CN107858296B - 一株解磷、解钾和降解纤维素的黑曲霉及其菌剂的制备与应用 - Google Patents

一株解磷、解钾和降解纤维素的黑曲霉及其菌剂的制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株解磷、解钾和降解纤维素的黑曲霉及其菌剂的制备与应用；CS‑1菌株具有高效解磷、解钾、高效降解纤维素的能力；CS‑1菌株可以在小麦、黄瓜、苹果等作物根际稳定定殖并发挥其解磷、解钾和降解纤维素的作用；利用该菌株制备的菌剂可显著促进农作物的生长；可应用于微生物肥料生产，对于有效降低化肥用量、培肥地力、增加作物产量和促进秸秆直接还田具有重要的意义。

Description

一株解磷、解钾和降解纤维素的黑曲霉及其菌剂的制备与 应用
技术领域
本发明涉及一株解磷、解钾和降解纤维素的黑曲霉及其菌剂的制备与应用，属于农用微生物技术领域。
背景技术
磷元素是植物生长发育必要的营养元素之一，是植物体内核酸、ATP、辅酶及多种酶的组成成分，同时又以多种方式参与植物体内的各种生理生化过程，对于促进植物生长发育和新陈代谢起着重要作用。一般的农田土壤中蕴藏丰富的磷素，然而，据估计我国三分之二的耕地缺磷，原因是这些磷素大多以不易被植物吸收利用的难溶性化合物形式存在，因此，无法满足一般作物的生长需求。
钾元素亦是农作物生长不可或缺的营养元素之一，植物体内的钾元素占干物质重量的0.2％～4.1％。钾元素的作用主要是促进酶活化、增强光合作用、促进植物体内糖代谢和蛋白质合成及增强作物的抗逆性等。我国土壤中，钾资源贮存非常丰富，土壤全钾含量一般在1.5％～2.5％，少数土壤高达3％，比氮和磷的储藏量高10～20倍。但这些存储量非常丰富的钾资源95％以上是以钾长石、云母等铝硅酸盐形态存在于土壤中，不能被农作物直接吸收利用，因此，导致了土壤富钾又缺钾的现象。据土壤普查资料显示，全国约70％的耕地缺钾，约45％的耕地严重缺钾，土壤缺钾己成为限制作物产量和品质提高的重要因素。
传统补充磷、钾的方式是通过大量的施用磷钾化肥以满足作物生长对磷钾元素的需求，但施入的磷钾元素往往很快会被土壤中的一些游离的金属离子固定成难溶性化合物。据报道，我国水稻、小麦和玉米三大作物对磷、钾肥的平均利用率仅为10％～30％，其中大部分的磷、钾元素都积累在土壤中，而且，过量的施用化肥也造成了土壤板结、地力衰退、生态环境恶化、农产品品质下降等问题。
当今秸秆还田是世界普遍重视的一项培肥地力的增产措施，秸秆中含有大量的C、N、P、K以及各种微量元素，秸秆还田把作物吸收的大部分营养元素归还土壤，可有效减少化肥的使用量。秸秆还田在解决秸秆焚烧所造成大气污染的同时，还具有改善土壤的理化性状和生物学性状，提高土壤孔隙度、降低土壤容重、增加土壤有机质含量和微生物数量，激活土壤酶活性、改良土壤结构、提高土壤肥力、增加作物产量等作用，是农业可持续发展的重要措施。秸秆直接还田是秸秆还田的重要方式，但秸秆直接还田后，秸秆中富含的纤维素、半纤维素和木质素难以快速腐解，造成土壤大孔隙多，土壤与种子不能紧密接触，影响种子发芽、生根和出苗等，严重影响秸秆直接还田的大面积推广。如何加速还田秸秆的快速腐解成为目前研究的热点。
土壤中的某些微生物，能够将植物无法吸收利用的无效磷转化成可被直接利用的速效磷；某些微生物能够将植物无法利用的以硅酸盐稳定形态存在的钾转换成可被吸收利用的速效钾；某些微生物能够将纤维素分解成单分子葡萄糖或者在分解的过程中积累纤维二糖，这些微生物分别被称为解磷菌、解钾菌和纤维素降解菌。国内外学者已经成功分离获得了多种解磷菌，其中以细菌居多，如巨大芽孢杆菌等，解磷真菌的种类虽然不多，主要是青霉、曲霉和根霉，但解磷真菌的解磷能力要比解磷细菌的强且遗传性状稳定，解磷放线菌绝大部分为链霉菌属。硅酸盐细菌主要包括环状芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、假单胞菌和多粘类芽孢杆菌等，一些非硅酸盐细菌也具有解钾功能。某些细菌、放线菌和真菌均具有降解纤维素的能力，其中真菌被认为是自然界纤维素物质的主要降解者，主要包括：黑曲霉、绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、嗜热毛壳菌等；能分解纤维素的细菌有：芽胞杆菌属、类芽胞杆菌属、单胞菌属等；能分解纤维素的放线菌有诺卡氏菌、单孢菌、链霉菌属等。
