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。菌落为扁平、边缘不整齐、白色。
地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）具有多种功能，是一种可以应用于多个领域的优良菌种，例如可以作为微生物农药、微生物饲料添加剂、微生物肥料、净水剂等。它的主要功能有抑制有害细菌（大肠杆菌、产气荚膜梭菌）的生长，使机体内的有益菌增加而潜在的致病菌减少；能产生多种消化酶，如蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，能帮助动物对营养物质的消化吸收；能有效降解水中有机质，改善水质，抑制有害藻类的过度繁殖；减轻植物病害，降低农药残留，改善土壤微生态环境。
地衣芽孢杆菌生产主要有液体发酵和固体发酵两种，液体发酵需要全套的发酵罐装置，其优点是发酵过程易于控制，产品纯度高，缺点是发酵后需要吸附干燥，工艺程序多，投资大，耗能高，环境污染比较严重；固体发酵一般在发酵房中进行，其优点是发酵产量高且发酵后不需吸附，直接烘干粉碎即可使用，工艺简单，缺点是发酵过程不易控制，杂菌污染不易控制。
中国专利申请号为201110324147.2的发明专利，公布了一种以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法，但是其所使用的菌株、种子培养的具体方法、固体发酵培养的具体操作步骤、发酵产物晾干的方法以及所使用的培养基的配方均不相同，该对比文件的操作方法复杂，生产效率低。其次，该对比文件所使用的培养基配方其pH值为自然值，不需要额外调节，但采用农副产品原料做固体培养基，经高温高压灭菌后，培养基pH值一般都会降的比较低，偏酸，不利于提高固体发酵的有效活菌含量。此外，该对比文件的种子培养采用的是二级液体种子，液体发酵需要全套的发酵罐装置，发酵后需要吸附干燥，工艺程序多，设备成本高，投资大，耗能高，环境污染严重。
地衣芽孢杆菌固体发酵过程重要的影响因素有培养基配方、水分、温度和pH值。由于发酵过程中产热，料温升高的很快，一般的敞开培养方式水分和温度都不易控制。因此，通过合理的培养基配方和培养条件的控制，建立模式化固体发酵法生产地衣芽孢杆菌的方法具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于针对现有地衣芽孢杆菌固体发酵技术存在的问题，提供一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌的方法，生产的地衣芽孢杆菌有效活菌数高，企业的生产成本低。
本发明的目的通过以下技术方案实现的。
1. 一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法，它包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）CGMCC1.0518菌株；所述菌种为中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号为NO:1.0518的地衣芽孢杆菌。
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，培养温度为28~45℃，培养时间为36~48小时，得斜面种子；
（3）固体种子培养：将步骤（2）得到的斜面种子用无菌水清洗，收集于三角瓶中，调整菌液浓度为108个/mL，然后以5~10% v/w（体积质量比）的接种量，将该菌液接种于经121℃、90~120min灭菌的固体培养基中，培养温度为28~45℃，培养时间为48~96小时，得固体种子；
（4）固体发酵培养：将步骤（3）得到的固体种子倒入10~40L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以1~5% v/w（体积质量比）的接种量，接种于经121℃、90~120min灭菌的固体培养基中，随后将接种的固体培养基以10~20厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在28~45℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵48~120小时，发酵结束；
（5）发酵产物烘干：将步骤（4）的发酵产物置于50~80℃烘房中烘干24~48小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（6）发酵产物闪蒸：将步骤（5）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸机进口温度为80~130℃，出口温度为50~70℃；干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵产品；
其中，所述步骤（2）涉及的营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟；
其中，所述步骤（3）、步骤（4）涉及的固体种子培养、固体发酵培养用固体培养基配方及制备方法为：以重量百分比计，米糠40~60%，豆粕粉20~40%，玉米粉5~20%，花生壳粉5~20% 酵母粉1~5%，硫酸镁0.1~0.5%，磷酸氢二钾0.1~0.5%，硫酸锰0.1~0.5%，碳酸钙1~5%，料水质量比1:0.9~1:1.1，用石灰调pH为9.0~10.0，均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌90~120分钟备用。
本发明中，灭菌之前先用石灰将培养基pH值调到碱性，这样灭菌后培养基pH值就为中性，利于地衣芽孢杆菌的初始生长。地衣芽孢杆菌在培养过程中会产酸使培养基pH值过快降低，不利于长时间维持菌体的增殖，本配方中加入的碳酸钙可缓冲培养基的pH值，使菌体能较长时间保持增殖，因此能得到更大的活菌数。
利用系列稀释法对含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，可计算出地衣芽孢杆菌的有效活菌数。
其中，所述步骤（3）和步骤（4）中，所述固体培养基均为1L固体菌种瓶装180~250g湿固体培养基料。优选地，1L固体菌种瓶装200g湿固体培养基料。固体培养基湿料的重量少于180g则制成的培养基厚度薄，培养过程中培养基容易变干；而固体培养基湿料的重量大于250g，则制成的培养基厚度厚，接种后的培养基底部透气性及散热性差，影响菌种的接种效果，进一步导致有效活菌含量减少。
其中，所述步骤（3）中，固体种子培养用固体培养基配方及制备方法为以重量百分比计，米糠40~50%，豆粕粉20~25%，玉米粉10~20%，花生壳粉5~12% 酵母粉1~5%，硫酸镁0.1~0.5%，磷酸氢二钾0.1~0.5%，硫酸锰0.1~0.5%，碳酸钙3~5%，料水质量比1:0.9~1:1.1，用石灰调pH为9.0~10.0，均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌100~120分钟备用。
