CN108913630A - 一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基，其由以下成分组成：马铃薯150～200g/L、葡萄糖15～25g/L、玉米浆4.5～7.5g/mL、蛋白胨15～25g/L、豆饼粉5～9g/L、琼脂粉20～25g/L、氯霉素10～30ug/mL、细菌复苏促进因子Rpf 10～30mL、蒸馏水1000mL。本发明制备的培养基通过添加氯霉素，能在不影响地衣芽孢杆菌生长的情况下明显抑制其它杂菌生长，显著降低杂菌率，并且添加的细菌复苏促进因子能显著提高地衣芽孢杆菌的生长率，培养出高质量的地衣芽孢杆菌，减轻筛选的工作量，节约时间成本，有利于地衣芽孢杆菌的推广生产。

Description

一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基。

背景技术

地衣芽孢杆菌(学名：Bacillus licheniformis)是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜热细菌，是一种能够产生芽孢的兼性厌氧菌。它的细胞形态和排列呈杆状、单生。细胞内无聚-β-羟基丁酸盐(PHB)颗粒，产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。地衣芽孢杆菌具有繁殖速度快、容易培养、抗逆性强、耐高温、耐酸碱、耐挤压的特点，并且它能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及氨基酸等多种物质。

它的主要功能为促进肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调，恢复肠道功能；对肠道细菌感染具有特效，对轻型或重型急性肠炎，轻型及普通型的急性菌痢等，均有明显疗效；能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。

基于上述功能，地衣芽孢杆菌成为了芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一，近年来，国内对地衣芽孢杆菌应用于各方面的报道日益增加，其在医药、饲料加工、农药等行业的研究也取得了较好的成果。除此之外，地衣芽孢杆菌还可应用于植物病害的防治和环境污染的防止等领域。因此，地衣芽孢杆菌的培养将对这些行业和领域的发展奠定良好的基础。

目前，对于地衣芽孢杆菌的培养主要采用传统的培养方式，即使用普通琼脂培养基进行培养，该方法在培养过程中易产生杂菌，使得培养过后还需要对菌种进行筛选，从而增加实验步骤，不便于实验操作的进行。

中国专利CN 105018398 B公开了一种地衣芽孢杆菌培养基及其制备方法，主要涉及培养基领域。该发明公开的培养基由玉米浆4-9份、蛋白胨3-8份、甘蔗5-9份、牛肉汤20-30份、黄麻子3-9份、香附4-10份、牛筋草5-9份、黄耆3-9份、三白草根4-10份、氯化铵0.1-0.3份、碳酸氢钙0.05-0.2份、磷酸氢锌0.05-0.3份和硫酸氢钠0.1-0.2份组成，采用蒸煮、过滤、混合搅拌、调节pH、灭菌等方法得到地衣芽孢杆菌培养基。该培养基具有成本低、培养的芽孢产率高、制得的地衣芽孢杆菌抑菌活性高的优点，但未提及培养过程中能使杂菌减少并提高地衣芽孢杆菌生长率的有关记载。由于在培养地衣芽孢杆菌时，采用传统培养基容易被杂菌污染，虽然能通过肉眼辨别出地衣芽孢杆菌，但是会使制备过程中的工作量增大，且培养过程中生长率较低，既消耗了劳动力，又增加了时间成本。因此，寻找一种能抑制杂菌生长、提高地衣芽孢杆菌生长率的培养基迫在眉睫。

发明内容

为解决现有技术中存在的缺陷和不足，本发明的主要目的在于提供一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基。该培养基的制备工艺简单，不易被杂菌污染，既能减轻筛选的工作量，又能节约时间成本，具有抑制杂菌生长、提高地衣芽孢杆菌生长率的优点。

为了达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基，其特征在于，由以下成分组成：马铃薯150～200g/L、葡萄糖15～25g/L、玉米浆4～8g/mL、蛋白胨15～25g/L、豆饼粉5～9g/L、琼脂粉15～25g/L、氯霉素10～30ug/mL、细菌复苏促进因子Rpf 10～30mL、蒸馏水1000mL。

本申请人为了解决现有技术中培养基杂菌过多的问题，在培养基中添加了氯霉素，由于地衣芽孢杆菌对其不敏感，因此在合理用量范围内将氯霉素添加到培养基中，可以有效抑制杂菌的生长，且不影响地衣芽孢杆菌的培养和生长。除此之外，还在培养基中加入了细菌复苏促进因子Rpf，可以使地衣芽孢杆菌更快地复苏，减少培养时间，提高培养效率。