我国是农业生产大国，化肥工业虽带来了农业的高速发展，同时也带来了土壤板结，养分比例失调、肥力下降，河流和地下水污染等问题。为了实现农业的可持续发展，达到高产、优质、高效、生态、安全的目的，2015年2月我国农业部印发了《到2020年化肥使用量零增长行动方案》和《到2020年农药使用量零增长行动方案》，两个行动方案的目标任务是：力争到2020年，主要农作物化肥使用量实现零增长；力争实现农药使用总量零增长。2017年2月农业部又印发了《开展果菜茶有机肥替代化肥行动方案》，方案的目标为到2020年，果菜茶优势产区化肥用量减少20％以上，果菜茶核心产区和知名品牌生产基地(园区)化肥用量减少50％以上。
微生物肥料具有成本低、肥效高、无污染、可节约能源等优点，可有效改善土壤环境、提高土壤肥力、防治土传病害、增加作物产量和减少化肥使用量。加强功能复合型微生物菌株的分离筛选，研发新型多功能微生物肥料，对微生物肥料产业向功能性专业化方向发展，对于减少化肥施用量，增强土壤肥力，保护土壤生态环境，促进农业可持续发展具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株解磷、解钾和降解纤维素的黑曲霉及其菌剂的制备与应用，可应用于微生物肥料生产，对于有效降低化肥用量、培肥地力、增加作物产量和促进秸秆直接还田具有重要的意义。
一株保藏编号为CGMCC No.14634的黑曲霉(Aspergillus Niger)CS-1，已于2017年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其ITS序列如Seq ID No.1所示。
黑曲霉CS-1菌株具有高效解磷、解钾和降解纤维素的功能。
本发明还涉及一种利用黑曲霉CS-1菌株制备微生物菌剂的方法，步骤如下：
1、菌种活化：
将低温斜面保存的黑曲霉CS-1菌株划线接种于PDA培养基平板上，30℃±2℃培养3～4d；
所述PDA培养基组分：马铃薯200g，牛肉膏5.0g，葡萄糖20g，琼脂15g，(NH4)2SO41.0g，MgSO4 1.0g，KH2PO4 0.6g，CaCO3 3.0g，pH 6.8～7.2，蒸馏水1000mL。
2、孢子悬液制备：
将黑曲霉CS-1菌株打菌饼接种于PDA培养基平板上，30±2℃静置培养4～5d，用无菌水将CS-1菌株孢子冲洗下，收集、备用；利用血球计数板于显微镜下记数，无菌水适当稀释，使其孢子浓度达到107～108cfu/mL；
3、接种培养：
将步骤2)制备的CS-1菌株孢子悬液按8％～10％(质量比)接种量接种至固体发酵培养基中，充分混匀后转至浅盘中，摊平，相对湿度控制在75％左右，30±2℃培养5～7d，待黑曲霉孢子长满整个培养基，即固体培养完成，得到固体培养物；
所述固体发酵培养基组分为：麸皮300g、黄豆饼粉75g、Mendels'营养液375mL；将固体发酵培养基121℃高压湿热灭菌20min，冷却。
4、将步骤3)得到的固体培养物自然风干或者在45～45℃温度下鼓风烘干，粉碎，过80目筛得到微生物菌剂。
本发明具有以下优点：
1.黑曲酶CS-1菌株具有高效解磷能力。以磷酸钙为磷源测定其解磷能力，与空白对照相比，接种CS-1菌株的处理组可溶性磷增加790.67mg/L。
2.黑曲酶CS-1菌株具有高效解钾能力。以钾长石粉为钾源测定其解钾能力，与空白对照相比，接种CS-1菌株的处理组速效钾增加127.59％。
3.黑曲酶CS-1菌株具有高效降解纤维素的能力。以羧甲基纤维素钠为底物，测定其降解纤维素的能力，纤维素水解酶酶活为553.39U/mL。
4.黑曲酶CS-1菌株具有高效降解半纤维素的能力。以燕麦木聚糖为底物，测定其降解半纤维素的能力，半纤维水解酶酶活为2979.09U/mL。
5.黑曲酶CS-1菌株能在小麦、黄瓜和苹果等作物根际中稳定定殖并发挥高效解磷、解钾和降解纤维素作用。
6.黑曲酶CS-1菌株发酵性状好，利用黑曲酶CS-1菌株制备微生物菌剂生产工艺简单、成本低，利于工业化生产。
附图说明
