CN109652329A - 一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的制备及应用，制备方法，它包括以下步骤：步骤一，功能微生物的培养；步骤二，功能微生物的发酵；步骤三，菌株孢子液的制备；步骤四，微生物菌剂制备。应用在具有防病、促生长功能的固体微生物肥料中和应用在具有耐高温、耐纤维素、高效降解能力的固体有机物料腐熟剂中。具有促进植物生长，活化土壤磷、钾养分的功能，成本低、运输方便、贮存方便，可有效降低化肥、农药施用量。

Description

一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的制备及应用
技术领域
本发明涉及微生物肥料领域，尤其涉及一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的制备及应用。
背景技术
我国土壤由于长期依靠化学肥料，导致土壤板结、土壤酸化、盐渍化等问题越来越突出，并直接导致了土壤贫瘠、地力衰竭等土壤问题，严重影响可持续农业的发展。农用微生物菌剂作为微生物肥料类别之一，在作物生长、防治病虫害及活化土壤养分、改良土壤等方面都发挥着举足轻重的作用。随着微生物菌剂的大量施用，大量的研究已经表明：微生物菌剂可有效减少化学肥料及农药的使用，对于绿色、生态、可持续农业的发展功不可没。
我国每年产生的农业废弃物约为8.7亿吨，有机废弃物资源化利用势在必行，如何对这些原料进行加工利用，才是提高肥料生产率和使用效果的关键。随着工业化的发展，利用有机废弃物生产有机肥正如火如荼地展开，其中不乏弄虚作假行为，且有愈演愈烈之势。开发高效有机物料腐熟剂实现有机废弃物规模化生产有机肥及规范有机肥行业乱象刻不容缓。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的制备及应用。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现。
一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，功能微生物的培养，芽孢杆菌培养基配方按重量份数如下：黄豆粉10-16份、蔗糖7-13份、蛋白胨1-5份、玉米粉2-8份、碳酸钙3-9份、鱼粉3-7份、氯化钙0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.2-0.7 份、磷酸氢二钾0.2-0.8份、硫酸锰0.1-0.5份、氢氧化钠0.1-0.5 份、氯化钠2-7份、消泡剂1-2份，接种量(体积百分比)为0.5％-1.5％，在35-39℃的好氧条件下培养1-3天；
所述消泡剂为有机硅消泡剂；
步骤二，功能微生物的发酵，发酵包括灭菌、接种、发酵；
所述灭菌的过程中，先对发酵罐进行空消，然后加入培养基后进行实消，空消条件为：压力0.15MPa，温度123℃，时间1h；实消条件为：压力0.15MPa，温度123℃，时间35min；
所述接种的过程为：待灭菌完成，培养液温度下降至37℃时，进行取样，利用划线培养和显微镜镜检，无活菌生长，灭菌完成，然后开始接种，接种比例(体积比)为菌种/培养液1:120；
所述接种开始8h后，进行取样，利用划线培养和显微镜镜检，检测发酵有无污染；
所述发酵过程需要控制转速、通气量、发酵温度、发酵时间；所述转速在发酵前6h为80r/min,此后每隔2h转速升高10r，达到 120r/min后保持该转速至发酵结束；所述通气量为：种子罐发酵前 8h保持通风量10m3/h,后每隔1h增加通风量1m3/h，至通风量达到15m3/h时保持发酵至结束，整个过程保持罐压在0.06Mpa；发酵罐前8h保持通风量30m3/h,后每隔1h增加通风量5m3/h，至通风量达到 50m3/h时保持发酵至结束，整个过程保持罐压在0.06Mpa；
所述发酵进行24h后，进行取样，利用划线培养和显微镜镜检，检测发酵是否污染和芽孢率，此后每6h进行一次取样检测，直到芽孢率达到95％以上，完成发酵；
所述发酵完成后，采用方法为稀释涂板法取样检测发酵液菌量，菌量大于2.0×109cfu/ml；
所述发酵温度为36.5℃—37.5℃；
步骤三，菌株孢子液的制备，将步骤二中发酵检测合格的发酵液采用高速蝶式离心机离心，转速为7000r/min，收集离心沉淀液，并检测其芽孢量，芽孢量≥2.0×1010cfu/ml时，取离心沉淀液备用；
步骤四，微生物菌剂制备，取步骤三中离心沉淀液并添加吸附载体，离心沉淀液与吸附载体的质量比为1:3，混合均匀，通过塔形连续式真空干燥设备干燥后，干燥温度为30-45℃，含水率为10％-20％，冷却包装即得。
方案二，所述功能微生物包含的芽孢杆菌属为胶质芽孢杆菌 (Bacillusmucilaginosus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtillis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)中的任意两种或三种按等体积或等质量复合；
所述胶质芽孢杆菌的保藏登记号我CGMCC No.15845；