优选地，由以下成分组成：马铃薯180～200g/L、葡萄糖20～25g/L、玉米浆5～7g/mL、蛋白胨20～25g/L、豆饼粉7～9g/L、琼脂粉20～25g/L、氯霉素15～25ug/mL、细菌复苏促进因子Rpf 15～25mL、蒸馏水1000mL。

优选地，所述的细菌复苏促进因子Rpf的制备方法为：将少量结核分支杆菌接种于普通肉汤培养基上，培养至对数期后在10000r/d下离心5～10min，抽提除去菌体，细菌液用滤膜过滤除菌后于-20℃下贮存备用，即为细菌复苏促进因子Rpf。

优选地，所述氯霉素溶液的制备方法为：取250mg氯霉素于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml，于-20℃贮存备用。

优选地，其制备方法如下：

(1)将马铃薯洗净、去皮、切块后放入锅中，加入1000mL蒸馏水，加热至沸腾后维持20～30min，用2层纱布趁热过滤，滤渣弃置，滤液加蒸馏水至1000mL；

(2)将滤液倒入锅中，加入葡萄糖、玉米浆、蛋白胨、豆饼粉和琼脂粉后加热搅拌至完全溶解；

(3)将步骤(2)所得的溶液分装至试管中，约为试管高度的1/5即可，调节pH 6～7.5，用棉塞将试管口塞紧；

(4)将全部试管用橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，用牛皮筋扎好后放入灭菌箱中进行高压蒸汽灭菌；

(5)高压灭菌后将试管取出，待其温度降至65～80℃时，在无菌条件下加入氯霉素和细菌复苏促进因子Rpf；

(6)待试管温度降至50～60℃时，将试管自然倾斜放置在超净工作台上，静置后待试管斜面成型即得到斜面培养基。

优选地，所述试管的规格为15×150mm，高压蒸汽灭菌的条件为0.1MPa下灭菌20min。

优选地，所述氯霉素加入培养基前需要用滤膜进行过滤除菌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的制备工艺简单，便于操作，通过添加细菌复苏促进因子Rpf能明显提高地衣芽孢杆菌的生长率，缩短培养时间；

2、本发明制备的培养基中添加了氯霉素，能抑制其它杂菌的生长，且由于地衣芽孢杆菌对其的不敏感性，因而能在不影响地衣芽孢杆菌生长的情况下显著降低杂菌率；

3、本发明制备的斜面培养基不易被杂菌污染，可培养出高质量的地衣芽孢杆菌；

4、本发明显著改善了地衣芽孢杆菌培养过程中杂菌产生较多的情况，既能减轻筛选的工作量，又能节约时间成本，有利于地衣芽孢杆菌的推广生产。

附图说明

图1为地衣芽孢杆菌活菌数测定值随培养时间变化趋势图。

具体实施方式

实施例1

一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基，其制备步骤如下：

(1)将200g马铃薯洗净、去皮、切块后放入锅中，加入1000mL蒸馏水，加热至沸腾后维持30min，然后用2层纱布趁热过滤，滤渣弃置，滤液加蒸馏水至1000mL；

(2)将滤液倒入锅中，加入葡萄糖15g/L、玉米浆5g/mL、蛋白胨15g/L、豆饼粉5g/L、琼脂粉20g/L后加热搅拌至完全溶解；

(3)将步骤(2)所得的溶液分装至试管中，约为试管高度的1/5即可，调节pH 6.5，用棉塞将试管口塞紧；

(4)将全部试管用橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，用牛皮筋扎好后放入灭菌箱中，在0.1MPa下进行高压蒸汽灭菌20min；

(5)高压灭菌后将试管取出，待其温度降至65℃时，在无菌条件下加入氯霉素15ug/mL、细菌复苏促进因子Rpf 15mL；

(6)趁热将试管自然倾斜放置在超净工作台上，静置后待试管斜面成型即得到斜面培养基。

实施例2

一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基，其制备步骤如下：

(1)将200g马铃薯洗净、去皮、切块后放入锅中，加入1000mL蒸馏水，加热至沸腾后维持30min，然后用2层纱布趁热过滤，滤渣弃置，滤液加蒸馏水至1000mL；