图1为黑曲酶CS-1菌株菌株在解无机磷固体培养基和解钾固体培养基上形成的溶磷圈和解钾圈。
其中图1a为黑曲酶CS-1菌株在解无机磷固体培养基上形成的溶磷圈，图1b为黑曲酶CS-1菌株在解钾固体培养基上形成的解钾圈，说明黑曲酶CS-1菌株具有较好的解磷、解钾作用。
图2为黑曲酶CS-1菌株显微结构特征。
图2a为黑曲酶CS-1菌株的有隔菌丝，图2b为黑曲酶CS-1菌株的球形顶囊及双层小梗，图2c为黑曲酶CS-1菌株的气生菌丝特化形成的足细胞，图2d为黑曲酶CS-1菌株的分生孢子。
图3为根据黑曲酶CS-1菌株的ITS rDNA序列，利用Mega 5.0分析构建的黑曲酶CS-1菌株的系统发育进化树。
由图3可以看出，黑曲酶CS-1菌株与曲霉属的遗传进化距离最近，与已知菌株Aspergillus Niger(HG18519)的ITSr DNA同源性达到100％。
图4为黑曲酶CS-1菌株对小麦的促生作用
说明CS-1菌株能够有效促进小麦生长。
图5为黑曲酶CS-1菌株对小麦根际真菌群落结构的影响。
说明黑曲酶CS-1菌株可在小麦根际稳定定殖。
图6为黑曲酶CS-1菌株合成有机酸的种类和含量分析的高效液相色谱图。
其中图6a为9种常规有机酸混合标样的高效液相色谱图，图6b为黑曲酶CS-1菌株发酵液中有机酸种类和含量检测的高效液相色谱图。说明黑曲酶CS-1菌株主要产生的有机酸为草酸(255.74mg/kg)、酒石酸(201.25mg/kg)和柠檬酸(108.04mg/kg)，同时还检测到相对较少含量的富马酸。
具体实施方式：
实施例1
1、CS-1菌株的分离
无菌条件下取小麦根际土样10g，溶于90mL无菌水中，220r/min，振荡培养30min，吸取1mL与9mL无菌水混匀，即得10-1的稀释液，再取1mL 10-1的稀释液与9mL无菌水混匀，即得10-2的稀释液，依稀类推，分别制备10-3，10-4，10-5等一系列稀释液。选用稀释度为10-3、10-4、10-5的土壤稀释液，分别用移液器吸取100uL于马丁氏培养基平板中央，用涂布器将稀释液涂抹均匀，30～32℃恒温静置培养2～4d，挑取不同单个菌落边缘菌丝体，分别划线于PDA平板培养、纯化和保存。
将上述获得的若干株纯培养物分别接种至解无机磷和解钾固体培养基平板上，30～32℃静置培养2～5d，观察水解圈，最终获得一株同时具有解无机磷和解不溶性钾的微生物，命名为黑曲酶CS-1，见附图1。此外，CS-1菌株还具有高效降解纤维素和半纤维素的能力。
解无机磷固体培养基组分：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4 1.0g，Ca3(PO4)2 5.0g，蒸馏水1000mL，Agar 15g。
解钾固体培养基组分：蔗糖10.0g，酵母膏0.5g，(NH4)2SO4 0.2g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 1.0g，钾长石粉1.0g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。
2、CS-1菌株的鉴定
(1)菌落特征与镜下形态
将CS-1菌株稀释后的孢子悬液涂布于PDA平板上，30℃培养24h，形成直径约为6～8mm的白色绒毛状单个菌落；培养至48h，白色菌丝转变为鲜黄色，菌丝顶端附着黑褐色孢子；培养至72h观察，鲜黄色的菌丝几乎看不到，全部被黑褐色的分生孢子覆盖，数量极多，整个菌落呈现黑褐色、绒状形态，继续培养，菌落蔓延占据整个培养基平板，菌落背面也呈浅黄色，菌落边缘整齐。显微镜下观察，CS-1菌丝呈黑褐色、有隔，顶部形成球形顶囊，双层小梗，分生孢子呈圆球状、黑褐色，光滑，见附图2。
(2)分子鉴定
收集培养3～4d的CS-1菌株菌丝体，液氮快速研磨成粉，备用。采用真菌基因组提取试剂盒(E.Z.N.ATMHP Fungal DNA kit)提取基因组DNA。以提取的总DNA为模板，ITS1/ITS4为引物(ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'如Seq ID No.2所示和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'如Seq ID No.3所示)，扩增CS-1菌株的ITS序列，送生工测序。CS-1菌株ITS序列如Seq ID No.1所示。