所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15847；
所述解淀粉芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15848；
所述吸附载体包括质量份的有机吸附载体70-80份和矿物吸附载体20-30份；所述有机吸附载体为草炭、米糠、海藻粉、生物质炭粉中的一种或多；所述矿物吸附载体为凹凸棒粉、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺中的一种或多种；
所述草炭、细米糠、生物质炭粉过80目筛；所述海藻粉过100 目筛；所述凹凸棒、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺过120目筛。
方案一，所述功能微生物包含的芽孢杆菌属为枯草芽孢杆菌 (BacillusSubtillis)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus Donk)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)，所述枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌按等体积或等质量复合；
所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15844；
所述胶质芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15845；
所述嗜热脂肪芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15852；
所述胶冻样芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15853；
所述吸附载体包括质量份的草炭、海藻粉、生物质炭粉中的一种或多种35-40份，米糠40-45份，凹凸棒、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺中的一种或多种15-25份；
所述草炭、海藻粉、生物质炭粉过80目筛；所述米糠过60目筛；所述凹凸棒、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺过120目筛。
一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂，按照方案一的制备方法制备得到。
一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂，按照方案二制备方法制备得到。
按照方案一制备的一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的应用，应用在具有防病、促生长功能的固体微生物肥料中。
按照方案二制备的的一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的应用，应用在具有耐高温、耐纤维素、高效降解能力的固体有机物料腐熟剂中。
本发明的有益技术效果：
1.提高生产效率，保证肥料品质；其次通过提供一种固体有机物料腐熟剂的制备方法，从而达到缩短有机物料腐熟周期、提高生产效率、节约生产成本的目的。
2.结合细菌中芽孢杆菌属能产生芽孢的特性，耐热、耐盐碱及抵抗各种不利环境，以及特定芽孢杆菌具有固氮、溶磷、解钾、抑菌抗病、的独特生理功能开发针对不同产品需求的固体微生物菌剂。根据不同芽孢杆菌的功能能不同，将分别制备具有活化土壤养分的固体微生物菌剂、具有防治作物病虫害功能的固体微生物菌剂、具有降解腐熟有机物料功能的固体微生物菌剂，该系列产品的应用将对农业生产过程中化肥、农药的减量施用，生态环境的改善起决定性作用。
胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，保藏登记号CGMCC No.15845；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期： 2018年6月4日。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏登记号为CGMCC No.15847；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期： 2018年6月4日。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏登记号CGMCC No.15848；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2018年6月4日。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)保藏登记号为CGMCC No.15844；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期： 2018年6月4日。
嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)保藏登记号CGMCCNo.15852；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2018年6月4日。
胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，保藏登记号 CGMCC No.15853；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2018年6月4日。
附图说明
图1为固体有机物料腐熟剂对玉米秸秆温度的影响；
图2为液体有机物料腐熟剂对玉米秸秆温度的影响；
图3为固体有机物料腐熟剂对除虫菊渣堆肥温度的影响；
图4为液体有机物料腐熟剂对除虫菊渣堆肥温度的影响；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不局限于说明书上的内容。
一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，功能微生物的培养，芽孢杆菌培养基配方按重量份数如下：黄豆粉10-16份、蔗糖7-13份、蛋白胨1-5份、玉米粉2-8份、碳酸钙3-9份、鱼粉3-7份、氯化钙0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.2-0.7 份、磷酸氢二钾0.2-0.8份、硫酸锰0.1-0.5份、氢氧化钠0.1-0.5 份、氯化钠2-7份、消泡剂1-2份，接种量(菌种与培养液体积百分数)为0.5％-1.5％，35-39℃好氧条件下培养1-3天；
所述消泡剂为SXP-101型有机硅消泡剂；
步骤二，功能微生物的发酵，发酵包括灭菌、接种、发酵；
所述灭菌过程中，先对发酵罐进行空消，然后加入培养基后进行实消，空消条件为：压力0.15MPa，温度123℃，时间1h；实消条件为：压力0.15MPa，温度123℃，时间35min；
所述接种过程为：待灭菌完成，培养液温度下降至37℃时，进行取样，利用划线培养和显微镜镜检，检测菌种的灭菌彻底程度，待培养基划线培养无活菌生长和镜检无活菌生长即说明灭菌彻底，然后开始接种，接种比例(体积比)为菌种/培养液1:120；
所述接种开始8h后，进行取样，利用划线培养和显微镜镜检，检测发酵是否污染；划线培养出的单菌落形态一致和镜检无杂菌即可。
所述发酵过程需要控制转速、通气量、发酵温度、发酵时间；所述转速在发酵前6h为80r/min,此后每隔2h转速升高10r，达到 120r/min后保持该转速至发酵结束；所述通气量为：种子罐发酵前 8h保持通风量10m3/h,后每隔1h增加通风量1m3/h，至通风量达到15m3/h时保持发酵至结束，整个过程保持罐压在0.06Mpa；发酵罐前 8h保持通风量30m3/h,后每隔1h增加通风量5m3/h，至通风量达到 50m3/h时保持发酵至结束，整个过程保持罐压在0.06Mpa；
所述发酵进行24h后，进行取样，利用划线培养和显微镜镜检，检测发酵是否污染和芽孢率，此后每6h进行一次取样检测，直到芽孢率达到95％以上，完成发酵；
所述发酵完成后，采用方法为稀释涂板法取样检测发酵液菌量；菌量达2.0×109cfu/ml以上即可。
所述发酵温度为36.5℃—37.5℃；
步骤三，菌株孢子液的制备，将步骤二中发酵检测合格的发酵液离心，采用高速蝶式离心机离心，转速为7000r/min,收集离心沉淀液，并检测其芽孢量，芽孢量≥2.0×1010cfu/ml时，取离心沉淀液备用；
步骤四，微生物菌剂制备，取步骤三中离心沉淀液并添加吸附载体，离心沉淀液与吸附载体的质量比为1:3，混合均匀，通过塔形连续式真空干燥设备干燥后，干燥温度为30-45℃，含水率为10％-20％，冷却包装即得。
具体实施例1
制备方法，步骤一中功能微生物的培养，芽孢杆菌培养基配方按重量份数如下：黄豆粉10份、蔗糖7份、蛋白胨1份、玉米粉2份、碳酸钙3份、鱼粉7份、氯化钙0.8份、磷酸二氢钾0.7份、磷酸氢二钾0.8份、硫酸锰0.5份、氢氧化钠0.5份、氯化钠7份、消泡剂 1份，接种量(菌种与培养液体积百分数)为0.5％，35℃好氧条件下培养3天；
所述微生物菌剂包含的芽孢杆菌属为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtillis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的任意两种或三种按等体积或等质量复合；
所述胶质芽孢杆菌的保藏登记号我CGMCC No.15845；
所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15847；
所述解淀粉芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15848；
所述吸附载体包括质量份的有机吸附载体70份和矿物吸附载体 30份；所述有机吸附载体为草炭、米糠、海藻粉、生物质炭粉中的一种或多；所述矿物吸附载体为凹凸棒粉、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺中的一种，或多种等质量复配；
