CN112375720A - 一种枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其应用，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的分类命名为枯草芽孢杆菌WS1811，保藏编号为CCTCC NO：M 2020296，保藏日期为2020年07月09日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。本发明的枯草芽孢杆菌WS1811最初分离自河道淤泥，在生物污泥、农业废弃物超高温堆肥以及在水性聚氨酯材料降解方面都具有潜在应用价值。将本发明的枯草芽孢杆菌WS1811单独用于高温堆肥，可以使待发酵物料快速升温至90℃左右，最高可达100℃以上，且能持续保持在较高温度下进行发酵，发酵速度快，能有效缩短发酵时间，还能有效杀灭病原菌、寄生虫卵、杂草种子等。将枯草芽孢杆菌WS1811用于降解水性聚氨酯，降解速度快、效果好。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体是一种枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

在农业生产、畜禽养殖和某些工业生产中每年都会产生大量的有机物废弃物，如若不能对这些有机废弃物进行合理处理会产生严重污染和资源浪费；如果将这些有机废弃物进行快速降解和充分腐熟，则可以产生大量优良的有机肥产品，从而降低化肥使用量，提高土壤活力，改良土壤。因此，提升有机肥生产技术，发展产业化和商品化的精制有机肥、有机无机复合肥成为有效解决有机废弃物污染的保障。但传统的堆肥方式和技术已经不能适应于商品有机肥的发展，同时，现有的现代化堆肥技术，均需要高效堆肥菌种的辅助，进而提高发酵效率，降低生产成本，提高堆肥附加值。因此现在迫切需求一种能够将各种有机有机废弃物快速降解、充分腐熟的有效菌剂。

为加快有机物料的降解速度，提高堆肥的腐殖化程度，近年来国内外学者对堆肥过程中的微生物过程进行了一系列研究。由于堆肥是一系列由微生物活动主导的，兼具物理、化学、生物各种变化的复杂过程，而微生物的活动则会影响堆肥的时间和堆肥产品质量，因此在堆肥过程中加入微生物菌剂来增加微生物数量、调节菌群结构，是一种促进堆肥快速腐熟的有效方法。但目前整个堆肥行业，仍存在部分堆肥菌种不稳定、堆肥效果促进效果不强等缺点，因此，开发更多的高温或耐高温菌种，利用工厂化实现堆肥，评估菌株的促进效果变得异常重要。