将此序列与Genbank数据库中序列进行Blast分析比对，发现与其同源性较高的菌株均属于曲霉属，选取9株与CS-1菌株序列相似性较高的菌株进行系统发育分析，利用Mega5.0软件，采取Neighbor-Joining法构建以ITS全序列为基础的系统发育进化树，见图3。CS-1菌株的ITS序列同公开发表的Aspergillus Niger(HG518519)的ITS序列同源性达到100％。根据CS-1菌株的菌落特征、镜下形态特征，结合其ITS序列分析结果，将其鉴定为黑曲霉(Aspergillus Niger)
实施例2
1、CS-1菌株的解无机磷能力测定
将CS-1菌株接种至PDA培养基平板，置于30℃恒温培养箱培养4～5d，待其长满黑褐色的孢子，用无菌水制备成孢子悬液(CS-1菌株孢子浓度为1.65×107cfu/mL)作为种子液接种至装有50mL解无机磷能力测定发酵培养基的三角瓶中(250mL)，接种量为2％(体积比)，同时接种等量的无菌水作为对照，每个处理设3个重复，30℃，200r/min振荡培养5d，进行解无机磷能力测定，测定方法按照NY/T 1847-2010准则规定的钼锑抗比色法，测定其溶解难溶性磷的能力。试验结果表明，与空白对照相比，接种CS-1菌株的处理组可溶性磷含量增加了790.67mg/L；表明CS-1菌株的解磷能能力显著高于NY/T 1847-2010准则规定的解磷菌株的解磷能力要求。
解无机磷能力测定发酵培养基组分：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl0.3g，MgSO4 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4 1.0g，Ca3(PO4)2 10.0g，蒸馏水1000mL。
2、CS-1菌株的解钾能力测定
将CS-1菌株接种至PDA培养基平板，置于30℃恒温培养箱培养4～5d，待其菌落长满平板，用直径为5mm的打孔器打取均匀一致的菌饼，接种至装有50mL解钾能力测定发酵培养基的三角瓶中(250mL)，每瓶培养基接种三个菌饼，同时设置不接种的空白对照，每个处理设3个重复。30℃，200r/min振荡培养7d，进行解钾能力测定。测定方法按照NY882-2004准则规定的过氧化氢灰化法，测定其溶解难溶性钾的能力。试验结果表明，接种CS-1菌株的处理组与未接种的空白对照相比，速效钾增加127.59％。CS-1菌株的解钾能力显著高于NY882-2004准则规定的解钾菌的解钾能力。
解钾能力测定发酵培养基：蔗糖5.0g，(NH4)2SO4 0.2g，MgSO4·7H2O，NaCl 0.1g，CaCO3 0.1g，钾长石粉5.0g，蒸馏水1000mL。
3、CS-1菌株产纤维素酶和半纤维素酶活力测定
将CS-1菌株接种到PDA培养基平板，置于30℃恒温培养箱培养4～5d，待菌落长满平板，用直径为5mm的打孔器打取均匀一致的菌饼，分别接种至装有50mL产纤维素酶液体发酵培养基和产半纤维素酶液体发酵培养基的三角瓶中(250mL)，每瓶培养基接种3个菌饼，同时设置不接种的空白对照。30℃，200r/min振荡培养不同时间，每24h取样，进行活力测定。纤维素水解酶酶活测定方法按照GB20287-2006准则规定的3,5-二硝基水杨酸(DNS)法；半纤维素水解酶酶活测定方法按照NY/T 1847-2010准则规定的3,5-二硝基水杨酸(DNS)法。试验结果见表1，CS-1菌株产纤维素水解酶酶活最高值为553.39U/mL，产半纤维素水解酶酶活最高值为2979.09U/mL。
产纤维素酶液体发酵培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)0.5g，蛋白胨1.0g，麸皮3.0g，NaCl 0.5g，KH2PO4 0.1g，MgSO4 0.02g，(NH4)2SO4 0.3g,蒸馏水1000mL。
