CN106591147A

CN106591147A - 一种黑曲霉njdl‑12菌株及其在滨海盐碱土改良上的应用

Info

Publication number: CN106591147A
Application number: CN201611122692.2A
Authority: CN
Inventors: 王世梅; 黄启为; 沈其荣; 李�真; 陈莎莎; 冯哲叶; 邓照亮; 杨华; 沈标
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2016-12-08
Filing date: 2016-12-08
Publication date: 2017-04-26

Abstract

本发明公开一种黑曲霉NJDL‑12菌株及其在滨海盐碱土改良上的应用，属于农业集约化生产技术。本发明分离得到的菌株NJDL‑12属于黑曲霉(Aspergillus niger)，于2015年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.11544。黑曲霉菌NJDL‑12能大量分泌草酸，结合盐碱土中的Ca²⁺，形成草酸钙，固结土壤中的Ca²⁺，降低土壤盐度，改善土壤团粒结构，增加土壤孔隙度。由该菌株NJDL‑12制备的生物有机肥，施入土壤后，降低土壤pH及盐度，改善土壤团粒结构，改良盐碱土，促进作物生长，应用效果显著。

Description

一种黑曲霉NJDL-12菌株及其在滨海盐碱土改良上的应用

技术领域

本发明属于环境生物技术领域，涉及一种黑曲霉NJDL-12菌株及其在滨海盐碱土改良上的应用，利用该黑曲霉NJDL-12菌株生产生物有机肥，增加滨海盐碱土生物活力，改良盐碱土团粒结构，并培肥土壤，改善及促进作物生长。

背景技术

随着我国经济高速发展，土地资源紧缺的问题显得日益严重，开垦荒废土地成为我国土地资源开发利用的重点方向。我国滨海地区拥有大面积的盐碱荒地，盐碱土虽然是一种重要的土地资源，但由于其具有盐分高、土壤孔隙度小，易板结，透气透水差性，养分含量低等恶劣的生态环境，以至于植被成活率及农业生产效率较低。

改良盐碱土的研究已有近100年的历史，归纳起来有工程措施、农业措施、化学措施及生物措施等。工程措施有淡水洗盐、暗管排碱、挖沟排盐、修筑台田、引黄灌溉等；农业措施有地膜覆盖、种稻改碱、合理耕作等；化学措施有施用石膏、磷石膏等，降低土壤碱化度和pH值，增加土壤通透性，但化学改良剂大量使用易造成土壤板结，土壤物理性质恶化；生物措施有建立防护林带及引种、驯化有经济价值的盐生植物等措施。以上措施在一定时期和程度上起到了改良盐碱土壤、促进植物生长的效果，但由于其处理成本较高、尤其化学措施易造成二次污染而不利于在较大范围的盐渍区应用。研究发现施用生物有机肥，可以改善土壤理化性质，增加土壤有机质含量，这种“培肥改土”的方法，将是盐碱土改良的一个主要生物措施。

另一方面，作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便处置不当，不仅严重污染环境，而且也极大地浪费养分资源。如果将这些固体有机废弃物经过高温发酵成有机肥，再用于功能微生物的载体，制备成功能明确的生物有机肥料，不仅改善土壤物理结构，而且还能不断补充消耗的土壤有机质，对于缓解土壤水、肥和气的矛盾，并促进土壤保水保肥有重要意义，将成为未来农业生产的主要肥料和改良盐碱土的一个主要生物手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于改良盐碱土的黑曲霉NJDL-12菌株。

本发明的另一目的在于提供一种改良滨海盐碱土的黑曲霉固体菌剂。

本发明的另一目的在于提供一种改良滨海盐碱土的生物有机肥料。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种黑曲霉菌NJDL-12菌株，该菌株NJDL-12属于黑曲霉(Aspergillus niger)，于2015年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.11544，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株的主要生物学特性为在PDA培养基上最佳的生长温度28℃，培养4～5天，形成直径7～8cm的菌落，菌丝顶部形成球形顶囊，顶囊上着生分生孢子小梗，孢子小梗上着生成串的黑色球状分生孢子。

该NJDL-12菌株具有极强的分泌有机酸的能力，在pH5.5的液体培养基中，培养5天，分泌草酸2353mg/L，甲酸7656mg/L，柠檬酸322mg/L。改良盐碱土，NJDL-12菌株分泌有机酸，降低土壤pH，草酸与土壤中Ca²⁺结合，形成草酸钙，固结土壤中的Ca²⁺，降低土壤盐度，改善土壤团粒结构，增加土壤孔隙度。

