CN110551640A - 一种能高效降解玉米秸秆复合菌剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合菌剂，特别是涉及一种能高效降解玉米秸秆复合菌剂的制备方法。其制备方法如下：取绿色木霉菌、枝孢菌和镰刀菌分别接入牛肉膏蛋白胨固体培养基中，得绿色木霉菌培养液、枝孢菌培养液和镰刀菌培养液；采用绿色木霉菌培养液、枝孢菌培养液和镰刀菌培养液制备枝孢菌发酵液、镰刀菌发酵液和绿色木霉菌发酵液，各发酵液混合后，在30质量份数的发酵混合液中加入灭菌并过80目筛的9质量份数的玉米秸秆、1质量份数的小麦麸皮混匀后置于30℃条件下发酵，每隔4h上下翻动一次，直至培养72h，制得秸秆高效降解复合菌剂。本发明复合菌剂具有降解效率高，绿色环保，不污染环境的特点。

Description

一种能高效降解玉米秸秆复合菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种复合菌剂，特别是涉及一种能高效降解玉米秸秆复合菌剂的制备方法。

背景技术

农作物秸秆是在农业过程中以小麦、谷子、玉米、水稻为主的作物产生的茎、叶等副产品。我国是农业大国，地域广阔、人口众多，农作物秸秆种类繁多、数量巨大、分布广泛、利用低下、污染严重。由于区域地理位置、气候条件、降水差异、种植耕作方式、经济技术、消费观念的差异，导致我国秸秆资源具有空间异质性特征，整体上呈现“北多南少、东多西少”的空间分布特征。

作物秸秆是农业生产活动中被遗弃的资源。农业生产用于资源化、减量化、循环化的秸秆仅占产量的30％，大多数秸秆以焚烧、堆砌等方式而被遗弃，资源浪费的同时而进一步造成生态环境问题。由于其涵盖以纤维素、半纤维素为主的生物资源，逐渐引起众多研究人员的关注。如何寻找一种安全、低能耗、高效的秸秆处理方式，对秸秆的资源化利用具有重要意义。

现阶段国内外针对农作物秸秆处理主要集中于物理、化学、生物处理三大方向。其中，物理处理方法主要是通过外在机械力，例如机械粉碎、高温热解、高强度辐射等破坏纤维素、半纤维素及木质素的粘合力，使得物料破碎化，增强表面积，降低结晶度。作为生物处理的预处理阶段，进一步增大微生物与纤维素的接触面积、接触几率，进而提高了酶解速率。该处理方法，工艺简单、操作粗暴，一般作为预处理增强秸秆接触表面积；化学处理主要是指通过酸碱分解反应、氧化溶解反应、有机溶解反应等对纤维素进行溶解，破坏其与半纤维素及木质素的粘合力和结晶性，进而增加消化性。由于化学处理涉及较多的酸碱反应，导致处理过程中产生的废渣、废液难以回收处理，进而导致环境污染。同时，由于其操作简单、效率较高的优点，近年来科研人也进行了详细的研究，以求提高秸秆处理的效率，实现资源化利用；生物处理主要以微生物为主，利用微生物的产酶降解特性和生物降解过程，在最优条件下对作物秸秆进行发酵降解，进而实现资源化利用。相对比物理和化学方法，其专一性较强，对环境污染较小，成本低廉，目前受到科研人员的青睐。然而，由于环境苛求的差异、产酶活性的低效及作用时间较长，在实际过程中能够降解木质素的微生物相对较少，限制了微生物处理的进一步拓展。

随着物化降解和微生物降解研发重点的推进，农作物秸秆资源化利用方式多样，主要包括作物秸秆饲料化、肥料化、原料化等。充分利用秸秆资源，在提高经济效益的同时，逐渐缓解了固体废弃物污染。从固体废弃物堆放—土壤肥力提升—农作物增长—产业循环形成密切的现代农业可持续发展体系。然而，我国秸秆资源利用过程中，存在降解效率低下、产品种类单一、技术水平落后等问题，外加上微生物高效降解基础研究存在瓶颈，导致秸秆在降解过程中效率低下进而影响秸秆资源化利用。同时，由于我国地域辽阔，地区之间生态环境存在异质性，秸秆资源时空破碎化严重，进而导致在在不同地区间秸秆降解效率差异，进一步限制了秸秆资源高效利用。我国尚需进一步提升秸秆降解效率研究，提高秸秆资源利用化效率，增强改进利用方式，减缓环境污染，逐级实现秸秆资源绿色化、资源化、减量化、循环化等绿色环保理念。