产半纤维素液体发酵培养基：麸皮40.0g、蛋白胨5.0g、KH2PO4 5.0g、CaCO3 20.0g、(NH4)2SO4 3.0g、葡萄糖1.0g、MgSO4 1.0g、吐温1.0mL、NaCl 0.5g、KCl 0.5g、蒸馏水1000mL
表1CS-1菌株产纤维素水解酶和半纤维素水解酶酶活测定结果
Figure BDA0001510846750000071
注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差。同行中数据后缀字母相同，则表示经SAS 8.0分析检验处理间差异不显著(P＞0.05)。
实施例3
CS-1微生物菌剂的制备
(1)菌种活化：将低温斜面保存的CS-1菌株划线接种于PDA培养基平板上，30℃±2℃培养3～4d；
(2)孢子悬液制备：将黑曲霉CS-1菌株打菌饼接种于PDA培养基平板上，30±2℃静置培养4～5d，用无菌水将CS-1菌株孢子冲洗下，收集、备用；利用血球计数板于显微镜下记数，无菌水适当稀释，使其孢子浓度达107～108cfu/mL；
(3)固体发酵培养基制备：固体发酵培养基组分为：麸皮300g、黄豆饼粉75g、Mendels'营养液375mL；将固体发酵培养基121℃高压湿热灭菌20min，冷却，备用。
(4)接种培养：将CS-1菌株孢子悬液按8％～10％(质量比)接种量接种至固体发酵培养基中，充分混匀后转至浅盘中，摊平，相对湿度控制在75％左右，30℃±2℃培养5～7d，待黑曲霉孢子长满整个培养基，即固体培养完成；
(5)后处理：固体培养物自然风干或者在45～45℃温度下鼓风烘干，粉碎，过80目筛，混匀后包装。
实施例4
CS-1微生物菌剂的应用
(1)CS-1菌剂对小麦的促生作用
将小麦种子用清水冲洗干净，浓度75％乙醇浸泡10min，浓度30％次氯酸钠浸泡30-60s，无菌水冲洗5～6次、晾干。挑选均匀一致的小麦种子播种到内径22cm的泥瓦花盆中，5粒/盆，浇透水，常规管理。待小麦幼苗长至10cm左右，选择18盆长势一致的小麦幼苗，其中，9盆为施加CS-1微生物菌剂的处理组，每盆加CS-1菌剂0.5g于200mL无菌水中搅拌灌根；9盆为施加灭活的CS-1微生物菌剂，即对照组。2个月后，将小麦连根取出，对比处理组和空白对照组小麦根系的生长状况、干鲜重和根冠比等生物量指标，同时收集处理组和空白对照组小麦根际土样，分别混匀，进行高通量测序。CS-1菌剂对小麦的促生作用结果见表2、图4，处理组每棵幼苗干重、鲜重和根冠比分别为0.37g、1.56g和0.238，对照组每棵小麦幼苗干重、鲜重和根冠比分别为0.30g、1.26g和0.181，将以上数据进行SAS分析，结果表明处理组和对照组小麦幼苗的鲜重和根冠比2个生长量指标均存在显著差异，与对照组相比，处理组的鲜重和干重分别增加了23.81％和23.33％。CS-1菌剂对小麦根际土壤酶活力的影响见表3，施加CS-1菌剂的处理组与空白对照组相比，土壤脲酶和蔗糖酶显著提高。高通量测序结果见图5和表4，分析发现，空白对照组中没有检测到黑曲霉，而在处理组中黑曲霉的占比高达7.12％，表明CS-1菌株可以在小麦根际稳定定殖，并显著促进小麦的生长。
表2CS-1菌剂对小麦的促生作用试验结果
Figure BDA0001510846750000081
注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差。同列中数据后缀字母相同，则表示经SAS 8.0分析检验处理间差异不显著(P＞0.05)。
表3CS-1菌剂对小麦根际土壤酶活力的影响
Figure BDA0001510846750000082
注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差。同列中数据后缀字母相同，则表示经SAS 8.0分析检验处理间差异不显著(P＞0.05)。
表4不同处理中真菌群落组成及占比
Figure BDA0001510846750000091
(2)CS-1菌剂对黄瓜的促生作用