目前，应用于堆肥的芽孢杆菌主要为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等，但这些菌株均为中温菌，在促进堆肥进入高温期后，由于无法忍受高温的环境而失去菌体活性。如发明专利申请CN 105524858 A公开了一种腐熟有机废弃物的耐高温腐熟菌剂，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H1-7。所述H1-7菌剂，在55℃的环境中生长良好，55℃时的α-淀粉酶活可达62.1U/mL，蛋白酶活为673.2U/mL，纤维素酶活为6.75U/mL。通过堆肥初期接种耐高温H1-7菌剂，快速提高堆体温度，耐高温菌剂能在高温环境下能够维持较好的降解效果，具有更强的环境适应性，加速了堆肥化进程。发明专利CN 110066746 B提供了一株加速堆肥腐熟的耐高温芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8及其应用。所述的芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8的保藏编号为CGMCCNo.16737，所述的菌株的应用为其加速堆肥发酵。步骤如下：将畜禽粪污与辅料按照一定C/N混匀后接种液体菌种，砌成条垛后，采用条垛式发酵工艺，翻抛发酵。相比于对照不添加菌种，菌种的添加有效促进了堆肥初期堆体温度的升高，促使堆体提前进入降温期，促进堆肥产品发芽指数的提高和促使堆体C/N提前降至腐熟范围。发明专利CN107254420 B公开了一种微生物菌剂，其活性成分为保藏编号CGMCC No.13758的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zzl-002，所述菌剂由孢子含量≥1000亿/克的所述枯草芽孢杆菌zzl-002、孢子含量≥200亿/克的植物乳杆菌、孢子含量≥100亿/克的绿色木霉、孢子含量≥100亿/克的黑曲霉和孢子含量≥200亿/克的酿酒酵母组成的复合微生物腐熟菌剂可以缩短发酵时间，腐熟的有机肥可以提高肥力，减少病虫害。发明专利CN 109097311 A明公开了一株耐高温纤维素降解芽孢杆菌 ，该菌株命名为枯草芽孢杆菌 SM-5-1(BacillusSubtilis SM-5-1)，本发明的耐高温纤维素降解芽孢杆菌不仅对纤维素具备较好的降解能力，且产物不会对环境造成污染，由于其来源于猪粪，作为猪粪土著菌株，能减少与土著菌的抑制作用，对于猪粪的堆肥和发酵床均具备较高的降解能力，同时具备高温耐受性，可在60℃高温下生长繁殖，可制成嗜热发酵床添加菌剂，在猪粪的发酵床领域具备应用前景。发明专利CN 106754511 B公开了一种保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌及其应用。所述枯草芽孢杆菌在微好氧环境中具有较强产酶能力，脂肪酶的活性较强。所述枯草芽孢杆菌在有机肥发酵上能降低氨气的挥发，保护肥效的作用；在养殖场除臭抑菌应用上，可减少大肠菌群的数量，强烈抑制环境中的有害微生物，调整环境生态平衡，有益养殖环境健康。在畜禽尸体无害化处理应用中，可有效分解油脂，减少臭气的排放。在生物发酵床应用上，可做到使得猪粪分解更为彻底，散发的氨气等有害气体减少。发明专利CN 106350469 B公开了一种耐高温的纤维素降解的芽孢杆菌及其应用，具体为芽孢杆菌JWT-1，该细菌对秸秆中纤维素、半纤维素、果胶和木质素具有较强的降解能力；并可在60℃的高温下生长繁殖，最高可耐受100℃的高温，具有良好的高温堆肥应用前景。以上专利中提到的枯草芽孢杆菌虽然都指出其具有加快升温与发酵、耐高温的特性，但是其正常繁殖的温度一般也都是50-60℃，没有达到很高的发酵温度或者当发酵温度超过70℃以上时繁殖速度变慢，发酵有机物的速率也降低，因此，寻找能在更高温度下具有发酵活性的枯草芽孢杆菌菌株仍是有机肥发展的一个研究方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌及其在有机肥发酵或者塑料降解中的应用。将本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WS1811单独用于超高温堆肥，可以使待发酵物料快速升温至90℃左右，最高可达100℃以上，且能持续保持在较高温度下进行发酵，发酵速度快，能有效缩短发酵时间，还能有效杀灭病原菌、寄生虫卵、杂草种子等。将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WS1811用于降解水性聚氨酯，降解速度快、效果好。

本发明的技术方案如下：

一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），分类命名为枯草芽孢杆菌WS1811，保藏编号为CCTCC NO：M 2020296，保藏日期为2020年07月09日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

枯草芽孢杆菌WS1811在显微镜下看到呈杆状，为革兰氏阳性菌，菌落特征：不透明、污白、边缘不整齐、表面粗糙、有褶皱，牛肉膏蛋白胨液体培养静止时有菌膜形成。

所述枯草芽孢杆菌WS1811最初分离自河道淤泥，具体分离步骤如下：

将采集到的河道淤泥按1：9的质量比加入到无菌水中，经震荡悬浮后，于沸水浴中处理15min，根据梯度稀释法逐级稀释样品，然后取悬液涂布于含有牛肉膏蛋白胨的培养平板上，每个浓度2-4个重复，在60℃下培养2天后，在平板上挑取菌落采用划线法将菌株接种至含有CMC-Na的平板培养基中分离培养，培养36h后通过刚果红染色法，选取透明圈直径与菌落直径比大的为目标菌株，即得。

所述枯草芽孢杆菌WS1811可以单独或与其它高温菌一起用于生物污泥、农业废弃物的超高温堆肥；还可以单独或与其它高温菌一起用于降解水性聚氨酯材料。

所述生物污泥包括造纸污泥、污水处理厂产生的污泥、垃圾处理厂产生的污泥、下水道沉降的污泥等中一种以上。

所述农业废弃物包括禽畜粪便、植物秸秆/落叶、果蔬废弃物、植物提取残渣、竹笋/菌菇下脚料、菌菇种植后残余物等中一种以上。

枯草芽孢杆菌WS1811用于超高温堆肥的具体步骤如下：

（1）将枯草芽孢杆菌WS1811接种至发酵培养基中培养20-30h作为发酵菌剂；接种量优选6-16%。

（2）将待发酵的原料经过粉碎后，加入适量锯末或秸秆粉调节碳氮比为15-25:1、含水率为50-60%。

（3）将步骤（1）得到的发酵菌剂按总物料湿重的0.05-0.15%加入到步骤（2）的混合物料中混合均匀，然后送至发酵槽内进行发酵15-30天即可。得到的有机肥可用于土壤改良、园林绿化种植、农作物种植或者干燥后打包外售。