其中，所述步骤（4）中，固体发酵用固体培养基配方及制备方法为以重量百分比计，米糠45~60%，豆粕粉20~35%，玉米粉5~15%，花生壳粉10~20% 酵母粉1~5%，硫酸镁0.1~0.5%，磷酸氢二钾0.1~0.5%，硫酸锰0.1~0.5%，碳酸钙2~4%，料水质量比1:0.9~1:1.1，用石灰调pH为9.0~10.0，均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌100~120分钟备用。
其中，所述步骤（2）中，培养温度为35~40℃，培养时间为40~48小时。
其中，所述步骤（3）中，培养温度为35~40℃，培养时间为60~84小时。
其中，所述步骤（4）中，环境温度在35~45℃，发酵时间为60~108小时。
其中，所述步骤（4）中，无菌风的气流速度是7~10米/分钟。
其中，所述步骤（5）中，烘房温度为50~65℃，烘干时间为24~36小时。
本发明的有益效果为：
（1）培养基原料都是采用农副产品，成本低，配方合理，能够满足菌种繁殖营养需要。特别是加入碳酸钙缓冲培养过程中培养基的pH值变化，确保菌种在繁殖过程中培养基始终处于中性偏碱性条件下，大大提高了固体发酵的地衣芽孢杆菌有效活菌含量，实验及生产证明利用本发明方法制备的地衣芽孢杆菌的有效活菌数可达1000亿/克以上，且芽孢率高，达90%以上。
（2）培养基配方合理，工艺先进，本发明工艺生产的产品杂菌率低于5%，大大低于一般固体发酵工艺生产的产品。
（3）本发明对环境污染低，符合国家产业政策。
（4）采用先烘房烘干再闪蒸机闪蒸干燥的工艺，能使最终产品水分含量降低至5%以下。
（5）本发明采用固体种子接种，工艺简单，不需要大型设备，成本低，对人员要求也相对较低。
（6）本发明具有创新性和实用性，生产的地衣芽孢杆菌有效活菌数高，能大大降低企业的生产成本，满足微生物菌剂生产的需要。
具体实施方式
下面结合实施例1~6对本发明作进一步的说明。
实施例1。
本实施例的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）CGMCC1.0518菌株；
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，30℃培养48小时，得斜面种；
（3）固体种子培养：将斜面种用无菌水洗下，收集于三角瓶中，以系列稀释法进行平板计数，该菌悬液活菌含量为2×109/mL，用无菌水稀释为1×108/mL，然后以5% v/w（体积质量比）的接种量，将该菌液接种于经121℃、90min灭菌的固体培养基中（1L固体菌种瓶装180g湿料），30℃培养60小时，得固体种子；
（4）固体发酵培养：将步骤（3）得到的固体种倒入10L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以1% v/w（体积质量比）的接种量，接种于经121℃、900min灭菌的固体培养基中，随后将接种的固体培养基以10厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在30℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵72小时，发酵结束；
（5）发酵产物烘干：将步骤（4）发酵产物置于50℃烘房中烘干36小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（6）发酵产物闪蒸：将步骤（5）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸进口温度90℃，出口温度60℃。干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵产品。以系列稀释法对含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落技术，结果是：有效活菌数为9.1×1010/克发酵干料，芽孢率92%，水分3.2%。
上述营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟。
上述固体种子培养、固体发酵培养用培养基配方及制备方法为：米糠40%，豆粕粉20%，玉米粉20%，花生壳粉12.5% 酵母粉1%，硫酸镁0.5%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸锰0.5%，碳酸钙5%，料水质量比1:0.9，用石灰调pH为10.0。均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌90分钟备用。
实施例2。
本实施例的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）CGMCC1.0518菌株；
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，30℃培养48小时，得斜面种；
（3）固体种子培养：将斜面种用无菌水洗下，收集于三角瓶中，以系列稀释法进行平板计数，该菌悬液活菌含量为1.8×109/mL，用无菌水稀释为1×108/mL，然后以5% v/w（体积质量比）的接种量，将该菌液接种于经121℃、100min灭菌的固体培养基中（1L固体菌种瓶装190g湿料），32℃培养55小时，得固体种子；
（4）固体发酵培养：将步骤（3）得到的固体种倒入20L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以2% v/w（体积质量比）的接种量，接种于经121℃、100min灭菌的固体培养基中，随后将接种的固体培养基以12厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在32℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵84小时，发酵结束；
（5）发酵产物烘干：将步骤（4）发酵产物置于55℃烘房中烘干24小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（6）发酵产物闪蒸：将步骤（5）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸进口温度100℃，出口温度70℃。干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵产品。以系列稀释法对含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落技术，结果是：有效活菌数为9.8×1010/克发酵干料，芽孢率94%，水分3.3%。
上述营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟。
上述固体种子培养、固体发酵培养用培养基配方及制备方法为：米糠49.7%，豆粕粉25%，玉米粉10%，花生壳粉10% 酵母粉2%，硫酸镁0.1%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸锰0.1%，碳酸钙3%，料水质量比1:1，用石灰调pH为10.0。均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌100分钟备用。