将黄瓜种子用清水冲洗干净，浓度75％乙醇浸泡10min，浓度30％次氯酸钠浸泡30-60s，无菌水冲洗5～6次、晾干。挑选均匀一致的黄瓜种子播种到内径22cm的泥瓦花盆中，3粒/盆，浇透水，常规管理。出苗后，每盆留取1棵黄瓜幼苗，待幼苗长出两片真叶后，选择长势一致的18盆黄瓜幼苗，其中9盆为施加CS-1菌剂的处理组，每盆加CS-1菌剂0.5g溶于200mL无菌水中，灌根；9盆为施加灭活的CS-1微生物菌剂，即对照组。施加菌剂20d后，将黄瓜幼苗连根取出，对比处理组和空白对照组黄瓜幼苗的株高、茎粗、生物量和根冠比等生长量指标。将所有数据进行SAS分析，试验结果见表5。由表5可知，处理组每棵黄瓜幼苗株高、茎粗、生物量和根冠比分别为9.89cm、1.62cm、0.65g和0.242，对照组每棵黄瓜幼苗株高、茎粗、生物量和根冠比分别为8.40cm、1.46cm、0.55g和0.176。处理组黄瓜幼苗株高、茎粗、生物量和根冠比均显著高于对照组，与对照组相比，处理组的株高、茎粗、生物量分别增加了17.74％、10.96％和18.18％，表明CS-1菌株能够在黄瓜根际稳定定殖并显著促进黄瓜生长。
表5CS-1菌剂对黄瓜的促生作用试验结果
Figure BDA0001510846750000101
注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差。同列中数据后缀字母相同，则表示经SAS 8.0分析检验处理间差异不显著(P＞0.05)。
(3)CS-1菌株对苹果幼苗的促生作用试验
选择长势一致的18盆苹果扦插苗，其中9盆为施加菌剂的处理组，每盆加CS-1菌剂0.5g溶于200mL无菌水中，灌根；9盆为不加菌剂的空白对照组。4个月后，调查处理组与对照组苹果幼苗的生长状况。结果表明，施加CS-1菌剂的苹果幼苗长势较旺盛，苹果叶片面积大，叶片颜色呈深绿色；空白对照组苹果幼苗长势不一致，叶片颜色稍浅。处理组苹果幼苗的株高平均值为45.82cm，对照组苹果幼苗的平均株高为40.69cm，处理组苹果幼苗的株高显著高于对照组，与空白对照组相比增加了12.61％。表明CS-1菌株能够成功定殖于苹果幼苗根际并显著促进其生长发育。
实施例5
CS-1菌株的动态溶磷机制
将CS-1菌株孢子悬液(孢子浓度为107～108cfu/mL)作为种子液接种至装有50mLNBRIP培养基的三角瓶中(250mL)，接种量为2％(体积比)，同时接种等量的无菌水作为对照，振荡培养1～5d，每24h取样测定发酵液的pH值和速效磷浓度。将发酵培养3d的CS-1菌株发酵液离心、过滤，滤液送青岛科创质量检测有限公司进行有机酸种类和含量的分析。NBRIP培养基配方为：葡萄糖10g、Ca3(PO4)2 5.0g、NaCl 0.3g、MgSO·7H2O 0.3g、KCl0.3g、(NH4)2SO4 0.5g、MnSO4 1.0g、FeSO4 0.03g和水1000mL。
试验结果见表6和表7和图6，由表6可知，随着培养时间的延长，发酵液的pH值呈现先下降后平缓的趋势，发酵3d时，pH显著下降至2.45，继续培养pH值基本稳定；发酵液中速效磷浓度变化呈现先上升后平缓的趋势，发酵2d时，发酵液中速效磷浓度显著增加到617.27mg/L，继续培养，发酵液中的有效磷浓度的变化差异不显著。由表7可知，黑曲霉CS-1菌株在NBRIP培养基中振荡培养3d，发酵液中主要的有机酸是草酸、酒石酸和柠檬酸，其含量分别是255.74mg/kg、201.25mg/kg和108.04mg/kg，同时还检测到相对较少含量的富马酸。
表6不同培养时间CS-1菌株发酵液pH值和速效磷浓度变化情况
Figure BDA0001510846750000111
注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差。同行中数据后缀字母相同，则表示经SAS 8.0分析检验处理间差异不显著(P＞0.05)。
表7CS-1菌株分泌合成有机酸的种类和含量
Figure BDA0001510846750000112
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 一株解磷、解钾和降解纤维素的黑曲霉及其菌剂的制备与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列(微生物)
<400> 1
attcctccgc ttattgatat gcttaagttc agcgggtatc cctacctgat ccgaggtcaa 60