我国东北地区可收集秸秆产量约1.59×10⁸t，占全国秸秆总量的19.2％，其中以玉米秸秆占比最高，可达30％。玉米秸秆是玉米生产中或成熟后产生的茎、叶等副产品，是通过光合作用产生的天然纤维原料。主要由水分及干物质组成，其中干物质包括无机物(粗灰分)和有机物。有机物主要为粗蛋白和无氮化合物，无氮化合物中以碳水化合物含量最高占干重比80％，包括纤维素30％～40％、半纤维素20％、木聚糖醛酸15％～20％，其次是以木质素15％～18％为主的无氮浸出物，玉米秸秆中纤维素、半纤维素、木质素所占比重较大，是秸秆的主要支持组织，也是微生物降解的主要研究对象。因此攻克上述技术难题，研发出能高效讲解能高效降解玉米秸秆的复合菌剂成为本领域技术人员急需解决的技术问题。

发明内容

本发明就是为了解决上述技术问题，而提供了一种能高效降解玉米秸秆复合菌剂的制备方法，它具有降解效率高，绿色环保，起温速度快，不污染环境的特点。

为了解决上述技术问题，本发明是通过下述技术方案实现的。

一种能高效降解玉米秸秆复合菌剂的制备方法，它包括下述步骤：

(1)、取绿色木霉菌、枝孢菌和镰刀菌分别接入牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在30℃、120r/min摇床培养12小时，得绿色木霉菌培养液、枝孢菌培养液和镰刀菌培养液，备用；

(2)、分别取步骤(1)制备的枝孢菌培养液和镰刀菌培养液均以质量百分比为5％的比例分别转接到发酵培养基中，在30℃条件下、120r/min摇床培养，培养24小时，使得活菌数不少于1×10⁸个/ml，得枝孢菌发酵液和镰刀菌发酵液，备用；

(3)、取步骤(1)制备的绿色木霉菌培养液以质量百分比为5％的比例转接到改良PDA培养基营养液内，在30℃、120r/min摇床培养48小时，然后采用菌饼接种法，在操作台中用接种针把生长旺盛的整个菌饼接入筛选培养基，在相同条件下培养24h，使得活菌数不少于1×10⁸个/ml，得绿色木霉菌发酵液，备用；

(4)、取步骤(2)和(3)中制备的枝孢菌发酵液、镰刀菌发酵液、绿色木霉菌发酵液按体积比为1:1:1的比例混合均匀，得混合发酵液；(5)取步骤(4)制得的30质量份数的混合发酵液，加入灭菌并过80目筛的9质量份数的玉米秸秆、1质量份数的小麦麸皮混匀后置于30℃条件下发酵，每隔4h上下翻动一次，直至培养72h，制得秸秆高效降解复合菌剂。

优选的上述的牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备方法如下：取牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、琼脂18g、水1000ml混合均匀，于0.1MPa，121℃下灭菌25min，即得。

优选的上述的改良PDA培养基营养液的制备方法如下：取马铃薯200质量份、羧甲基纤维素钠20质量份、琼脂15-20质量份、水1000质量份混合均匀，pH自然，于0.1MPa，121℃下灭菌25min，即得。

优选的上述的发酵培养基的制备方法如下：取羧甲基纤维素钠5质量份、磷酸二氢钾0.1质量份、硫酸铵2质量份、七水硫酸镁0.5质量份、氯化钙0.01质量份、七水合硫酸亚铁0.005质量份、氯化钠0.01质量份、硫酸锰0.0016质量份、七水硫酸锌0.0014质量份混合均匀，于0.1MPa，121℃下灭菌25分钟，即得。

优选的上述的筛选培养基的制备方法如下：取羧甲基纤维素钠15质量份、琼脂17质量份、磷酸二氢钾1.0质量份、硝酸钠3质量份、氯化钾0.5质量份、七水硫酸镁0.5质量份、七水合硫酸亚铁0.01质量份、水1000质量份混合均匀，于0.1MPa，121℃下灭菌25分钟，加入已灭菌2％去氧胆酸钠20mL和10,000U/mL链霉素溶液3.3mL，即得。