所述发酵培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

使用供氧效果较好的发酵槽进行发酵。例如，在发酵槽内底部设有曝气系统，在发酵过程中通过发酵槽底部的曝气系统采取强制通风方式供给氧气，每天通风1-3次。或者在发酵槽内安装翻抛装置，通过缓慢翻抛增加堆内氧气的供给，并推动物料由进料端向出料端移动，实现连续发酵。

在实验室采用枯草芽孢杆菌WS1811对水性聚氨酯材料进行降解试验步骤是制备含水性聚氨酯的LB培养基，然后将枯草芽孢杆菌WS1811接种至培养基中，置于35-39℃条件下培养即可。

本发明的有益效果是：

本发明分离筛选出了一种能快速升温且具备高温耐受性，在90℃高温下仍然具有非常高的发酵活性的枯草芽孢杆菌WS1811，将该枯草芽孢杆菌WS1811单独用于高温堆肥，可以使待发酵物料快速升温至90℃左右，最高可达100℃以上，且能持续保持在较高温度下进行发酵分解废弃物中的有机物，发酵速度快，能有效缩短发酵时间，保持高温发酵还能有效杀灭病原菌、寄生虫卵、杂草种子等。枯草芽孢杆菌WS1811还可以用于降解水性聚氨酯，降解速度快、效果好，为水性聚氨酯的降解提供了新的途径。由于水性聚氨酯是以水为溶剂的新型聚氨酯材料，具有无污染、安全可靠、机械性能优良、相容性好、易于改性等优点，因此，水性聚氨酯的用途非常的广泛，用量也非常大，同时产生的废弃物也非常多；将枯草芽孢杆菌WS1811用于水性聚氨酯废弃产品或含水性聚氨酯的有机物废弃物的降解都是具有极大的潜力的。

附图说明

图1是枯草芽孢杆菌WS1811在NA平板上的菌落形态；

图2是枯草芽孢杆菌WS1811革兰氏染色结果，颜色为紫色；

图3是枯草芽孢杆菌WS1811的16s DNA扩增结果；左侧泳道为MarkerⅢ DNA Ladder；右侧泳道为目标DNA分子；

图4是枯草芽孢杆菌WS1811的系统发育树；

图5是枯草芽孢杆菌WS1811对污水处理厂污泥超高温堆肥的温度曲线；

图6是枯草芽孢杆菌WS1811对污水处理厂污泥超高温堆肥的展示图；

图7是枯草芽孢杆菌WS1811对鸡粪进行超高温堆肥的翻堆展示图；

图8是枯草芽孢杆菌WS1811对鸡粪进行超高温堆肥的温度展示图；

图9是枯草芽孢杆菌WS1811对鸡粪进行超高温堆肥的展示图，左边是堆肥后期的鸡粪，右边是发酵前期的鸡粪；

图10是枯草芽孢杆菌WS1811用于降解水性聚氨酯材料的对比图。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1

1、枯草芽孢杆菌WS1811的分离及定性分析：

（1）菌株分离

将采集到的河道淤泥样品10g加入到装有90mL无菌水的250mL锥形瓶中，经震荡悬浮后，于沸水浴中处理15min，根据梯度稀释法逐级稀释样品（如按1/10、1/100、1/1000、1/10000倍的梯度稀释），然后取0.1mL悬液涂布于含有牛肉膏蛋白胨的培养平板上，每个浓度3个重复，在60℃下培养2天后，在平板上挑取菌落采用划线法将菌株接种至含有CMC-Na的平板培养基中分离培养，培养36h后通过刚果红染色法，选取透明圈直径与菌落直径比大的为目标菌株，得到菌株并命名为WS1811。