其它条件按上述方案控制。
具体实施例2
制备方法，步骤一中功能微生物的培养，芽孢杆菌培养基配方按重量份数如下：黄豆粉16份、蔗糖13份、蛋白胨5份、玉米粉8份、碳酸钙9份、鱼粉3份、氯化钙0.2份、磷酸二氢钾0.2份、磷酸氢二钾0.2份、硫酸锰0.1份、氢氧化钠0.1份、氯化钠2份、消泡剂 2份，接种量(菌种与培养液体积百分数)为1.5％，39℃好氧条件下培养1天；
所述微生物菌剂包含的芽孢杆菌属为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtillis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的任意两种或三种按等体积或等质量复合；
所述胶质芽孢杆菌的保藏登记号我CGMCC No.15845；
所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15847；
所述解淀粉芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15848；
所述吸附载体包括质量份的有机吸附载体80份和矿物吸附载体 20份；所述有机吸附载体为草炭、米糠、海藻粉、生物质炭粉中的一种或多；所述矿物吸附载体为凹凸棒粉、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺中的一种或多种等质量复配；
其它条件按上述方案控制。
具体实施例3
制备方法，步骤一中功能微生物的培养，芽孢杆菌培养基配方按重量份数如下：黄豆粉13份、蔗糖10份、蛋白胨3份、玉米粉5份、碳酸钙6份、鱼粉5份、氯化钙0.5份、磷酸二氢钾0.4份、磷酸氢二钾0.5份、硫酸锰0.3份、氢氧化钠0.3份、氯化钠4份、消泡剂 1.5份，接种量(菌种与培养液体积百分数)为1.0％，37℃好氧条件下培养2天；
所述微生物菌剂包含的芽孢杆菌属为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtillis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的任意两种或三种按等体积或等质量复合；
所述胶质芽孢杆菌的保藏登记号我CGMCC No.15845；
所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15847；
所述解淀粉芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15848；
所述吸附载体包括质量份的有机吸附载体75份和矿物吸附载体 25份；所述有机吸附载体为草炭、米糠、海藻粉、生物质炭粉中的一种或多；所述矿物吸附载体为凹凸棒粉、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺中的一种或多种等质量复配；
其它条件按上述方案控制。
具体实施例4
制备方法，步骤一中功能微生物的培养，芽孢杆菌培养基配方按重量份数如下：黄豆粉10份、蔗糖7份、蛋白胨1份、玉米粉2份、碳酸钙3份、鱼粉7份、氯化钙0.8份、磷酸二氢钾0.7份、磷酸氢二钾0.8份、硫酸锰0.5份、氢氧化钠0.5份、氯化钠7份、消泡剂 1份，接种量(菌种与培养液体积百分数)为0.5％，35℃好氧条件下培养3天；
所述微生物菌剂包含的芽孢杆菌属为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtillis)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilusDonk)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)，所述枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌按等体积或等质量复合；
所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号我CGMCC No.15844；
所述胶质芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15845；
所述嗜热脂肪芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15852；
所述胶冻样芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15853；
所述吸附载体包括质量份的草炭、海藻粉、生物质炭粉中的一种或多种等质量复配、35份，米糠45份，凹凸棒、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺中的一种或多种等质量复配、15份；
其它条件按上述方案控制。
具体实施例5