由于采用上述技术方案，使得本发明具有如下优点和效果：

本发明具有降解效率高，绿色环保，不污染环境的特点。本发明方法获得的能高效降解玉米秸秆复合菌剂能在15摄氏度条件下快速启动玉米秸秆堆肥堆生产生物有机肥，起温速度快，较快进入堆肥高温期，它能减少农业面源污染的风险，达到节能的目的。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行作进一步详细说明。以下实施例仅为本发明的几个具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述的实施例中的百分含量(％)如无特别说明，均为质量百分含量。

为了解决上述技术问题，本发明是通过下述技术方案实现的。

实施例1

一种能高效降解玉米秸秆复合菌剂的制备方法，它包括下述步骤：

(1)、取绿色木霉菌、枝孢菌和镰刀菌分别接入牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在30℃、120r/min摇床培养12小时，得绿色木霉菌培养液、枝孢菌培养液和镰刀菌培养液，备用；

(2)、分别取步骤(1)制备的枝孢菌培养液和镰刀菌培养液均以质量百分比为5％的比例分别转接到发酵培养基中，在30℃条件下、120r/min摇床培养，培养24小时，使得活菌数不少于1×10⁸个/ml，得枝孢菌发酵液和镰刀菌发酵液，备用；

(3)、取步骤(1)制备的绿色木霉菌培养液以质量百分比为5％的比例转接到改良PDA培养基营养液内，在30℃、120r/min摇床培养48小时，然后采用菌饼接种法，在操作台中用接种针把生长旺盛的整个菌饼接入筛选培养基，在相同条件下培养24h，使得活菌数不少于1×10⁸个/ml，得绿色木霉菌发酵液，备用；

(4)、取步骤(2)和(3)中制备的枝孢菌发酵液、镰刀菌发酵液、绿色木霉菌发酵液按体积比为1:1:1的比例混合均匀，得混合发酵液；(5)取步骤(4)制得的30质量份数的混合发酵液，加入灭菌并过80目筛的9质量份数的玉米秸秆、1质量份数的小麦麸皮混匀后置于30℃条件下发酵，每隔4h上下翻动一次，直至培养72h，制得秸秆高效降解复合菌剂。

本实施例中牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备方法如下：取牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、琼脂18g、水1000ml混合均匀，于0.1MPa，121℃下灭菌25min，即得。改良PDA培养基营养液的制备方法如下：取马铃薯200质量份、羧甲基纤维素钠20质量份、琼脂15-20质量份、水1000质量份混合均匀，pH自然，于0.1MPa，121℃下灭菌25min，即得。发酵培养基的制备方法如下：取羧甲基纤维素钠5质量份、磷酸二氢钾0.1质量份、硫酸铵2质量份、七水硫酸镁0.5质量份、氯化钙0.01质量份、七水合硫酸亚铁0.005质量份、氯化钠0.01质量份、硫酸锰0.0016质量份、七水硫酸锌0.0014质量份混合均匀，于0.1MPa，121℃下灭菌25分钟，即得。筛选培养基的制备方法如下：取羧甲基纤维素钠15质量份、琼脂17质量份、磷酸二氢钾1.0质量份、硝酸钠3质量份、氯化钾0.5质量份、七水硫酸镁0.5质量份、七水合硫酸亚铁0.01质量份、水1000质量份混合均匀，于0.1MPa，121℃下灭菌25分钟，加入已灭菌2％去氧胆酸钠20mL和10,000U/mL链霉素溶液3.3mL，即得。

为了进一步说明本发明方法制备的能高效降解玉米秸秆复合菌剂的降解效果，以下通过实验数据进一步进行说明。

试验例1

应用上述实施例1制备的能高效降解玉米秸秆复合菌剂进行试验，过程及结果如下：

试验方法：准备玉米干秸秆2000kg，让物料吃足水分，含水量达到60％左右，具体达到用手握有潮湿感但未有水珠滴下即可；用100L水加入实施例1制得的能高效降解玉米秸秆复合菌剂3.0kg溶解，用喷雾器喷在已湿透的玉米秸秆物料上，把喷过药液的混合物料堆成宽2-3m，高1.5-2m左右的梯形堆垛，用铁锨轻轻拍实，表面用泥封严发酵，肥堆上部呈凹形，以利吸纳天然雨水或肥堆失水时以利人工灌水；15-25摄氏度条件下经过21-28天、25摄氏度以上条件下14-21天发酵即可成优质堆肥，起温速度快，较快进入堆肥高温期。