(2)将滤液倒入锅中，加入葡萄糖25g/L、玉米浆7g/mL、蛋白胨25g/L、豆饼粉9g/L、琼脂粉25g/L后加热搅拌至完全溶解；

(3)将步骤(2)所得的溶液分装至试管中，约为试管高度的1/5即可，调节pH 7.5，用棉塞将试管口塞紧；

(4)将全部试管用橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，用牛皮筋扎好后放入灭菌箱中，在0.1MPa下进行高压蒸汽灭菌20min；

(5)高压灭菌后将试管取出，待其温度降至80℃时，在无菌条件下加入氯霉素25ug/mL、细菌复苏促进因子Rpf 15mL；

(6)趁热将试管自然倾斜放置在超净工作台上，静置后待试管斜面成型即得到斜面培养基。

对比例1

地衣芽孢杆菌的传统培养基，其制备方法如下：

(1)称取蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g,琼脂15.0g，量取蒸馏水1L；

(2)将各成分溶于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min后得到培养基。

对比例2

一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基，其制备步骤如下：

(1)将200g马铃薯洗净、去皮、切块后放入锅中，加入1000mL蒸馏水，加热至沸腾后维持20min，然后用2层纱布趁热过滤，滤渣弃置，滤液加蒸馏水至1000mL；

(2)将滤液倒入锅中，加入葡萄糖15g/L、玉米浆5g/mL、蛋白胨15g/L、豆饼粉5g/L、琼脂粉20g/L后加热搅拌至完全溶解；

(3)将步骤(2)所得的溶液分装至试管中，约为试管高度的1/5即可，调节pH 6.5，用棉塞将试管口塞紧；

(4)将全部试管用橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，用牛皮筋扎好后放入灭菌箱中，在0.1MPa下进行高压蒸汽灭菌20min；

(5)高压灭菌后将试管取出，趁热将试管自然倾斜放置在超净工作台上，静置后待试管斜面成型即得到斜面培养基。

对比例2与实施例相比，区别在于没有添加氯霉素和细菌复苏促进因子。

对比例3

一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基，其制备步骤如下：

(1)将200g马铃薯洗净、去皮、切块后放入锅中，加入1000mL蒸馏水，加热至沸腾后维持20min，然后用2层纱布趁热过滤，滤渣弃置，滤液加蒸馏水至1000mL；

(2)将滤液倒入锅中，加入葡萄糖15g/L、玉米浆5g/mL、蛋白胨15g/L、豆饼粉5g/L、琼脂粉20g/L后加热搅拌至完全溶解；

(3)将步骤(2)所得的溶液分装至试管中，约为试管高度的1/5即可，调节pH 6.5，用棉塞将试管口塞紧；

(4)将全部试管用橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，用牛皮筋扎好后放入灭菌箱中，在0.1MPa下进行高压蒸汽灭菌20min；

(5)高压灭菌后将试管取出，待其温度降至80℃时，在无菌条件下加入氧哌嗪青霉素15ug/mL，细菌复苏促进因子Rpf 15mL；

(6)高压灭菌后将试管取出，趁热将试管自然倾斜放置在超净工作台上，静置后待试管斜面成型即得到斜面培养基。

对比例3与实施例相比，区别在于使用氧哌嗪青霉素替代氯霉素。

实验例1

斜面培养基的抑制杂菌生长实验，具体操作如下:

(1)将上述制备的培养基分为实施例1组、实施例2组、对比例1组、对比例2组、对比例3组，每组5个培养基；

(2)菌液的制备：在地衣芽孢杆菌菌种(保存于本实验室)中加入稀释液(灭菌生理盐水)，制备成1:10菌液；取1:10菌液4mL，加稀释液6mL，制成4:100菌液；之后按10倍梯度关系稀释，每次稀释时振荡器振摇60s，稀释制成4:10⁷菌液。

(3)取上述菌液用接种环蘸取一次(约25μL)，在无菌条件下均匀涂布于培养基上，迅速塞上试管塞，置于培养箱中，在25℃条件下培养20h；

(4)将经过培养的培养基取出，根据地衣芽孢杆菌的形态辨别培养基中的细菌是否是目标菌种，经过统计之后取平均数，计算出杂菌率。

根据上述方法进行统计计算，得到的实验结果如下所示：

表1各组培养基的杂菌率

组别	杂菌率
		实施例1组	1.9％
实施例2组	1.6％
		对比例1组	16.7％
对比例2组	9.2％
		对比例3组	3.2％

上述结果表明，使用本发明制备的斜面培养基进行培养，产生的杂菌明显少于传统培养基。由于斜面培养基较平面培养基而言不易被杂菌感染，因而设置对比例2组与实施例1～2组进行比较，结果表明，实施例1～2组中因为加入了氯霉素而明显抑制了杂菌的生长，没有氯霉素的对比例2组的杂菌率虽然比传统培养基小，但与本发明相比，杂菌率较高。对比例3组使用氧哌嗪青霉素替代青霉素，虽然有明显的抑菌效果，但不及氯霉素的效果好。