（2）菌株形态观察

将菌株WS1811分别在牛肉膏蛋白胨液体培养基和固体培养基中培养，用接种环挑取少量菌液涂片，染色，在光学显微镜下观察细胞形态特征和平板上的菌落特征，结果如表1、图1和图2所示。另外菌株的生理生化鉴定特征如表2所示。

（3）菌株分子生物学鉴定

提取菌株WS1811的DNA，并采用细菌通用引物扩增法对16s rDNA进行扩增，扩增结束后，取5μL做琼脂糖凝胶电泳。电泳完毕后，用凝胶成像分析系统对结果进行观察，如图3所示。并将扩增产物进行序列测定，碱基序列见序列表。对测序结果进行BLAST同源性比对分析，寻找与目的基因序列同源性最高的已知菌种，然后构建系统发育树，如图4所示。最终确定菌株WS1811为一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

实施例2

采用枯草芽孢杆菌WS1811对污水处理厂产生的污泥进行超高温堆肥，具体步骤如下：

（1）将枯草芽孢杆菌WS1811按10%的接种量接种至牛肉膏蛋白胨培养基中培养24h作为发酵菌剂。

（2）将待发酵的原料经过粉碎后加入10%的玉米芯粉末调节碳氮比为20:1、含水率为55%。

（3）将步骤（1）得到的发酵菌剂按总物料湿重的0.1%加入到步骤（2）的混合物料中混合均匀，然后送至第一发酵槽内进行发酵7天，通过发酵槽底部的曝气系统采取强制通风方式供给氧气，每天通风2次，第五天早上进行倒槽翻堆一次，第八天早上移送至另一发酵槽进行堆肥继续腐熟，留下1-5‰的发酵物料在发酵槽内，然后进新的待发酵混合物料，将新旧物料混匀继续发酵。移送至另一发酵槽的物料，每隔1天翻堆一次，继续腐熟15天后即可。

本发明的枯草芽孢杆菌WS1811已经于2018年7月1日开始在河南省周口某县被用于对某污水处理厂的污泥进行超高温堆肥处理，处理过程按照实施例2的步骤进行，于7月1日早上8:00开始往第一发酵槽进料，9:00开始在第一发酵槽选取3个不同位置测量物料温度，每隔一定时间测量一次物料的温度（7月1日当天在9、11、17时整各测量一次，7月2日-7月7日白天每天测量5次，每次间隔2-4小时），7月5日早上8:00对物料进行倒槽一次，7月8日早上8:00将第一发酵槽内的物料移送至另一发酵槽继续腐熟，在第一发酵槽内发酵的温度曲线图见图5。可见，在第一发酵槽内，枯草芽孢杆菌WS1811能快速促进污泥升温，8个小时内即可使堆肥污泥平均温度达到60℃以上，22小时内，即可让堆肥污泥的温度升高至90℃以上并长时间保持在90℃左右进行发酵；第四天可能由于供氧不足，发酵温度有所下降，但第五天早上进行倒槽翻堆后，堆肥污泥的温度又能快速升高至80℃以上，并且还能达到90℃以上，且在3天内保持温度在90℃左右。试验说明，本发明的枯草芽孢杆菌WS1811在供氧充足的条件下具有非常高的发酵活性，在90℃以上仍能保持较高的生物活性，如若能选用供氧条件更好的发酵槽进行发酵，保证枯草芽孢杆菌WS1811在氧气充足的条件下进行发酵，将能获得更好的发酵效果。物料在发酵槽进行堆肥继续腐熟的照片如图6所示。

实施例3

采用枯草芽孢杆菌WS1811对菜市场产生的果蔬废弃物（包括果皮、辣椒梗、青菜老叶或芹菜杆等废弃物）进行超高温堆肥，具体步骤如下：

（1）将枯草芽孢杆菌WS1811按10%的接种量接种至牛肉膏蛋白胨培养基中培养24h作为发酵菌剂。

（2）将待发酵的原料经过粉碎后，加入10%的锯末调节碳氮比为20:1、含水率为55%。

（3）将步骤（1）得到的发酵菌剂按总物料湿重的0.1%加入到步骤（2）的混合物料中混合均匀，然后送至发酵槽内进行发酵20天即可。在发酵槽内安装翻抛装置，通过缓慢翻抛增加堆内氧气的供给，并推动物料由进料端向出料端移动，实现连续发酵。