标准：菌肥活体数0.1×10⁸±0.01×10⁸个/g。保存条件：通风阴凉干燥保存。保存时间10个月。肥料使用有效期不超过6个月。

应用本发明实施例1制得的能高效降解玉米秸秆复合菌剂及上述方法制得的肥料进行试验如下：

按正常耕种条件种植、施用该有机肥作底肥2.0t/亩，可在保证甘蓝正常产量的同时，施有机肥组(采用实施例1能高效降解玉米秸秆复合菌剂及上述方法制得的肥料)及化肥组(三元复合肥50kg/亩；N:P₂O₅:K₂O＝15:15:15)土壤中全氮含量分别比对照组(未施肥)多25.42％，15.11％，全磷含量分别比对照组多130.25％，30.01％，腐殖酸含量比对照组多75.2％，而化肥组与对照组差别不明显。测定亩产发现施有机肥组为3120kg，处理1组为2445kg，对照组为1350kg。

大田作物为甘蓝，亩施用秸秆腐熟肥2.0t,施有机肥组及化肥组(三元复合肥50kg/亩；N:P₂O₅:K₂O＝15:15:15)土壤中全氮含量分别比对照组(未施肥)多25.42％，15.11％，全磷含量分别比对照组多130.25％，30.01％，腐殖酸含量比对照组多75.2％，而处理组1与对照组差别不明显。测定亩产发现施有机肥组为3120kg，处理1组为2445kg，对照组为1350kg，可见增加了土壤中的全氮、全磷及腐殖酸含量25％-130％。

表1：不同施肥方案种植甘蓝产量效应对比表

施肥方案	产量(kg/亩)	增产(％)
			常规施肥(化肥)	2445
实施例1施肥方案	3120	27.6

表2两种不同施肥方式对土壤肥力指标的影响

注：表中不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表3两种不同施肥方式对土壤腐殖酸成分的影响

试验结果：本发明实施例1方法制得的能高效降解玉米秸秆复合菌剂能在环境温度为15℃时起温速度快，第10天进入堆肥高温期，较对照即未使用任何复合菌剂的堆肥堆提前5天，腐熟速度快，而且按正常耕种条件种植、施用本项专利生产的有机肥作底肥，可在提高作物产量的同时，显著增加土壤中的全氮、全磷及腐殖酸含量25％-130％。

试验例2

以下为玉米秸秆降解过程中复合菌群对玉米秸秆的降解能力的试验数据，进一步说明本发明采用复合菌制备降解玉米秸秆复合菌剂的降解优势。

玉米秸秆降解过程中复合菌群对玉米秸秆的降解能力的试验

1、秸秆含量分析

将本发明复合菌群Y-M的菌悬液和枝孢菌Y-6、镰刀菌Y-7、绿色木霉菌Y-R各单菌株的种子液，按5％接种量分别接入玉米秸秆液体发酵培养基中，同时以5％无菌水接入秸秆液体发酵培养基作为空白对照(CK)，每个处理设置3次平行试验，30℃恒温静置培养30d，每天观察菌株秸秆降解情况和生长状况，每隔3d取样，测定秸秆失重率。发酵30d内，三株单菌株Y-6、Y-7、Y-R和本发明复合菌群Y-M的秸秆降解率均随着培养时间的延长，呈现逐渐上升的趋势，且各菌株的差异性较大。其中，复合菌群Y-M的降解效果最显著。

由于各菌株之间存在差异性，其秸秆降解率的增长趋势也各不相同。菌株Y-6和Y-R在发酵前期均表现明显的降解效果，第3d的降解率分别为25.31％、18.52％，此阶段由于发酵体系营养物质充足，菌体适应能力强，菌体数量增加，代谢旺盛，降解效果较明显。两株菌的秸秆降解速率快速增加时期分别在9～12d和6～9d，降解率分别由32.86％上升到44.12％和由21％上升到29.94％，随后降解率均保持缓慢增长趋势，并在第30d达到最大值，分别为49.25％、47.29％。发酵后期的降解速率变小，主要是此阶段种内竞争加剧，营养物质不足，菌体数量下降，酶活力值降低，酶促反应速率减小。0～9d，菌株Y-7的降解率增长缓慢，随后迅速增长，并在第12d达到27.12％，这可能是由于此阶段菌体稳定繁殖，酶活力值较高，降解效果明显。12d后降解率呈缓慢上升趋势，与菌株Y-6、Y-R相似，并在发酵30d后，降解率达到45.05％。复合菌群Y-M同样在0～9d降解率增长幅度不大，从第9d开始，由于菌群中各单菌适应了新环境，协同作用明显，降解率开始快速增加，到第21d，降解率上升至61.24％，随后由于菌群内种间竞争加剧，菌体之间争夺食物和空间，数量降低，代谢变缓，酶活力较小，秸秆降解速率降低，第30d的降解率为69.36％。