制备方法，步骤一中功能微生物的培养，芽孢杆菌培养基配方按重量份数如下：黄豆粉16份、蔗糖13份、蛋白胨5份、玉米粉8份、碳酸钙9份、鱼粉3份、氯化钙0.2份、磷酸二氢钾0.2份、磷酸氢二钾0.2份、硫酸锰0.1份、氢氧化钠0.1份、氯化钠2份、消泡剂 2份，接种量(菌种与培养液体积百分数)为1.5％，39℃好氧条件下培养1天；
所述微生物菌剂包含的芽孢杆菌属为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtillis)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilusDonk)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)，所述枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌按等体积或等质量复合；
所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号我CGMCC No.15844；
所述胶质芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15845；
所述嗜热脂肪芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15852；
所述胶冻样芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15853；
所述吸附载体包括质量份的草炭、海藻粉、生物质炭粉中的一种或多种等质量复配40份，米糠40份，凹凸棒、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺中的一种或多种等质量复配25份；
其它条件按上述方案控制。
具体实施例6
制备方法，步骤一中功能微生物的培养，芽孢杆菌培养基配方按重量份数如下：黄豆粉13份、蔗糖10份、蛋白胨3份、玉米粉5份、碳酸钙6份、鱼粉5份、氯化钙0.5份、磷酸二氢钾0.4份、磷酸氢二钾0.5份、硫酸锰0.3份、氢氧化钠0.3份、氯化钠4份、消泡剂 1.5份，接种量(菌种与培养液体积百分数)为1.0％，37℃好氧条件下培养2天；
所述微生物菌剂包含的芽孢杆菌属为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtillis)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilusDonk)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)，所述枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌按等体积或等质量复合；
所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号我CGMCC No.15844；
所述胶质芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15845；
所述嗜热脂肪芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15852；
所述胶冻样芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15853；
所述吸附载体包括质量份的草炭、海藻粉、生物质炭粉中的一种或多种等质量复配38份，米糠42份，凹凸棒、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺中的一种或多种等质量复配20份；
其它条件按上述方案控制。
检测实施例1—不同配方固体功能菌剂的货架期检测
以凹凸棒为矿物吸附载体的固体功能菌剂的货架期检测结果如下：处理T1在0-60天内活菌量增加了185.48％,60-120天内活菌量增加57.14％,120-180天内减少了7.27％；处理T2在0-60天内活菌量增加了161.71％,60-120天内活菌量增加46.30％,120-180天内增加了6.33％；处理T3在0-60天内活菌量增加了192.60％,60-120天内活菌量增加32.97％,120-180天内增加了2.88％；处理T4在0-60天内活菌量增加了208.19％,60-120天内活菌量增加28.13％,120-180天内减少了4.88％。总体来看，各处理有效活菌量在前60天内几乎呈现指数增长，120天后保持不变直至稳定。
表1不同配方固体功能菌剂的货架期
检测实施例2—不同配方固体功能菌剂货架期检测
以蒙脱石为无机吸附剂的固体菌剂的货架期检测结果如下：处理 T1在0-60天内活菌量增加了104.25％,60-120天内活菌量增加 132.80％,120-180天内减少了4.47％；处理T2在0-60天内活菌量增加了127.06％,60-120天内活菌量增加91.09％,120-180天内降低了 22.58％；处理T3在0-60天内活菌量增加了102.53％,60-120天内活菌量增加82.03％,120-180天内增加了15.45％；处理T4在0-60天内活菌量增加了78.22％,60-120天内活菌量增加83.33％,120-180天内增加了13.13％。总体来看，各处理有效活菌数呈现先增加后保持不变直至稳定。