一种黑曲霉固体菌剂，采用以下步骤制备：

(1)将上述的NJDL-12菌株扩大培养获得NJDL-12液体种子；

(2)将NJDL-12液体种子接种到含有秸秆粉、氨基酸水解液、蚯蚓粪和稻壳的混合基质中进行固体发酵至孢子总数≥10¹⁰个/g，获得黑曲霉固体菌剂。

上述的混合基质中秸秆粉、氨基酸水解液、蚯蚓粪和稻壳的干物质重量比为6～9：2～5：6～9：3～1，所述混合基质的含水率为50％～60％。所述的混合基质中C：N＝25～30:1，pH值为6.0～6.5。

步骤(1)中NJDL-12菌株扩大培养的过程为：将上述的NJDL-12菌株接种到液体种子培养基中，在28～30℃条件下，摇床上培养40～48h；所述的液体种子培养基为PDA培养基。

步骤(2)中所述NJDL-12液体种子的接种比例为10％～20％(w/w)；所述固体发酵的条件为：发酵温度28～30℃，基质厚度2～3cm，发酵前3天，每天翻堆一次，3天后停止翻堆，发酵6～7天。

本发明用秸秆粉：氨基酸水解液：蚯蚓粪：稻壳[6～9：2～5：6～9：3～1(w/w)]作为混合基质固体发酵黑曲霉菌剂，其生产成本仅及常规发酵的1/3。因此，用农业废弃物生产黑曲霉菌剂是一种低成本高效的生产方法。

一种微生物有机肥料，该肥料中含有≥1.0×10⁸个/g的上述黑曲霉菌NJDL-12菌株的分生孢子。

上述的微生物有机肥料，是将上述的黑曲霉固体菌剂与有机肥进行复合，制成微生物有机肥料。

上述的微生物有机肥料，其所述的有机肥由腐熟的牛粪堆肥与15％～25％的氨基酸水解液复合而成。该微生物有机肥料的详细制备过程为：腐熟的牛粪堆肥与15％～25％(w/w)的氨基酸水解液复合，平衡3～5天，pH＝6.5-6.8时，添加1％(w/w)的黑曲霉固体菌剂，混匀，然后在温度不超过50℃的条件下将生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，即得改良盐碱土的黑曲霉生物有机肥料。该微生物有机肥料中黑曲霉菌NJDL-12菌株的孢子数≥1.0×10⁸个/g，全氮质量比含量为4％～5％、总氮磷钾养分质量比含量为6％～10％、有机质质量比含量为≥45％，全氮中质量比90％以上为有机氮，含水量质量比为25％～30％。

黑曲霉生物有机肥料中腐熟的牛粪堆肥发芽指数≥98％，氨基酸水解液含氮量0.04～0.05g/ml，其中氨基氮含量0.015～0.02g/ml，为畜禽或动物的毛发的酸水解液，可通过市场购买获得。

上述的黑曲霉菌NJDL-12菌株、黑曲霉固体菌剂和微生物有机肥料在改良滨海盐碱土上的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的用于改良盐碱土的黑曲霉生物有机肥料及其生产方法，利用黑曲霉固体菌剂与有机肥混合，制成生物有机肥料，其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点：

1)肥料产品中含有改良盐碱土的高效黑曲霉菌株，其分泌有机酸量大，试验结果表明，在江苏滨海盐碱土壤上施用本产品后，作物生长提高30％以上。

2)该肥料为生物有机肥，含有丰富的有机质(≥45％)，总氮磷钾养分质量比含量为6％～10％，其中有机氮质量比含量为4％～5％，而且生物有效性高，在做成生物有机肥产品中无需添加任何含磷化肥，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。本产品中有机氮大部分为氨基酸水解液，确保了氮素持续稳定的供应，促进作物生长。施入该土壤改良剂后土壤的pH值下降了0.6，盐分含量下降了0.5％，土壤的有机质、全氮、全磷含量增加，土壤肥力增高，促进了植物根系的生长发育。

3)由于是生物制剂，完全没有因为化学改良剂的使用所带来的一系列问题，有利于农业的可持续发展，增加农民收入。

附图说明

图1黑曲霉的形态

图2玉米植株在盐碱土及改良后盐碱土上生长情况对比

图3滨海盐碱土壤改良剂的制备方法。

具体实施方式

1.菌株的分离和鉴定

采集大豆根际土壤，在以Ca₃(PO₄)₂为唯一磷源的选择性培养上分离溶磷真菌，首先以溶磷圈的大小作为初筛指标，接着用液体摇瓶实验检测菌株溶解Ca₃(PO₄)₂及羟基磷灰石的能力，初筛获得高产生有机酸的菌株，再通过耐盐及酸碱耐受实验复筛多功能菌株，进一步通过盐碱土的盆栽试验验证。结果发现菌株NJDL-12在以Ca₃(PO₄)₂为唯一磷源的培养基中，培养8天可溶性磷浓度达到1350mg/L，在以羟基磷灰石为唯一磷源的培养基中，培养8天可可溶性磷浓度达到350mg/L，且具有较高的耐盐及耐受酸碱的能力。最终获得高效菌株NJAU-12，并进行鉴定，菌种保存于4℃冰箱。