整体而言，复合菌群对玉米秸秆的降解效果最佳，30d玉米秸秆总降解率高达69.36％，分别比各单菌高20.11％、24.31％、22.07％，比对照组CK高57.76％，且其高效降解阶段的持续时期较长。结合发酵过程中pH值、OD₅₄₀及酶活的变化规律可知，菌株组合后，菌种类型多样、菌群产酶体系全面，菌间通过协同作用共同分解纤维素类物质，提高了秸秆降解效果。

2、秸秆成分分析

将复合菌群Y-M的菌悬液和各单菌株Y-6、Y-7、Y-R的种子液，按5％接种量分别接入玉米秸秆液体发酵培养基，同时以5％无菌水接入秸秆液体发酵培养基，作为空白对照(CK)，每个处理设置3次平行试验，30℃恒温静置培养30d，每隔3d取样，测定玉米秸秆的纤维素、半纤维素以及木质素含量。

随着培养时间的延长，三株单菌株Y-6、Y-7、Y-R和复合菌群Y-M所在发酵体系中玉米秸秆纤维素含量均呈现下降趋势，且各菌株之间有明显差异。其中，复合菌群Y-M、菌株Y-6对纤维素的降解效果较为明显，其次为菌株Y-R，这与各菌株玉米秸秆总降解效果顺序一致。由于各菌株存在差异，对纤维素的降解速率也有所差别。从整体来看，发酵前期和后期降解速率缓慢，发酵中期降解速率较快。在发酵初期0～6d，三株单菌株Y-6、Y-7、Y-R和复合菌群Y-M的纤维素降解速度均较缓慢。第6d时，在各菌株的作用下，纤维素含量分别由初始的41.85％下降至36.61％、39.92％、40.30％、29.62％，随后菌株Y-6、Y-7和复合菌群Y-M均进入纤维素的主要降解时期，降解速率开始增加，第15d，纤维素含量分别下降至30.27％、33.19％、17.57％，此时纤维素总降解率分别为27.67％、20.69％、58.02％。菌株Y-R的主要降解时间为6～12d，纤维素含量下降至30.55％，第12d纤维素的总降解率为27.00％。此阶段，各菌株代谢旺盛，酶活性高，营养物质充足，利于降解。从第15d后，各发酵体系中纤维素的含量呈现缓慢下降趋势，一直到第30d，菌株Y-6、Y-7、Y-R及复合菌群Y-M所在发酵体系中玉米秸秆纤维素含量分别下降至25.12％、27.32％、25.33％、16.52％，总降解率分别为39.98％、34.72％、39.47％、60.52％。发酵后期，由于营养物质和空间不足，菌种间或者种内竞争，加上代谢产物增多，不利于菌体生长，产酶速率下降，降解速度变慢。综上可知，菌群Y-M的对纤维素降解效果最佳，纤维素总降解率分别比CK、菌株Y-6、Y-7、Y-R高55.42％、20.54％、25.80％、21.05％，各菌株纤维素降解效果大小关系为：Y-M＞Y-6＞Y-R＞Y-7。

随着培养时间的延长，三株单菌株Y-6、Y-7、Y-R和复合菌群Y-M所在发酵体系中玉米秸秆半纤维素含量也都呈现下降趋势，且各菌株之间具有明显差异。其中，复合菌群Y-M、菌株Y-6对半纤维素的降解效果较为明显，其次为菌株Y-7。菌株Y-7对半纤维素的降解效果优于纤维素，这可能是由于菌种Y-7产生能降解半纤维素的酶相对较多，降解效果相对明显。由于各菌株存在差异，半纤维素的降解速率也有所差别。菌株Y-6、Y-7、Y-R和复合菌群Y-M半纤维素的降解趋势接近，从整体来看，均表现为发酵前期和后期降解速率缓慢，发酵中期降解速率较快。0～3d各菌株的降解变化幅度不大，半纤维素含量由初始的26.71％分别下降至26.18％、25.05％、26.38％、23.61％，总降解率仅10％左右。从第3d起一直到第24d，菌株Y-6、Y-R的降解速率持续上升，秸秆半纤维素含量变化幅度较大，第24d半纤维素含量分别下降至13.95％、17.98％，半纤维素总降解率为47.78％、32.68％。而菌株Y-7的主要降解时间为第3～18d，该期间半纤维素含量下降至16.85％，总降解率为36.92％。复合菌群Y-M的主要降解时期为3～15d。第15d半纤维素含量下降至10.97％，总降解率高达58.93％。发酵后期，由于菌体数量处于衰亡期，酶活力也在较低水平，降解速率呈现下降趋势，第30d培养时间结束时，菌株Y-6、Y-7、Y-R和复合菌群Y-M所在发酵体系中玉米秸秆半纤维素含量分别下降至13.58％、14.85％、15.94％、9.95％，半纤维素总降解率分别为：49.16％、44.40％、40.32％、62.75％。半纤维素的总降解率均高于纤维素。由此可以说明，秸秆中纤维素成分中的半纤维更容易降解。综上所述，菌群Y-M对半纤维素降解效果最佳，半纤维素总降解率分别比CK、菌株Y-6、Y-7、Y-R高51.26％、13.59％、18.35％、22.43％，各菌株半纤维素降解效果大小关系为Y-M＞Y-6＞Y-7＞Y-R。

