CN106244503A - 一种除臭用em菌液制备方法 - Google Patents

一种除臭用em菌液制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种除臭用EM菌液制备方法，将常规的EM菌种分为DFA和DFB两个部分，分别在糖蜜培养基中培养48小时；其中：DFA培养温度为37℃，不通气培养；DFB培养温度为30℃，通气培养；培养后DFA和DFB按9:1的体积比混合，随后，30℃密闭发酵，培养24h，即得除臭用EM菌液。本发明在垃圾处理、畜牧养殖、污水处理等过程中除臭用的EM菌液制备方法，该菌液中活菌总数不低于109cfu/mL。

Description

一种除臭用EM菌液制备方法
技术领域
本发明涉及微生物制剂领域，尤其是一种用于垃圾除臭的EM菌液制备方法。
背景技术
EM菌(Effective Microorganisms)是由多种有益微生物（主要是光合细菌、乳酸菌、酵母菌、丝状真菌和放线菌）复合而成的有机组合，可在使用处形成良好的微生态环境，因而可以应用于环保、种植、畜牧、水产、饲料及人体家庭保健等方面，起到抑制病原菌、除异臭、改良土壤、改善水质、增强抗病性、促生长、改善产品品质等功效。
目前，环保、种植、畜牧等行业所用的EM菌并没有本质上的差异，只是不同用户所使用的品牌不同，其中的微生物种类及各菌种比例差异不显著。这种同一性使EM菌的针对性使用效果不理想，或者使用量过大，使用成本较高。
EM菌的菌种组成复杂，其中的光合细菌等多种微生物对除臭无作用，但在除臭过程中发挥重要作用的酵母、乳酸菌以及产生抗生素的微生物含量过低；而且由于菌种间的拮抗作用，传统的发酵方法生产的产品中菌体浓度通常较低，培养时间长，生产成本较高。市场急需一种专一性高、除臭效果好、用量少、成本低的EM菌产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在垃圾处理、畜牧养殖、污水处理等过程中除臭用的EM菌液制备方法，该菌液中活菌总数不低于109cfu/mL。
为了达成上述目的，本发明的技术方案如下：
一种除臭用EM菌液制备方法，将常规的EM菌种分为DFA和DFB两个部分，分别在糖蜜培养基中培养48小时；其中：DFA培养温度为37℃，不通气培养；DFB培养温度为30℃，通气培养；培养后DFA和DFB按9:1的体积比混合，随后，30℃密闭发酵，培养24h，即得除臭用EM菌液。
其中：DFA为不含酵母菌，以细菌和放线菌为主要成分的复合菌种；DFB为以酵母菌和丝状真菌为主要成分的复合菌种。
本发明所使用的出发菌液为市售EM菌液。
所述DFA的制备，包括以下步骤：
取常规EM菌液4℃下静置30天后的上层液体按1%接种至无菌的糖蜜培养基（按质量百分比计，糖蜜 8%，蛋白胨 2%，K2HPO4 0.6%，CaCO3 3%，自然pH）中，按90%装液量装入锥形瓶中，密闭发酵，37℃振荡培养7天后显微镜检，取无酵母的样品作DFA组分一；
取常规EM菌液按1%接种量接种至高温灭菌的LB培养基（按质量百分比计，胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，Nacl 1%,培养基pH控制在7.4）中，按90%装液量装入锥形瓶中，密闭发酵，37℃振荡培养7天后传代，重复上述操作，取显微镜检无酵母菌的样品作组分二；
利用LB固体培养基（按质量百分比计，胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，Nacl 1%,琼脂1.0%~1.5%，培养基pH控制在7.4）与PDA培养基（按质量百分比计，马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂1.5%~2.0%，自然pH）分离常规EM中菌种，除酵母菌外，分别培养分离得到的菌株后按相同比例接种至无菌的糖蜜培养基中，按90%装液量装入锥形瓶中，密闭发酵，自然协调菌种比例，37℃振荡培养7天作为组分三；