实施例3。
本实施例的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）CGMCC1.0518菌株；
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，30℃培养48小时，得斜面种；
（3）固体种子培养：将斜面种用无菌水洗下，收集于三角瓶中，以系列稀释法进行平板计数，该菌悬液活菌含量为2×109/mL，用无菌水稀释为1×108/mL，然后以5% v/w（体积质量比）的接种量，将该菌液接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中（1L固体菌种瓶装200g湿料），40℃培养48小时，得固体种子；
（4）固体发酵培养：将步骤（3）得到的固体种倒入25L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以3% v/w（体积质量比）的接种量，接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中，随后将接种的固体培养基以15厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在40℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵72小时，发酵结束；
（5）发酵产物烘干：将步骤（4）发酵产物置于60℃烘房中烘干36小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（6）发酵产物闪蒸：将步骤（5）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸进口温度100℃，出口温度65℃。干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵产品。以系列稀释法对含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落技术，结果是：有效活菌数为1.05×1011/克发酵干料，芽孢率91%，水分3.1%。
上述营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟。
上述固体种子培养、固体发酵培养用培养基配方及制备方法为：米糠60%，豆粕粉20%，玉米粉5%，花生壳粉7.1% 酵母粉3%，硫酸镁0.3%，磷酸氢二钾0.3%，硫酸锰0.3%，碳酸钙4%，料水质量比1:0.9，用石灰调pH为10.0。均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌120分钟备用。
实施例4。
本实施例的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）CGMCC1.0518菌株；
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，28℃培养45小时，得斜面种；
（3）固体种子培养：将斜面种用无菌水洗下，收集于三角瓶中，以系列稀释法进行平板计数，该菌悬液活菌含量为2×109/mL，用无菌水稀释为1×108/mL，然后以6% v/w（体积质量比）的接种量，将该菌液接种于经121℃、110min灭菌的固体培养基中（1L固体菌种瓶装200g湿料），28℃培养96小时，得固体种子；
（4）固体发酵培养：将步骤（3）得到的固体种倒入10L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以4% v/w（体积质量比）的接种量，接种于经121℃、110min灭菌的固体培养基中，随后将接种的固体培养基以16厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在45℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵48小时，发酵结束；
（5）发酵产物烘干：将步骤（4）发酵产物置于80℃烘房中烘干24小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（6）发酵产物闪蒸：将步骤（5）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸进口温度120℃，出口温度70℃。干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵产品。以系列稀释法对含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落技术，结果是：有效活菌数为9.1×1010/克发酵干料，芽孢率95%，水分3.4%。
上述营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟。
上述固体种子培养、固体发酵培养用培养基配方及制备方法为：米糠45%，豆粕粉35%，玉米粉7%，花生壳粉5.5% 酵母粉1%，硫酸镁0.5%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸锰0.5%，碳酸钙5%，料水质量比1:1.1，用石灰调pH为9.0。均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌110分钟备用。
实施例5。
本实施例的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）CGMCC1.0518菌株；
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，35℃培养40小时，得斜面种；
（3）固体种子培养：将斜面种用无菌水洗下，收集于三角瓶中，以系列稀释法进行平板计数，该菌悬液活菌含量为1.8×109/mL，用无菌水稀释为1×108/mL，然后以8% v/w（体积质量比）的接种量，将该菌液接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中（1L固体菌种瓶装220g湿料），40℃培养75小时，得固体种子；
（4）固体发酵培养：将步骤（3）得到的固体种倒入20L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以5% v/w（体积质量比）的接种量，接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中，随后将接种的固体培养基以18厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在36℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵100小时，发酵结束；