单菌株Y-6、Y-7、Y-R和复合菌群Y-M对木质素的降解明显低于纤维素和半纤维素。尽管木质素含量持续降低，但降幅微弱。由于缺少木质素酶，单一菌株木质素降解能力较差，复合菌群Y-M对木质素降解能力略高于单一菌株，突出性效果不明显，进一步印证木质素难降解特性。0～6d菌株Y-6、Y-7、Y-R和复合菌群Y-M降解木质素的速率均缓慢增加，第6d，木质素含量分别由11.05％降低至9.83％、10.01％、10.56％、9.53％。木质素降解率为10％左右。6～21d为各菌株及菌群主要的降解时期，该期间木质素含量分别降低至8.56％、8.77％、9.56％、7.01％，木质素总降解率分别为22.53％、20.63％、13.48％、36.56％。第21d直到发酵结束，木质素含量呈现缓慢下降趋势，木质素降解速率明显降低，第30d，菌株Y-6、Y-7、Y-R和复合菌群Y-M所在发酵体系中玉米秸秆木质素含量最终降低至8.01％、8.38％、8.87％、6.89％，木质素总降解率分别为32.40％、24.16％、19.73％、37.65％。以上可知，菌群Y-M对木质素降解效果最佳，木质素总降解率分别比CK、菌株Y-6、Y-7、Y-R高29.41％、5.25％、13.49％、17.92％，各菌株纤维素降解效果大小关系为：Y-M＞Y-6＞Y-7＞Y-R。

总体来说，发酵30d后单菌株Y-6、Y-7、Y-R和复合菌群Y-M对玉米秸秆纤维素三种成分降解程度存在差异性。其中，各单菌株及菌群Y-M对纤维素、半纤维素的降解能力较为明显，且复合菌群Y-M对这两种纤维素成分降解效果均高于各单菌株。结果表明，菌群分泌的酶系类型多，菌间协同共存，对秸秆纤维素、半纤维素都有较好的降解能力。尽管复合菌群对木质素的降解率高于各单菌，但由于木质素结构复杂，且菌株中缺少木质素酶，总体效果不明显。表明菌株产木质素酶的能力对降解秸秆中木质素成分具有重要作用。3、玉米秸秆木质成分结构分析

为了从表层结构上观察各单菌株及复合菌群Y-M对玉米秸秆降解的效果，本实验采用扫描电子显微镜(SEM)观察玉米秸秆降解30d前后的结构变化。

未经处理的玉米秸秆结构整齐，上面覆盖一层清晰可见的蜡质层，表面光滑，表皮毛完整的镶嵌在秸秆表面。物理处理30d后的玉米秸秆，仅有边缘表皮部分脱离，其整体结构依然整齐完好。菌株Y-6处理后的玉米秸秆，表面的蜡质层结构大部分已经被破坏并伴有碎片化脱落，细胞壁也出现了较大范围的破损，菌株进入玉米秸秆的内部进行降解，整个秸秆呈现松散的组织结构。菌株Y-6处理后的玉米秸秆，表皮结构破裂，出现较多孔洞，部分纵向裂纹和小断裂段，有利于菌丝进入秸秆内充分降解内部结构。菌株Y-R处理后的玉米秸秆，表面由原来光滑整齐的结构变成无定形状态，秸秆结构松散，纤维外层出现大片脱落，菌丝贯穿、覆盖在秸秆表面，并分泌纤维素酶物质，对秸秆木质纤维素成分进行降解。而复合菌群Y-M处理后的玉米秸秆，秸秆表皮结构严重破坏，表皮脱落明显，出现大量分解孔洞，总体呈现膨松化严重的碎片状结构，内部结构明显纤细化，增大了纤维的表面积，表明菌体已经完全进入秸秆内部，分泌大量降解酶，进而降解内部木质纤维素。