表2不同配方固体功能菌剂货架期
检测实施例3—不同配方固体有机物料腐熟剂货架期检测
以膨润土为无机吸附剂的固体菌剂的货架期检测结果表明：处理 T1在0-60天内活菌量增加了97.21％,60-120天内活菌量增加 70.08％,120-180天内减少了8.33％；处理T2在0-60天内活菌量增加了77.81％,60-120天内活菌量增加137.61％,120-180天内增加了 0.39％；处理T3在0-60天内活菌量增加了95.34％,60-120天内活菌量增加111.94％,120-180天内减少了13.38％；处理T4在0-60天内活菌量增加了126.73％,60-120天内活菌量增加89.40％,120-180天内减少了29.37％。总体来看，各处理菌量T2>T3>T4>T1,且处理T2一直处于增加状态，处理T1、T3、T4在120-180天呈下降趋势，但基本维持菌量不变。
表3不同配方固体有机物料腐熟剂货架期
检测实施例4—不同配方固体有机物料腐熟剂货架期检测
以凹凸棒为无机吸附剂的固体菌剂的货架期检测结果表明：处理 T1在0-60天内活菌量增加了80.15％,60-120天内活菌量增加 127.97％,120-180天内减少了11.52％；处理T2在0-60天内活菌量增加了89.15％,60-120天内活菌量增加109.84％,120-180天内减少了 16.02％；处理T3在0-60天内活菌量增加了116.13％,60-120天内活菌量增加93.28％,120-180天内减少了5.02％；处理T4在0-60天内活菌量增加了93.25％,60-120天内活菌量增加126.98％,120-180天内减少了14.69％。总体来看，各处理菌量T3>T4>T2>T1,但有效活菌量相差不大，最后均维持在一个稳定状态。
表4不同配方固体有机物料腐熟剂货架期
检测实施例5—固体功能菌剂与有机肥施用对烟草生长的影响试验
1.试验材料与方法
1.1试验时间：2018年2月12日-2018年8月30日
1.2试验地点：昆明市安宁市青龙镇微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心实验大棚周边地块，供试土壤为黏红壤，前茬作物为烟草，有机质含量32.19g.kg-1，pH6.2，碱解氮含量168.5mg.kg-1，有效磷含量84.17mg.kg-1，速效钾含量487.68mg.kg-1。
1.3：供试肥料
上述方案一制备的有机无机复混肥16-6-8，具有防治烟草两黑病及促生长功能微生物菌剂。
1.4：试验方法
试验共设3个处理：处理1为常规施肥；处理2为在常规施肥基础上配施具有防治烟草两黑病及青枯病的生防功能菌剂(发酵液)，处理3为在常规施肥基础上配施与处理2相同的功能菌剂(固体)；。常规施肥为：油枯有机肥50kg/667m2+有机无机复合肥(16－6－8)30kg/667m2；功能微生物菌剂与有机肥混匀施入土壤，液体发酵功能微生物菌剂用量为0.5L/667m2，固体功能微生物菌剂用为 0.15kg/667m2,追肥分两次施用，追肥选用复合肥12-0-33，移栽后 7天左右(或掏苗时)，每亩施用8-10kg的烟草专用追肥作提苗肥，兑水浇施；在团棵至旺长期时(12～13个叶片)结合中耕培土，每亩施用10-12kg的烟草专用追肥，距烟株10～15㎝左右环穴干施(雨水多时)或兑水施用。烟株按1100株/667m2移栽，每个处理重复3 次。小区面积30m2，烟株生育期田间管理一致。
1.5田间管理措施
2018年2月12日育苗，4月17日开始移栽，各生育期分别调查农艺性状，并分析比较。
2.结果与分析
2.1团棵期农艺性状
团棵期农艺性状结果见表5。从表中可以看出1、2、3三个处理中，茎围、中部叶和上部叶最大叶面积均优于常规处理；处理2、处理3株高均高于对照；在单株叶数上处理1和处理3均低于对照。总体来看，团棵期的农艺性状从高到低的顺序依次为处理3>处理2>处理1。
表5团棵期农艺性状
2.2旺长期农艺性状
旺长期农艺性状结果见表6。从表中可以看出施用菌剂的处理在各农艺指标上均优于常规施肥处理，其中，处理3农艺指标优势整体最好，较常规施肥株高高0.5cm、单株叶数多0.2片三个处理之间差别不大。总体来看，旺长期的农艺性状从高到低的顺序依次为3>2>1。
表6旺长期农艺性状
2.3现蕾期农艺性状
现蕾期农艺性状结果见表7。从表中可以看出施用菌剂的处理在各农艺指标上均优于常规施肥处理，且1、2、3三个处理之间差别不明显。总体来看，现蕾期的农艺性状从高到低的顺序依次为3>2>1。
表7现蕾期农艺性状
2.4封顶期农艺性状
封顶期农艺性状结果见表8。从表中可以看出施用菌剂的处理在各农艺指标上均优于常规处理，且1、2、3三个处理之间差异明显。总体来看，封顶期的农艺性状株高、茎围、单株叶片数从高到低的顺序依次为3>2>1。
表8封顶期农艺性状
2.5病害发生情况调查