实验例2

斜面培养基的生长效果实验，具体实验方式如下：

(1)取实施例1、对比例1～3的培养基，分为4组，每组5个培养基。

(2)菌液的制备：将地衣芽孢杆菌菌种(保存于本实验室)中加入稀释液(灭菌生理盐水)，制备成1:10菌液；取1:10菌液4mL，加稀释液6mL，制成4:100菌液；之后按10倍梯度关系稀释，每次稀释时振荡器振摇60s，稀释制成4:10⁷菌液。

(3)取上述菌液用接种环蘸取一次(约25μL)，在无菌条件下均匀涂布于培养基上，迅速塞上试管塞，置于培养箱中，在25℃条件下培养20h；

(4)将上述三组培养基置于于25℃下培养20h，在培养的5h、10h、15h、20h分别观察计数，计算生长率，取平均值并记录。

根据上述方法进行实验和统计，得出的实验结果见附图1。

由附图1可知，本发明制备的培养基与传统培养基相比，具有良好的培养效果，能明显提高地衣芽孢杆菌的生长率。由实施例1组和对比例3组的生长率变化曲线可知，实施例1组的地衣芽孢杆菌生长率明显高于对比例3组，表明在本实验设置的用量范围内，氯霉素与氧哌嗪青霉素相比，对地衣芽孢杆菌生长的影响更加小。由实施例1组和对比例2组可知，在培养基中添加氯霉素和细菌生长因子，显著提高了地衣芽孢杆菌的生长率。

综上所述，本发明制备的斜面培养基能使培养出的地衣芽孢杆菌中的杂菌率较传统培养基而言显著降低，并且能将杂菌率控制在2％以下，除此之外，还能明显提高地衣芽孢杆菌的生长率。因此，本发明对于地衣芽孢杆菌的生产推广具有重要的促进意义，具有突出的实质性特点和显著的进步。

上述实施例仅示例性说明本发明的原理及其性能，不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员而言，皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通知常识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (6)

1.一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基，其特征在于，由以下成分组成：马铃薯150～200g/L、葡萄糖15～25g/L、玉米浆4～8g/mL、蛋白胨15～25g/L、豆饼粉5～9g/L、琼脂粉15～25g/L、氯霉素10～30ug/mL、细菌复苏促进因子Rpf 10～30mL、蒸馏水1000mL。

2.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基，其特征在于，由以下成分组成：马铃薯180～200g/L、葡萄糖20～25g/L、玉米浆5～7g/mL、蛋白胨20～25g/L、豆饼粉7～9g/L、琼脂粉20～25g/L、氯霉素15～25ug/mL、细菌复苏促进因子Rpf 15～25mL、蒸馏水1000mL。

3.根据权利要求1或2所述的一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基，其特征在于，所述的细菌复苏促进因子Rpf的制备方法为：将结核分支杆菌接种于普通肉汤培养基上，培养至对数期后离心，抽提除去菌体，细菌液用滤膜过滤除菌。

4.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基，其特征在于，制备方法如下：

A、将马铃薯放入锅中，加入1000mL蒸馏水，加热至沸腾后维持20～30min，用2层纱布过滤，取滤液加蒸馏水至1000mL；

B、将滤液倒入锅中，加入葡萄糖、玉米浆、蛋白胨、豆饼粉和琼脂粉后加热搅拌至完全溶解；

C、将步骤B所得的溶液分装至试管1/5处，调节pH 6～7.5，用棉塞将试管口塞紧；

D、将全部试管用橡皮筋捆好，放入灭菌箱中进行高压蒸汽灭菌；

E、高压灭菌并待其降温后，加入氯霉素和细菌复苏促进因子；

F、试管降温后，将其自然倾斜放置，待试管斜面成型即得斜面培养基。

5.根据权利要求4所述的一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基，其特征在于，所述试管的规格为15×150mm，高压蒸汽灭菌的条件为0.1MPa下灭菌20min。

6.根据权利要求4所述的一种地衣芽孢杆菌的斜面培养基，其特征在于，步骤E的温度为65～80℃，步骤F的温度为50～60℃。