整体来看，单菌株对玉米秸秆均有不同程度的降解作用，但复合菌群Y-M处理后的玉米秸秆，结构破损最为严重，表明复合菌群产酶体系分泌较多的纤维素酶和木质素酶，有效地降解秸秆中的各化学组分，进而提高秸秆降解率。

4、盆栽模拟秸秆还田实验

秸秆还田试验中，玉米秸秆降解率随时间的变化。随着培养时间的延长，经各菌株及菌群Y-M处理后的秸秆降解率均呈现逐渐增加的趋势，先大幅度增加后缓慢增加，且不同处理存在差异。复合菌群Y-M的降解效果最为显著，其次为菌株Y-6、Y-R、Y-7。

由于各菌株存在差异，秸秆降解速率也有差别。复合菌群Y-M的初始降解率较高，15d的降解率达到36.67％，分别比CK、菌株Y-6、Y-7、Y-R高33.22％、14.88％、17.33％、22.27％。经过60d的盆栽试验，菌株Y-6、Y-7、Y-R及复合菌群Y-M的总降解率分别为：34.32％、30.67％、29.56％、55.46％。复合菌群Y-M的玉米秸秆降解效果最佳，总降解率分别比CK、菌株Y-6、Y-7、Y-R高47.05％、21.14％、24.79％、25.90％。

综上所述，本试验于室外环境25～30℃，进行秸秆还田试验，复合菌群Y-M的秸秆降解效果最佳。

作物秸秆是农业生产活动中被遗弃的资源。农业生产用于资源化、减量化、循环化的秸秆仅占产量的30％，大多数秸秆以焚烧、堆砌等方式而被遗弃，资源浪费的同时而进一步造成生态环境问题。由于其涵盖以纤维素、半纤维素为主的生物资源，逐渐引起众多研究人员的关注。如何寻找一种安全、低能耗、高效的秸秆处理方式，对秸秆的资源化利用具有重要意义。基于上述科学问题，本发明以玉米农田土壤为菌源材料，选取玉米秸秆为碳源，通过富集、浓度梯度稀释法分离纯化、刚果红染色等方法，从玉米农田土壤中，筛选出高效纤维素降解菌并将其组合成复合菌群，研究其产酶特性，液态发酵降解秸秆试验分析复合菌群的纤维素酶活性及玉米秸秆降解能力，并通过模拟大田试验，综合探索玉米秸秆实际降解能力，旨在为解决环境污染及我国东北地区农业秸秆资源的高效利用提供理论依据和实践参考。

本实验将筛选获得的真菌及实验室保存的优势菌株绿色木霉菌进行拮抗试验，并将无拮抗作用的菌株进行复配组合，测定各组合菌群酶活力，最终筛选了一组互相无拮抗作用且酶活力中较高的复合菌群Y-M。复合菌群Y-M的酶活力均高于各单菌酶活，表明菌群中多种酶系协同作用好。通过实验数据得出复合菌群通过多种酶系通过协同作用，表现为总体酶活力显著提高，降解能力更高。

构建复合菌群后，菌株对培养环境的适应程度、代谢产物、产酶类型及酶促反应速率都发生变化。本试验将复合菌群Y-M接种到液体产酶培养基中进行培养，确定了其最佳培养时间为4d、最适培养温度为30℃、最适初始pH为7.5、最佳产酶接种量为5％。在该优化条件下，复合菌系对秸秆有较高的降解能力。产酶量是决定微生物秸秆降解效果的一个关键指标，不同菌株的产酶情况不同，组合成复合菌群后的最佳产酶条件也有差异。通过优化菌群的产酶条件，可以改善菌群系统中酶系稳定性和活力。