病害发生情况调查结果见表9。从表中可以看出该地块主要有气候性斑点病、黑胫病，番茄斑萎病、花叶病，气候性斑点病和黑胫病的发病率以常规处理的最高，处理2的次之，处理3最低；；番茄斑萎病的发病率以处理3的最高，处理2次之、常规处理最低；花叶病的发病率以常规处理的最高，处理3的次之，处理2最低。总体来看，各处理抗病性从高到低的顺序无明显规律。施用固体菌剂的处理对黑胫病、气候性斑点病有明显的预防效果。
表9病害发生情况调查表
处理 气候性斑点病 黑胫病 番茄斑萎病 花叶病
1 0.83 0.38 0.17 2.08
2 0.56 0.06 0.18 0.67
3 0.44 0.02 1.14 0.79
总体而言，功能微生物菌剂配施有机肥可有效促进烟草生长，降低烟草气候性斑点病和黑胫病的发病率。
检测实施例6—固体腐熟剂与液体腐熟剂腐熟效果对比试验
1.试验材料与方法
1.1试验地点
昆明市安宁市青龙镇云之叶生物科技有限公司，有机肥发酵车间。
1.2供试材料
采用上述方案二制备的有机物料腐熟剂(云南省微生物发酵工程研究中心有限公司生产提供)
有机物料：玉米秸秆、除虫菊渣、
1.3试验设计
试验针对不同的原料开展单物料腐熟试验，每种单体物料称 200kg，设置液体有机物料腐熟剂与固体有机物料腐熟剂处理，液体腐熟剂添加量为单体物料重量的5‰，固体有机物料腐熟剂的添加量为1.5‰,以上两种腐熟菌剂有效活菌总量相等，其他发酵条件完全相同。具体处理如下表
表10有机物料单体发酵试验处理
处理 发酵原料
A 玉米秸杆200kg+固体腐熟剂0.33kg
B 玉米秸杆+液体腐熟剂1.0kg
C 除虫菊渣+固体菌剂0.33kg
D 除虫菊渣+液体腐熟剂1.0kg
1.4试验方法
1.4.1原料的混合发酵：将各处理原料混合均匀，加入腐熟剂并兑水搅拌均匀，保证物料含水量在50％左右(用手捏成团，用力落地后能基本散开)，堆成圆锥形堆体进行发酵。
1.4.2温度测量及翻堆：每天10:00分别测定物料堆体上、中、下层物料温度并记录，同时测量记录当时环境温度。当温度达到40℃以上三小时后开始翻堆，每天进行1次翻堆，直至温度接近环境温度后停止翻堆。若48小时内温度还不到40℃，必须进行翻堆，以免造成厌氧坏境；在发酵中后期，若温度达到60℃以上时，必须进行翻堆，以免温度过高，功能菌数量下降。
2.结果分析
2.1不同腐熟剂剂型对玉米秸杆堆肥温度的影响
对比图1和图2固体粉状腐熟剂和液体腐熟剂对玉米秸秆堆肥温度的记录结果可知：固体腐熟剂腐熟上层物料升温的最大值和天数分别为72℃和5天，中层物料升温的最大值和天数分别为68℃和4天，下层物料升温最大值和天数分别为58℃和10天；液体腐熟剂上层物料升温最大值和天数分别为62℃和16天，中层物料升温的最大值和天数分别为64℃和11天，下层物料升温的最大值和天数分别为53℃和 11天；综上，固体有机物料腐熟剂升温天数较液体有机物料腐熟剂上中下层物料分别提前11天、7天和1天，最高温度分别高10℃、4℃和5℃。
2.2不同腐熟剂剂型对除虫菊渣堆肥温度的影响
对比图3和图4固体粉状腐熟剂和液体腐熟剂对除虫菊渣堆肥温度的记录结果可知：固体腐熟剂腐熟上层物料升温的最大值和天数分别为60℃和14天，中层物料升温的最大值和天数分别为63℃和9天，下层物料升温最大值和天数分别为56℃和12天；液体腐熟剂上层物料升温最大值和天数分别为57℃和5天，中层物料升温的最大值和天数分别为60℃和10天，下层物料升温的最大值和天数分别为50℃和15天；综上，固体有机物料腐熟剂升温天数较液体有机物料腐熟剂下层物料提前3天，而对上、中层物料没有提前功效，最高温度分别高3℃、3℃和6℃，
结论：
综合以上腐熟效果对照试验可知：同种物料固体腐熟剂升温速度更快，表明其能提前完成腐熟，由此可见固体有机物料腐熟剂较液体有机物料腐熟剂具有升温快、有效缩短腐熟周期的功效，且可以节约劳动成本。
显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一，功能微生物的培养，芽孢杆菌培养基配方按重量份数如下：黄豆粉10-16份、蔗糖7-13份、蛋白胨1-5份、玉米粉2-8份、碳酸钙3-9份、鱼粉3-7份、氯化钙0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.2-0.7份、磷酸氢二钾0.2-0.8份、硫酸锰0.1-0.5份、氢氧化钠0.1-0.5份、氯化钠2-7份、消泡剂1-2份，接种量(体积百分比)为0.5％-1.5％，在35-39℃的好氧条件下,培养1-3天；
所述消泡剂为有机硅消泡剂；
步骤二，功能微生物的发酵，发酵包括灭菌、接种、发酵；
所述灭菌的过程中，先对发酵罐进行空消，然后加入培养基后进行实消，空消条件为：压力0.15MPa，温度123℃，时间1h；实消条件为：压力0.15MPa，温度123℃，时间35min；
所述接种的过程为：待灭菌完成，培养液温度下降至37℃时，进行取样，利用划线培养和显微镜镜检，无活菌生长，灭菌完成，然后开始接种，接种比例(体积比)为菌种/培养液1:120；
所述接种开始8h后，进行取样，利用划线培养和显微镜镜检，检测发酵有无污染；