cctggaaaga atggttggaa aacgtcggca ggcgccggcc aatcctacag agcatgtgac 120
aaagccccat acgctcgagg atcggacgcg gtgccgccgc tgcctttcgg gcccgtcccc 180
ccggagaggg ggacggcgac ccaacacaca agccgggctt gagggcagca atgacgctcg 240
gacaggcatg ccccccggaa taccaggggg cgcaatgtgc gttcaaagac tcgatgattc 300
actgaattct gcaattcaca ttagttatcg catttcgctg cgttcttcat cgatgccgga 360
accaagagat ccattgttga aagttttaac tgattgcatt caatcaactc agactgcacg 420
ctttcagaca gtgttcgtgt tggggtctcc ggcgggcacg ggcccggggg gcagaggcgc 480
ccccccggcg gccgacaagc ggcgggcccg ccgaagcaac agggtacaat agacacggat 540
gggaggttgg gcccaaagga cccgcactcg gtaatgatcc ttccgcaggt tcacctacgg 600
aagtatctta tgcgggtgcg tgtgctagct ccccccctta aatgggtgtg tttggttccg 660
tgg 663

Claims (7)

1.一株黑曲霉(Aspergillus Niger)菌株CS-1，于2017年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.14634。
2.一种微生物菌剂，包含如权利要求1所述的黑曲霉 (Aspergillus Niger) CS-1菌株。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂在促进还田秸秆快速腐解中的应用。
4.如权利要求2所述的微生物菌剂在小麦、黄瓜和苹果根际稳定定殖中的应用。
5.如权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤如下： 1)菌种活化：将低温斜面保存的黑曲霉 (Aspergillus Niger) CS-1菌株划线接种于PDA培养基平板上，30℃±2℃培养3-4d； 2)孢子悬液制备： 将黑曲霉 (Aspergillus Niger) CS-1菌株打菌饼接种于PDA培养基平板上，30±2℃静置培养4～5d，用无菌水将CS-1菌株孢子冲洗下，收集；无菌水适当稀释，使其孢子浓度达到107-108cfu/mL； 3)接种培养： 将步骤2)制备的黑曲霉 (Aspergillus Niger) CS-1孢子悬液按质量比8％～10％的接种量接种至固体发酵培养基中，相对湿度控制在75％，30±2℃培养5-7d，待黑曲霉(Aspergillus Niger) CS-1孢子长满整个培养基，得到固体培养物； 4)将步骤3)得到的固体培养物自然风干或45℃鼓风烘干，粉碎后过80目筛得到微生物菌剂。
6.如权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于： 所述步骤1)中，PDA培养基组分：马铃薯200g，牛肉膏5.0g，葡萄糖20g，琼脂15g，(NH4)2SO4 1.0g，MgSO4 1.0g，KH2PO40.6g，CaCO3 3.0g，pH 6.8～7.2，蒸馏水1000mL； 所述步骤3)中，所述固体发酵培养基组分为：麸皮300g、黄豆饼粉75g、Mendels'营养液375mL；将固体发酵培养基121℃高压湿热灭菌20min，冷却。
7.如权利要求1所述的黑曲霉 (Aspergillus Niger) CS-1在解磷、解钾和降解纤维素中的应用。
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