菌株NJDL-12属于黑曲霉(Aspergillus niger)，主要生物学特性为：在PDA培养基上最佳的生长温度28℃，培养4～5天，形成直径7～8cm的黑色菌落，菌丝顶部形成球形顶囊，顶囊上着生分生孢子小梗，孢子小梗上着生成串的黑色球状分生孢子。该菌株NJDL-12于2015年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.11544。

试验表明，该NJDL-12菌株具有极强的分泌有机酸的能力，在pH5.5的液体培养基中，培养5天，分泌草酸2353mg/L，甲酸7656mg/L，柠檬酸322mg/L。

该菌株NJDL-12，具有较强耐受盐浓度的能力，在NaCL浓度1.2％-1.5％(w/w)的环境中生长良好。

该菌株NJDL-12，具有较强耐受酸碱的能力，在pH8.5-2.0的范围内生长良好。

该菌株NJDL-12，具有较强的耐受重金属铅的能力，在铅离子(Pb²⁺)＜1500mg/L的溶液中生长良好。

该菌株NJDL-12，分解纤维素能力强，可以以秸秆为唯一碳源生长，其滤纸酶活达到1.23U/mL。

2.黑曲霉固体菌剂生产

1)将菌株NJDL-12接种到培养液，进行液体发酵生产得到NJDL-12发酵液，其发酵生产条件为：初始pH范围6.0-6.5，培养温度范围28～30℃，通入无菌空气(溶氧)并搅拌：无菌空气的通入量一般为培养液体积的30％～100％，搅拌速度一般为180转/分钟。发酵时间48小时，发酵后期将菌丝全部打碎成该菌的菌落形成单位，发酵液中该菌的菌落形成单位≥1.0×10⁹个/ml；

所用培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：马铃薯200g，蔗糖20g，马铃薯去皮煮30min，双层纱布过滤取滤液，pH自然，121℃灭菌20min。

2)将NJDL-12液体种子接种到含有秸秆粉、氨基酸水解液、蚯蚓粪和稻壳的混合基质中进行固体发酵至孢子总数≥10¹⁰个/g，获得黑曲霉固体菌剂。所述的混合基质中秸秆粉、氨基酸水解液、蚯蚓粪和稻壳的重量比为7：3：7：2(w/w)，所述混合基质的含水率为50％～60％。其所述的混合基质中有机质的重量百分含量为≥45％，其中C：N＝25～30:1，pH值为6.0～6.5。所述NJDL-12液体种子的接种比例为10％(w/w)；所述固体发酵的条件为：发酵温度28～30℃，基质厚度2～3cm，发酵前3天，每天翻堆一次，3天后停止翻堆，发酵6～7天。

3.黑曲霉生物有机肥生产

将80％(w/w)的腐熟的牛粪堆肥与20％(w/w)的氨基酸水解液复合，平衡3～5天，pH＝6.5-6.8时，添加1％(w/w)的黑曲霉固体菌剂，混匀，黑曲霉分生孢子含量达到5.0×10⁷个/g以上。然后在温度不超过50℃的条件下将生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，即得改良盐碱土的黑曲霉生物有机肥料。

黑曲霉生物有机肥料中腐熟的牛粪堆肥发芽指数≥98％，所述的氨基酸水解液含氮量0.04～0.05g/ml，其中氨基氮含量0.015～0.02g/ml，是畜禽或动物的毛发的酸水解液，为江阴市联业生物科技有限公司生产。

上述所生产的NJDL-12生物有机肥产品中黑曲霉分生孢子含量≥1.0×10⁸个/g，全氮质量比含量为4％～5％，总氮磷钾养分质量比含量为6％～10％，有机质质量比含量为≥45％，全氮中质量比90％以上为有机氮。可用于改良滨海盐碱土。

4.滨海盐碱土改良实验

实验用盐碱土壤采自江苏东台县洋口镇，土壤理化性质见表1。取500g过20目筛风干的盐碱土壤，转入1000ml培养瓶中。用去离子水调节土壤含水量至20％～25％，取NJDL-12生物有机肥(10⁸孢子/g)按3％，5％，8％的量加入到培养瓶中，混匀，于室温(20℃～25℃)培养(瓶底加1cm后石英砂，以储存在土壤培养过程中渗出的水分)，设置不接菌肥的对照，培养30天后，取样检测土壤pH，电导率，有机质，土壤团聚体组成，土壤中速效磷含量变化等，结果见表1及表2。