所述发酵过程需要控制转速、通气量、发酵温度、发酵时间；所述转速在发酵前6h为80r/min,此后每隔2h转速升高10r，达到120r/min后保持该转速至发酵结束；所述通气量为：种子罐发酵前8h保持通风量10m3/h,后每隔1h增加通风量1m3/h，至通风量达到15m3/h时保持发酵至结束，整个过程保持罐压在0.06Mpa；发酵罐前8h保持通风量30m3/h,后每隔1h增加通风量5m3/h，至通风量达到50m3/h时保持发酵至结束，整个过程保持罐压在0.06Mpa；
所述发酵进行24h后，进行取样，利用划线培养和显微镜镜检，检测发酵是否污染和芽孢率，此后每6h进行一次取样检测，直到芽孢率达到95％以上，完成发酵；
所述发酵完成后，采用稀释涂板法取样检测发酵液菌量，菌量大于2.0×109cfu/ml即可；
所述发酵温度为36.5℃—37.5℃；
步骤三，菌株孢子液的制备，将步骤二中发酵检测合格的发酵液采用高速蝶式离心机离心，转速为7000r/min，收集离心沉淀液，并检测其芽孢量，芽孢量≥2.0×1010cfu/ml时，取离心沉淀液备用；
步骤四，微生物菌剂制备，取步骤三中离心沉淀液并添加吸附载体，离心沉淀液与吸附载体的质量比为1:3，混合均匀，通过塔形连续式真空干燥设备干燥后，干燥温度为30-45℃，含水率(质量百分比)为10％-20％，冷却包装即得。
2.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述功能微生物包含的芽孢杆菌属为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtillis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的任意两种或三种按等体积或等质量复合；
所述胶质芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15845；
所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15847；
所述解淀粉芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15848；
所述吸附载体包括质量份的有机吸附载体70-80份和矿物吸附载体20-30份；所述有机吸附载体为草炭、米糠、海藻粉、生物质炭粉中的一种或多；所述矿物吸附载体为凹凸棒粉、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺中的一种或多种；
所述草炭、细米糠、生物质炭粉过80目筛；所述海藻粉过100目筛；所述凹凸棒、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺过120目筛。
3.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述功能微生物包含的芽孢杆菌属为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtillis)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus Donk)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)，所述枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌按等体积或等质量复合；
所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15844；
所述胶质芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.15845；
所述嗜热脂肪芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15852；
所述胶冻样芽孢杆菌的保藏登记号CGMCC No.15853；
所述吸附载体包括质量份的草炭、海藻粉、生物质炭粉中的一种或多种35-40份，米糠40-45份，凹凸棒、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺中的一种或多种15-25份；
所述草炭、海藻粉、生物质炭粉过80目筛；所述米糠过60目筛；所述凹凸棒、膨润土、硅藻土、蒙脱石、聚丙烯酰胺过120目筛。
4.一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂按照权利要求1和2所述的制备方法制备得到。
5.根据权利要求4所述的一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的应用，其特征在于：它应用在具有防病、促生长功能的固体微生物肥料中。
6.一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂按照权利要求1和3所述的制备方法制备得到。
7.根据权利要求6所述的一种芽孢杆菌属固体微生物菌剂的应用，其特征在于：它应用在具有耐高温、耐纤维素、高效降解能力的固体有机物料腐熟剂中。
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