实施例4

采用枯草芽孢杆菌WS1811对鸡粪进行超高温堆肥，具体步骤如下：

（1）将枯草芽孢杆菌WS1811按10%的接种量接种至牛肉膏蛋白胨培养基中培养24h作为发酵菌剂。

（2）将待发酵的原料经过粉碎后，加入10%的玉米芯粉末调节碳氮比为20:1、含水率为55%。

（3）将步骤（1）得到的发酵菌剂按总物料湿重的0.1%加入到步骤（2）的混合物料中混合均匀，然后送至发酵槽内进行发酵25天即可。在发酵槽内安装翻抛装置，通过缓慢翻抛增加堆内氧气的供给，并推动物料由进料端向出料端移动，实现连续发酵。

本发明的枯草芽孢杆菌WS1811已经在重庆某种鸡养殖废物处理场被应用于处理鸡粪，处理过程按照实施例4的步骤进行，发酵过程的展示图见图7-9，可见，采用本发明的枯草芽孢杆菌WS1811发酵鸡粪，发酵温度高于100℃。

实施例5

在实验室采用枯草芽孢杆菌WS1811对水性聚氨酯材料进行降解试验，具体步骤如下：

（1）制备含水性聚氨酯的 LB培养基：取蛋白胨10.0g，酵母提取液5.0g，NaCl 10.0g，加入蒸馏水1000mL，调节pH至7.0，搅拌均匀，高压灭菌后，加入水性聚氨酯8g混合均匀，将其分装于各个试管中。

（2）将枯草芽孢杆菌WS1811按10%的接种量接种至以上装有LB培养基的试管中，并设置空白对照（不接种枯草芽孢杆菌WS1811），置于37℃条件下培养10天，观察试管内溶液变化，培养期结束后，对照组溶液为乳浊液，如图10左边试管所示，接种枯草芽孢杆菌WS1811组发酵液颜色变得较为清亮，如图10右边试管所示。从实验室的试验结果可以看出，枯草芽孢杆菌WS1811是具有降解水性聚氨酯材料的潜力的，可望用于降解含水性聚氨酯的废弃物。

序列表

<110> 洛阳师范学院

<120> 一种枯草芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1403

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌WS1811(Bacillus subtilis)

<400> 1

tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60

acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120

atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180

ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtag 240

ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300

ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360

gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtac cgttcgaata 420

gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540

tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600

aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660

tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720

gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780

agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840

gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900

catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960

tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020

gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080

ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140

tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200

caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260

gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320

cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380

cccgaagtcg gtgaggtaac ctt 1403

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的分类命名为枯草芽孢杆菌WS1811，保藏编号为CCTCC NO：M 2020296，保藏日期为2020年07月09日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌WS1811在生物污泥、农业废弃物超高温堆肥中应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述生物污泥包括造纸污泥、污水处理厂产生的污泥、垃圾处理厂产生的污泥或下水道沉降的污泥中一种以上。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述农业废弃物包括禽畜粪便、植物秸秆/落叶、果蔬废弃物、植物提取残渣、竹笋/菌菇下脚料或菌菇种植后残余培养基中一种以上。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌WS1811用于超高温堆肥的具体步骤如下：

（1）将枯草芽孢杆菌WS1811接种至发酵培养基中培养20-30h作为发酵菌剂；

（2）将待发酵的原料经过粉碎后，加入适量锯末或秸秆粉调节碳氮比为15-25:1、含水率为50-60%；

（3）将步骤（1）得到的发酵菌剂按总物料湿重的0.05-0.15%加入到步骤（2）的混合物料中混合均匀，然后送至发酵槽内进行发酵15-30天即可。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在发酵槽底部设有曝气系统，在发酵过程中通过发酵槽底部的曝气系统采取强制通风方式供给氧气，每天通风1-3次。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在发酵槽内安装翻抛装置，通过缓慢翻抛增加堆内氧气的供给，并推动物料由进料端向出料端移动，实现连续发酵。

9.权利要求1所述枯草芽孢杆菌WS1811在水性聚氨酯材料降解中应用。

Images