表1黑曲霉NJDL-12生物有机肥改良滨海盐碱土的效果

表2黑曲霉NJDL-12生物有机肥改良滨海盐碱土前后土壤团聚体组成变化(％)

5.玉米促生盆栽实验

考察黑曲霉NJDL-12生物有机肥改良滨海盐碱土活化土壤磷素促进玉米生长的能力。试验土为采自江苏东台县洋口镇，以玉米盆栽试验研究NJDL-12生物有机肥的应用效果。设置NJDL-12生物有机肥处理与不施生物有机肥对照，每盆装盐碱土壤5kg，各处理重复5次，按5％(w/w)的接种量，将250g NJDL-12生物有机肥与5kg盐碱土混匀，备用。玉米种子(京甜紫花糯2号)经表面消毒催芽后播种，每盆玉米种子4粒，7d后间苗，每盆留2株。50d后收获玉米植株，并采集盆栽土壤。测定玉米植株生物量，玉米植株磷含量，土壤速效磷含量，结果见表3。从表3可以看出NJDL-12生物有机肥可以促进玉米植株生长，用NJDL-12生物有机肥处理后，玉米的茎粗、植株高和鲜重分别较CK增加29.5％、33.9％和41.7％，植株地上部磷素积累量及土壤速效磷分别较CK增加57.7％和45.7％。

表3黑曲霉NJDL-12生物有机肥改良盐碱土活化土壤磷素及对玉米苗期生长的影响

本发明专利从改良盐碱土这一关键问题着手，研制出一种能显著降低盐碱土pH，含盐量，并改善土壤团粒结构的生物有机肥料产品，可降低盐碱土pH 0.55单位，土壤EC值从6.30降至4.34(mS/cm)降低31％，增加了土壤大团聚体含量。本肥料产品的作用机制：①肥料中的有机物给产品中的功能菌的培育提供了很好的条件，使之迅速建立外源有益功能菌微生物的生态及其食物链；②NJDL-12菌丝体及分泌的有机酸在土壤中促进大团聚体的形成，改善土壤理化性质；③肥料产品中NJDL-12能分泌高含量的有机酸，降低土壤pH，同时有机酸螯合土壤矿物中的磷，促进有效磷的释放，提高作物对磷素的吸收，促进作物生长。

Claims

1.一种黑曲霉菌NJDL-12菌株，该菌株NJDL-12属于黑曲霉(Aspergillus niger)，于2015年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.11544。

2.权利要求1所述的黑曲霉菌NJDL-12菌株在改良滨海盐碱土中的应用。

3.一种黑曲霉固体菌剂，其特征在于采用以下步骤制备：

(1)将权利要求1所述的NJDL-12菌株扩大培养获得NJDL-12液体种子；

4.根据权利要求3所述的黑曲霉固体菌剂，其特征在于所述的混合基质中秸秆粉、氨基酸水解液、蚯蚓粪和稻壳的干物质重量比为6～9：2～5：6～9：3～1，所述混合基质的含水率为50％～60％。

5.根据权利要求3所述的黑曲霉固体菌剂，其特征在于步骤(1)中NJDL-12菌株扩大培养的过程为：将权利要求1所述的NJDL-12菌株接种到液体种子培养基中，在28～30℃条件下，摇床上培养40～48h；所述的液体种子培养基为PDA培养基。

6.根据权利要求3所述的黑曲霉固体菌剂，其特征在于步骤(2)中所述NJDL-12液体种子的接种比例为10％～20％；所述固体发酵的条件为：发酵温度28～30℃，基质厚度2～3cm，发酵前3天，每天翻堆一次，3天后停止翻堆，发酵6～7天。

7.一种微生物有机肥料，其特征在于：该肥料中含有≥1.0×10⁸个/g的权利要求1所述黑曲霉菌NJDL-12菌株的分生孢子。

8.根据权利要求7所述的微生物有机肥料，其特征在于：将权利要求3～6中任意一项所述的黑曲霉固体菌剂与有机肥进行复合，制成微生物有机肥料。

9.根据权利要求8所述的微生物有机肥料，其特征在于所述的有机肥由腐熟的牛粪堆肥与15％～25％的氨基酸水解液复合而成。

10.权利要求3～6中任一所述的黑曲霉固体菌剂和权利要求7～9中任一所述的微生物有机肥料在改良滨海盐碱土上的应用。