发明人通过的液体发酵降解玉米秸秆试验，研究复合菌群Y-M在发酵过程中酶活力的变化、秸秆降解率及秸秆三种纤维素成分的含量变化，确定其降解效果。液体发酵降解玉米秸秆试验显示，复合菌群Y-M的CMC酶活、FPA酶活、β-葡萄糖苷酶活力的峰值均远高于各单菌株酶活力的峰值。复合菌群Y-M对玉米秸秆的降解效果高于单一菌株，秸秆总降解率达到66.57％，分别比各单菌株Y-6、Y-7、Y-R高6.56％、24.36％、12.05％；复合菌群Y-M对玉米秸秆三种纤维素成分降解效果均高于各单菌株，纤维素、半纤维素、木质素的总降解率分别为39.23％、57.69％、25.79％，降解效果优于单菌株。复合菌群的秸秆降解效果及对各组分降解程度均高于单菌株，进一步说明菌株组合后，菌种类型多样、菌群产酶体系全面，菌间通过协同作用共同分解纤维素类物质，提高秸秆降解效果。

结果表明，复合菌群Y-M的玉米秸秆降解效果明显高于各单菌株，试验玉米秸秆总降解率达到55.34％，分别比CK、菌株Y-6、Y-7、Y-R高46.93％、5.02％、14.67％、6.78％。复合菌群的秸秆降解效果明显高于单菌株，菌株组合后，菌种微生物多样性提高、丰富度增加，菌间通过协同作用显著，提高秸秆降解效果。

Claims (5)

1.一种能高效降解玉米秸秆复合菌剂的制备方法，其特征在于它包括下述步骤：

（1）、取绿色木霉菌、枝孢菌和镰刀菌分别接入牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在30℃、120r/min摇床培养12小时，得绿色木霉菌培养液、枝孢菌培养液和镰刀菌培养液，备用；

（2）分别取步骤（1）制备的枝孢菌培养液和镰刀菌培养液均以质量百分比为5%的比例分别转接到发酵培养基中，在30℃条件下、120r/min摇床培养，培养24小时，使得活菌数不少于1×10⁸个/ml，得枝孢菌发酵液和镰刀菌发酵液，备用；

（3）取步骤（1）制备的绿色木霉菌培养液以质量百分比为5%的比例转接到改良 PDA 培养基营养液内，在30℃、120r/min摇床培养48小时，然后采用菌饼接种法，在操作台中用接种针把生长旺盛的整个菌饼接入筛选培养基，在相同条件下培养24 h，使得活菌数不少于1×10⁸个/ml，得绿色木霉菌发酵液，备用；

（4）取步骤（2）和（3）中制备的枝孢菌发酵液、镰刀菌发酵液、绿色木霉菌发酵液按体积比为1:1:1的比例混合均匀，得混合发酵液；

（5）取步骤（4）制得的30质量份数的混合发酵液，加入灭菌并过80目筛的9质量份数的玉米秸秆、1质量份数的小麦麸皮混匀后置于30℃条件下发酵，每隔4h上下翻动一次，直至培养72h，制得秸秆高效降解复合菌剂。

2.根据权利要求1所述的一种能高效降解玉米秸秆复合菌剂的制备方法，其特征在于所述的牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备方法如下：取牛肉膏 3g、氯化钠5g、蛋白胨 10g、琼脂18g、水1000ml混合均匀，于0.1MPa，121℃下灭菌25min，即得。

3.根据权利要求1所述的一种能高效降解玉米秸秆复合菌剂的制备方法，其特征在于所述的改良PDA培养基营养液的制备方法如下：取马铃薯200质量份、羧甲基纤维素钠 20质量份、琼脂15-20质量份、水1000质量份混合均匀，pH自然，于0.1MPa，121℃下灭菌25min，即得。

4.根据权利要求1所述的一种能高效降解玉米秸秆复合菌剂的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基的制备方法如下：取羧甲基纤维素钠5质量份、磷酸二氢钾0.1质量份、硫酸铵 2质量份、七水硫酸镁0.5质量份、氯化钙0.01质量份、七水合硫酸亚铁0.005质量份、氯化钠0.01质量份、硫酸锰 0.0016质量份、七水硫酸锌0.0014质量份混合均匀，于0.1MPa，121℃下灭菌25分钟，即得。

5.根据权利要求1所述的一种能高效降解玉米秸秆复合菌剂的制备方法，其特征在于所述的筛选培养基的制备方法如下：取羧甲基纤维素钠15质量份、琼脂17质量份、磷酸二氢钾1.0质量份、硝酸钠3质量份、氯化钾 0.5质量份、七水硫酸镁0.5质量份、七水合硫酸亚铁0.01质量份、水1000质量份混合均匀，于0.1MPa，121℃下灭菌25分钟，加入已灭菌2%去氧胆酸钠20 mL和10,000 U/mL链霉素溶液3.3 mL，即得。