以上所得的三种无酵母发酵液均按3%接种量混合接种至高温灭菌的糖蜜培养基（培养基配方同前）中，按90%装液量装入锥形瓶中，密闭发酵，37℃振荡培养3天即得新鲜DFA，新鲜DFA与无菌保护液（蔗糖 100g/L、脱脂奶粉100g/L）等体积混合后-80℃真空冷冻干燥24h制成菌粉。
所述DFB的制备：取常规EM菌液4℃下静置30天后的菌泥，按1%接种量接种至无菌的糖蜜培养基（培养基配方同前）中，按25%装液量装入锥形瓶中，通氧发酵，30℃振荡培养3天即得新鲜DFB，新鲜DFB与无菌保护液（蔗糖 100g/L、脱脂奶粉 100g/L）等体积混合后-80℃真空冷冻干燥24h制成菌粉。
新鲜DFA菌液按2%量直接接种至无菌的糖蜜培养基（培养基配方同前）中，冻干菌粉需经种子培养（采用糖蜜培养基，培养基配方同前），90%装液量，1%接种量，37℃密闭振荡培养）24h后按10%量接种至无菌的糖蜜培养基（培养基配方同前）中，发酵罐装液量为70%，密闭发酵，每隔24小时搅拌10分钟（搅拌时打开放气阀放出气体，防止过压），37℃培养48小时；新鲜DFB菌液按2%量直接接种至无菌的糖蜜培养基（培养基配方同前）中，冻干菌粉需经种子培养（采用糖蜜培养基，培养基配方同前），25%装液量，1%接种量，30℃通气振荡培养）24h后按10%量接种至无菌的糖蜜培养基（培养基配方同前）中，30℃通气搅拌/振荡培养48小时；发酵后的DFA和DFB按9:1（V/V）混合后按70%装液量装入发酵罐或无菌密闭容器，30℃密闭发酵，每隔6小时搅拌10分钟（搅拌时打开放气阀放出气体，防止过压）培养24h即得除臭用EM菌液。
本发明使用时，根据待处理样品差异选择不同的使用方法。待处理样品为固体，如垃圾、粪便或养殖场时，将除臭用EM菌液用20-30℃温水稀释10倍，静置1h后喷洒表面，按照其臭味浓烈程度，原液使用量为待处理样品质量的0.1%-1%。待处理样品为液体，如生活污水、便池、工业废水等时，将除臭用EM菌液用20-30℃温水稀释3倍，静置1h后倾倒至待处理液体中，按照其臭味浓烈程度，原液使用量为待处理样品质量的0.001%-0.1%。
本发明菌液中酵母类真菌占总微生物比例为市售EM菌液中的10倍以上。
本发明通过通气培养，将酵母菌和霉菌等在除臭过程中起主要作用的好氧菌从EM菌中分离出来制成DFB，不含酵母菌的EM菌不通气培养制成DFA，DFA和DFB分别培养至高菌体浓度后复配培养制成除臭用EM菌，稀释后喷洒或倾倒至待处理样品中。
本发明的有益效果是：（1）菌体浓度高；在培养的前48h内无酵母菌和其他菌株间营养的竞争以及代谢产物（乙醇、乙酸和乳酸等）所导致的相互之间的抑制作用，并为生长需求不同的菌种提供了不同的培养条件，使菌体生长旺盛，成品中活菌总数可达109数量级以上。（2）生产周期短，72小时即可完成发酵。（3）提高了对除臭有显著效果的酵母和霉菌的比例，经检测，本产品菌液中酵母类真菌占总微生物比例为市售EM菌液中的10倍以上，增强了EM菌的除臭效果。
具体实施方式
实施例一：液体菌种制备与发酵。
步骤一、DFA的制备：
1、取EM菌液500mL，分装至25支无菌试管中，密封于4℃下静置30天后的取上层液体按1%分别接种至无菌的糖蜜培养基中，按90%装液量装入锥形瓶中，每组2个平行样，密闭发酵，37℃振荡培养7天后显微镜检，得到无酵母的样品按相同体积比混合后作为组分一。
2、取EM菌液按1%接种量接种至高温灭菌的LB培养基中，按90%装液量装入锥形瓶中，每组10个平行样，密闭发酵，37℃振荡培养7天后传代，重复上述操作至第三次传代得到2个镜检无酵母菌样品混合作为组份二。
3、利用LB固体培养基与PDA培养基分离纯化EM中菌种，得到15株细菌、2株放线菌、8株霉菌、1株酵母菌，除酵母菌与霉菌外，分别在LB液体培养基中培养48h后按0.5%（V/V）接种至无菌的糖蜜培养基中，按90%装液量装入锥形瓶中，密闭发酵，自然协调菌种比例，37℃振荡培养7天作为组分三。
以上所得的三种无酵母发酵液均按3%接种量混合接种至无菌的糖蜜培养基中，按90%装液量装入锥形瓶中，密闭发酵，37℃，100rpm振荡培养7天得DFA。
步骤二、DFB的制备：取EM菌液4℃下静置30天后的菌泥，按1%接种量接种至无菌的糖蜜培养基中，按25%装液量装入锥形瓶中，30℃，200rpm振荡培养3天得DFB。