（5）发酵产物烘干：将步骤（4）发酵产物置于75℃烘房中烘干40小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（6）发酵产物闪蒸：将步骤（5）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸进口温度95℃，出口温度75℃。干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵产品。以系列稀释法对含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落技术，结果是：有效活菌数为9.8×1010/克发酵干料，芽孢率97%，水分3.5%。
上述营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟。
上述固体种子培养、固体发酵培养用培养基配方及制备方法为：米糠50%，豆粕粉22%，玉米粉11%，花生壳粉8.4% 酵母粉5%，硫酸镁0.2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸锰0.2%，碳酸钙3%，料水质量比1:1，用石灰调pH为9.5。均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌120分钟备用。
实施例6。
本实施例的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）CGMCC1.0518菌株；
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，45℃培养36小时，得斜面种；
（3）固体种子培养：将斜面种用无菌水洗下，收集于三角瓶中，以系列稀释法进行平板计数，该菌悬液活菌含量为2×109/mL，用无菌水稀释为1×108/mL，然后以10% v/w（体积质量比）的接种量，将该菌液接种于经121℃、115min灭菌的固体培养基中（1L固体菌种瓶装250g湿料），45℃培养50小时，得固体种子；
（4）固体发酵培养：将步骤（3）得到的固体种倒入25L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以3% v/w（体积质量比）的接种量，接种于经121℃、115min灭菌的固体培养基中，随后将接种的固体培养基以20厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在28℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵120小时，发酵结束；
（5）发酵产物烘干：将步骤（4）发酵产物置于70℃烘房中烘干35小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（6）发酵产物闪蒸：将步骤（5）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸进口温度80℃，出口温度50℃。干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵产品。以系列稀释法对含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落技术，结果是：有效活菌数为1.05×1011/克发酵干料，芽孢率93%，水分3.3%。
上述营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟。
上述固体种子培养、固体发酵培养用培养基配方及制备方法为：米糠50%，豆粕粉20%，玉米粉5%，花生壳粉16.1% 酵母粉4%，硫酸镁0.3%，磷酸氢二钾0.3%，硫酸锰0.3%，碳酸钙4%，料水质量比1:1.1，用石灰调pH为9.0。均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌115分钟备用。
本发明的实施例1~6的各项数据列表如下。
表1：实施例1~6的各步骤参数表。
| 实施例1 | 实施例 2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例 5 | 实施例 6 | |
| 斜面种子培养温度（℃） | 30 | 30 | 30 | 28 | 35 | 45 |
| 斜面种子培养时间（h） | 48 | 48 | 48 | 45 | 40 | 36 |
| 菌悬液活菌含量（ml） | 2×109 | 1.8×109 | 2×109 | 2×109 | 1.8×109 | 2×109 |
| 固体种子培养接种量（v/w） | 5% | 5% | 5% | 6% | 8% | 10% |
| 固体种子培养温度（℃） | 30 | 32 | 40 | 28 | 40 | 45 |
| 固体种子培养时间（h） | 60 | 55 | 48 | 96 | 75 | 50 |
| 无菌水（L） | 10 | 20 | 25 | 10 | 20 | 25 |
| 菌液接种量（v/w） | 1% | 2% | 3% | 4% | 5% | 3% |
| 固体培养基厚度（cm） | 10 | 12 | 15 | 16 | 18 | 20 |
| 环境温度（℃） | 30 | 32 | 40 | 45 | 36 | 28 |
| 发酵时间（h） | 72 | 84 | 72 | 48 | 100 | 120 |
| 烘房温度（℃） | 50 | 55 | 60 | 80 | 75 | 70 |
| 烘干时间（h） | 36 | 24 | 36 | 24 | 40 | 35 |
| 闪蒸进口温度（℃） | 90 | 100 | 100 | 120 | 95 | 80 |
| 闪蒸出口温度（℃） | 60 | 70 | 65 | 70 | 75 | 50 |
表2：实施例1~6的培养基配方表。
| 固体培养基配方 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 |
| 米糠 | 40% | 49.7% | 60% | 45% | 50% | 50% |
| 豆粕粉 | 20% | 25% | 20% | 35% | 22% | 20% |
| 玉米粉 | 20% | 10% | 5% | 7% | 11% | 5% |
| 花生壳粉 | 12.5% | 10% | 7.1% | 5.5% | 8.4% | 16.1% |
| 酵母粉 | 1% | 2% | 3% | 1% | 5% | 4% |
| 硫酸镁 | 0.5% | 0.1% | 0.3% | 0.5% | 0.2% | 0.3% |
| 磷酸氢二钾 | 0.5% | 0.1% | 0.3% | 0.5% | 0.2% | 0.3% |
| 硫酸锰 | 0.5% | 0.1% | 0.3% | 0.5% | 0.2% | 0.3% |
| 碳酸钙 | 5% | 3% | 4% | 5% | 3% | 4% |