步骤三、取DFA按2%接种量接种至无菌的糖蜜培养基中，按70%装液量装入发酵罐，密闭发酵，每隔24h搅拌30min，37℃培养48h，经检测，活菌总数达1.53×109cfu/ml。取DFB按2%接种量接种至无菌的糖蜜培养基中，30℃通气搅拌培养48h，经检测，酵母菌浓度达9.30×108cfu/ml，总活菌数达1.78×109cfu/ml。发酵后的DFA和DFB按9:1混合后装入空消后的发酵罐，装液量70%，30℃密闭发酵，每隔6小时搅拌10分钟，培养24h后得除臭用高密度EM菌液，经检测，活菌总数达3.73×109cfu/ml，其中酵母菌总数为1.65×109cfu/ml。
实施例二：固体菌种制备与发酵。
DFA冻干粉剂的制备与培养：DFA新鲜菌液与无菌保护液按1:1（V/V）混合后于-80℃预冻4h，预冻后的样品于-80℃真空冷冻干燥48h，检测其含水量为3.74%，菌体存活率为87.5%。取保存6个月的冻干菌粉按1%量接种至无菌的糖蜜培养基，按90%装液量装入500mL锥形瓶，37℃，150rpm振荡培养1天后按10%接种量接种至50L发酵罐中，接种后装液量约为35L，培养基为糖蜜培养基，每隔24h搅拌30min，37℃培养48h，经检测，活菌总数达1.27×109cfu/ml。
DFB冻干粉剂的制备与培养：DFB新鲜菌液与无菌保护液按1:1（V/V）混合后于-80℃预冻4h，预冻后的样品于-80℃真空冷冻干燥48h，检测其含水量为3.37%，菌体存活率为84.3%。取保存6个月的冻干菌粉按1%量接种至无菌的糖蜜培养基，容器为500mL锥形瓶，25%装液量，30℃，200rpm振荡培养1天后按10%接种量接种至5L发酵罐中，接种后装液量约为3.5L，培养基为糖蜜培养基，30℃下，300rpm通气搅拌培养，通气比1:1，培养48h，经检测，活菌总数达1.96×109cfu/ml，其中酵母菌总数1.22×109cfu/ml。
从DFA发酵罐内放料3.5L，将3.5L DFB导入DFA发酵罐内，30℃密闭发酵，每隔6小时搅拌10分钟，培养24h后得除臭用高密度EM菌液，经检测，活菌总数达4.65×109cfu/ml，其中酵母菌总数为1.95×109cfu/ml。
实施例三：固体垃圾除臭实验。
从生活区垃圾场采集垃圾100 kg，其组成包括废纸、塑料制品、动物内脏、食物残渣等，搅拌混匀后均匀分为5份，每份20kg，分别装入5个100kg塑料桶中，桶盖上留有8cm2气窗，分别编号1-5。
处理方法：
1号；取除臭用EM菌液，离心、过滤除菌后取20g滤液加入30℃温水180g，混匀静置1h后均匀喷洒至垃圾表面，盖上桶盖。
2号；取除臭用EM菌液20g加入30℃温水180g，混匀静置1h后均匀喷洒至垃圾表面，盖上桶盖。
3号；取除臭用EM菌液，离心、过滤除菌后取200g滤液加入30℃温水1800g，混匀静置1h后均匀喷洒至垃圾表面，盖上桶盖。
4号；取除臭用EM菌液200g加入30℃温水1800g，混匀静置1h后均匀喷洒至垃圾表面，盖上桶盖。
5号；不作处理，直接盖上桶盖。
将5个桶置于室外，3d后取气体样品检测其中硫化氢和氨（GB/T 14678-93，GB/T14679-93）。采气时用硅胶管伸入桶中部采集气体。实验过程中无下雨，温度16-28℃，无阳光直射，检测结果如表1所示。
表1 除臭实验检测结果
实验组 氨(mg/m3) 硫化氢(mg/m3)
1 4.78 2.48
2 1.14 0.24
3 5.26 2.71
4 0.44 0.11
5 4.65 2.53
结果分析：除臭用EM菌液表现出良好的除臭效果，显著的降低了实验桶中的氨和硫化氢这两种主要的臭味形成气体，且氨和硫化氢的去除率随用量的升高而增加，通过2和1，4和3的对照可以看出，菌液的除臭作用依赖于其中的微生物。3中氨和硫化氢均高于1和5可能系菌液中残留的培养基促进了垃圾中产臭微生物的生长，同时3喷洒的水量较大，有助于产臭微生物的繁殖。

Claims (10)