| 料水质量比 | 1:0.9 | 1:1 | 1:0.9 | 1:1.1 | 1:1 | 1:1.1 |
| 用石灰调pH为 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 9.0 | 9.5 | 9.0 |
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）CGMCC1.0518菌株；
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，培养温度为28~45℃，培养时间为36~48小时，得斜面种；
（3）固体种子培养：将步骤（2）得到的斜面种用无菌水洗下，收集于三角瓶中，调整菌液浓度为108个/mL，然后以5~10% v/w（体积质量比）的接种量，将该菌液接种于经121℃、90~120min灭菌的固体培养基中，培养温度为28~45℃，培养时间为48~96小时，得固体种子；
（4）固体发酵培养：将步骤（3）得到的固体种子倒入10~40L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以1~5% v/w（体积质量比）的接种量，接种于经121℃、90~120min灭菌的固体培养基中，随后将接种的固体培养基以10~20厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在28~45℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵48~120小时，发酵结束；
（5）发酵产物烘干：将步骤（4）的发酵产物置于50~80℃烘房中烘干24~48小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（6）发酵产物闪蒸：将步骤（5）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸机进口温度为80~130℃，出口温度为50~70℃；干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含地衣芽孢杆菌活菌的固体发酵产品；
其中，所述步骤（2）涉及的营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟；
其中，所述步骤（3）和步骤（4）中涉及的固体种子培养、固体发酵培养用固体培养基配方及制备方法为：以重量百分比计，米糠40~60%，豆粕粉20~40%，玉米粉5~20%，花生壳粉5~20% 酵母粉1~5%，硫酸镁0.1~0.5%，磷酸氢二钾0.1~0.5%，硫酸锰0.1~0.5%，碳酸钙1~5%，料水质量比1:0.9~1:1.1，用石灰调pH为9.0~10.0，均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌90~120分钟备用。
2.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（3）和步骤（4）中，所述固体培养基均为1L固体菌种瓶装180~250g湿固体培养基料。
3.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，固体种子培养用固体培养基配方及制备方法为以重量百分比计，米糠40~50%，豆粕粉20~25%，玉米粉10~20%，花生壳粉5~12% 酵母粉1~5%，硫酸镁0.1~0.5%，磷酸氢二钾0.1~0.5%，硫酸锰0.1~0.5%，碳酸钙3~5%，料水质量比1:0.9~1:1.1，用石灰调pH为9.0~10.0，均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌100~120分钟备用。
4.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，固体发酵用固体培养基配方及制备方法为以重量百分比计，米糠45~60%，豆粕粉20~35%，玉米粉5~15%，花生壳粉10~20% 酵母粉1~5%，硫酸镁0.1~0.5%，磷酸氢二钾0.1~0.5%，硫酸锰0.1~0.5%，碳酸钙2~4%，料水质量比1:0.9~1:1.1，用石灰调pH为9.0~10.0，均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌100~120分钟备用。
5.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，培养温度为35~40℃，培养时间为40~48小时。
6.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，培养温度为35~40℃，培养时间为60~84小时。
7.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，环境温度在35~45℃，发酵时间为60~108小时。
8.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，无菌风的气流速度是7~10米/分钟。
9.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产地衣芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（5）中，烘房温度为50~65℃，烘干时间为24~36小时。
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|---|---|---|---|---|
| CN107619841A (zh) * | 2016-07-21 | 2018-01-23 | 济南航晨生物科技有限公司 | 一种地衣芽孢杆菌高密度发酵偶联γ‑聚谷氨酸转化的发酵技术 |
| CN108913630A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-11-30 | 广东容大生物股份有限公司 | 一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基 |
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| CN112553121A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-26 | 中农新科(苏州)有机循环研究院有限公司 | 一种耐高温芽孢杆菌超高密度固体发酵方法 |
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| CN102352334A (zh) * | 2011-10-21 | 2012-02-15 | 山东省农业科学院高新技术研究中心 | 以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法 |
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