1.一种除臭用EM菌液制备方法，其特征在于：将常规的EM菌种分为DFA和DFB两个部分，分别在糖蜜培养基中培养48小时；其中：DFA培养温度为37℃，不通气培养；DFB培养温度为30℃，通气培养；培养后DFA和DFB按9:1的体积比混合，随后，30℃密闭发酵，培养24h，即得除臭用EM菌液。
2.如权利要求1所述的一种除臭用EM菌液制备方法，其特征在于：DFA为不含酵母菌，以细菌和放线菌为主要成分的复合菌种；DFB为以酵母菌和丝状真菌为主要成分的复合菌种。
3.如权利要求1所述的一种除臭用EM菌液制备方法，其特征在于：常规的EM菌液为市售EM菌液。
4.如权利要求1所述的一种除臭用EM菌液制备方法，其特征在于：所述DFA的制备包括以下步骤：
取常规EM菌液4℃下静置30天后的上层液体按1%接种至无菌的糖蜜培养基中，按90%装液量装入锥形瓶中，密闭发酵，37℃振荡培养7天后显微镜检，取无酵母的样品作DFA组分一；
取常规EM菌液按1%接种量接种至高温灭菌的LB培养基中，按90%装液量装入锥形瓶中，密闭发酵，37℃振荡培养7天后传代，重复上述操作，取显微镜检无酵母菌的样品作组分二；
利用LB固体培养基与PDA培养基分离常规EM中菌种，除酵母菌外，分别培养分离得到的菌株后按相同比例接种至无菌的糖蜜培养基中，按90%装液量装入锥形瓶中，密闭发酵，自然协调菌种比例，37℃振荡培养7天作为组分三；
以上所得的三种组分无酵母发酵液均按3%接种量混合接种至高温灭菌的糖蜜培养基中，按90%装液量装入锥形瓶中，密闭发酵，37℃振荡培养3天即得新鲜DFA，新鲜DFA与无菌保护液等体积混合后-80℃真空冷冻干燥24h制成菌粉。
5.如权利要求4所述的一种除臭用EM菌液制备方法，其特征在于：LB培养基，按质量百分比计，含胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，Nacl 1%,培养基pH控制在7.4。
6.如权利要求4所述的一种除臭用EM菌液制备方法，其特征在于：LB固体培养基，按质量百分比计，含胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，Nacl 1%,琼脂1.0%~1.5%，培养基pH控制在7.4；PDA培养基，按质量百分比计，含马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂1.5%~2.0%，自然pH。
7.如权利要求1所述的一种除臭用EM菌液制备方法，其特征在于：所述DFB的制备：取常规EM菌液4℃下静置30天后的菌泥，按1%接种量接种至无菌的糖蜜培养基中，按25%装液量装入锥形瓶中，通氧发酵，30℃振荡培养3天即得新鲜DFB，新鲜DFB与无菌保护液等体积混合后-80℃真空冷冻干燥24h制成菌粉。
8.如权利要求4或7所述的一种除臭用EM菌液制备方法，其特征在于：糖蜜培养基，按质量百分比计，含糖蜜 8%，蛋白胨 2%，K2HPO4 0.6%，CaCO3 3%，自然pH。
9.如权利要求1所述的一种除臭用EM菌液制备方法，其特征在于：新鲜DFA菌液按2%量直接接种至无菌的糖蜜培养基中，冻干菌粉需经种子培养，种子培养采用糖蜜培养基，90%装液量，1%接种量，37℃密闭振荡培养，24h后按10%量接种至无菌的糖蜜培养基中，发酵罐装液量为70%，密闭发酵，每隔24小时搅拌10分钟，搅拌时打开放气阀放出气体，37℃培养48小时；新鲜DFB菌液按2%量直接接种至无菌的糖蜜培养基中，冻干菌粉需经种子培养，种子培养采用糖蜜培养基，25%装液量，1%接种量，30℃通气振荡培养，24h后按10%量接种至无菌的糖蜜培养基中，30℃通气搅拌/振荡培养48小时；发酵后的DFA和DFB按9:1体积比混合后按70%装液量装入发酵罐或无菌密闭容器，30℃密闭发酵，每隔6小时搅拌10分钟，搅拌时打开放气阀放出气体，培养24h，即得除臭用EM菌液。
10.如权利要求4或7或9所述的一种除臭用EM菌液制备方法，其特征在于：无菌保护液，按质量百分比计，含蔗糖 100g/L、脱脂奶粉100g/L。
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