CN1309821C - 以木霉菌为主的微生物菌群在秸杆降解中的应用 - Google Patents

Abstract

以木霉菌为主的微生物菌群在秸秆降解中的应用。本发明涉及一种含有木霉菌、青霉菌微生物菌群在秸秆降解中的应用。现有的秸秆的数量巨大，如果处理不及时，而且会成为玉米螟的越冬场所。本发明是将木霉菌为主的微生物菌群应用于秸秆降解。本发明的应用过程中秸秆含水在50%以上，降解时的温度在50-60℃为好，应当在有养的状态下进行。首先将木霉+青霉+曲霉+固氮菌等接入发酵产酶培养基中，制成菌群。然后按秸秆∶水分∶菌群＝1∶2∶0.001-0.003在自然条件下进行发酵，使得秸秆降解。

Description

以木霉菌为主的微生物菌群在秸秆降解中的应用

技术领域：本发明涉及一种含有木霉菌、青霉菌微生物菌群在秸秆降解中的应用。

背景技术：现有的我市农村每年所产生的农作物秸秆，仅以玉米秆为例，就达800万吨之多，其中有50＇以上的剩余量需要处理·如果对这些玉米秆处理不及时，它们不仅影响正常耕作，而且会成为玉米螟的越冬场所。如果把它们付之一炬，则对环境造成了严重的污染，同时还浪费了秸秆中所蕴藏的宝贵资源和能源。这不符和环保与可持续发展战略的要求，不利于我国社会经济健康、快速的稳定发展。

目前的处理方法是将秸秆中一部分被直接还田。秸秆直接还田对增加土壤肥力有一定的效果。但是需要大量的施用氮肥，否则会造成秸秆腐解与农作物生长争水争肥，致使当年作物减产，而且禾经充分腐熟、灭茵处理，带有大量病菌、虫卵的秸秆施入田间，无异埋下一颗定时炸弹。

发明内容：本发明的目的是提供一种以木霉菌为主的微生物菌群在秸秆降解中的应用，可以有效的、快速的降解现有秸秆纤维，实现有机肥料的有效利用。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

本发明是一种以木霉菌为主的微生物菌群在秸秆降解中的应用。

本发明的应用过程的秸秆含水在50％以上，降解时的温度在50-60℃为好，应当在有养的状态下进行。

所述的以木霉菌为主的微生物菌群在秸秆降解中的应用，所述的木霉菌为主的微生物菌群中包括青霉菌和/或曲霉菌，

所述的以木霉菌为主的微生物菌群在秸秆降解中的应用，所述的木霉菌为主的微生物菌群中含有固氮菌。

1.微生物的收集·分离·纯化

在哈尔滨市地区、大兴安岭地区、吉林长白山地区、新疆天山地区等地的腐烂木块上，农田土壤中及秸秆自然降解的残体上采集样品，保湿运回实验室，将样品置于无菌水中采用逐级梯度稀释的方法至10^-10，取10^-4～10^-7-10于马丁培养基上，27℃条件下，培养真菌，区10^-8～10^-10于牛肉膏细菌培养基上32℃条件下，在上述条件下进行培养细菌。将所分离到的单菌落进行培养以获得纯培养·

经过对所采集的，300多个样本进行反复分离、纯化、共获得菌株92个其中包括真菌73个、细菌16个，放线菌1个·固氮菌2个。

2.菌株的筛选和鉴定

将纯化的92种菌株接种于以玉米秸秆粉为主要基质的固体

培养基中进行烧杯实验，在30℃-35℃条件下培养15天，观察菌株的生长状况及培养基的变色程度，选取菌株生长快、培养基变程度大的菌株作为入选菌种菌株，将该菌种菌株接种于两种复筛培养基中，其一为以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的固体培养基(1％CMC-Na、0.4％(NH₄)₂SO₄、0.2％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄7H₂O、1％蛋白胨、1.6％琼脂)，其二为以滤纸纸浆为主要碳源的固体培养基(0.2％NaNO₃、1％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄·7H₂0、0.05％KCl、0.001％FeSO₄、1.6％琼脂，PH7.0-PH7.2)。

根据菌株的生长速度及CMC-Na和滤纸的液化程度，选出了纤维素等难降解物的降解菌的优良菌株13种见表1。.

经初步鉴定，真菌菌株分属于木霉属{Trichoderma sp}曲霉属(Aspergillus sp)、青霉属(Penicilliumsp)、ZJ-005、ZJ-007、ZJ-011、ZJ-012、ZJ-031、ZJ-033、ZJ-037，细菌菌株分别为：XJ-003、XJ-006、XJ-007、XJ-008、XJ-011、XJ-012。

上述菌株均在纤维素等难降解物的降解和生物转化过程有突出表现，是组成秸秆降解菌群制剂的主体。

本发明的微生物菌群的组成菌种菌株的确定：

a.混合培养方法

我们将筛选的3种纤维素降解真菌进行单独或混合培养，以确定大规模培养时的培养方式3种纤维素降解真菌的处理组合如下

A-木霉    B-青霉    C--曲霉    D-木霉+青霉(共同接入)

E-木霉+曲霉(共同接入)

F--木霉+青霉+曲霉+固氮菌(共同接入)

2·考察纤维素分解菌的单独或混合培养对纤维素酶活力的影响

将6种处理组合分别接入发酵产酶培养基中(1％CMC-Na、0.4％(NH₄)₂SO₄、0.2％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄7H₂0、1％蛋白胨、1.6％琼脂、1％麦芽汁)。隔24小时测量酶活。

b.结果：

如表2所示，72小时时酶活性的差异显著性分析如表3所示，其CMC酶活的动态变化曲线如图1所示，由表3中可以得出在发酵培养72h时D的纤维素酶同其他处理比较为差异极显著，A除了与F相比较为差异显著，同其他处理比较也为差异极显著，由图1所示可得A、D在发酵培养72h后就出现产酶高峰，虽然在后期A的酶活有所上升，D的酶活有所下降，但高于其它处理组，且变化平稳。E、F在发酵培养96h时出现产酶高峰，后期同A相比较无明显差异，但要优于B和c的产酶效果·c在发酵培养168h时才出现产酶高峰。

c.纤维素分解菌单独或混合培养对秸秆降解的影响：

将6种处理组合分别按1∶10接入玉米秸秆粉中，于28C观察其降解速度和表观变化，共观察30天。用8％的甲酸处理降解剩余物。然后用定性滤纸过滤，过滤时用蒸馏水分数次冲冼，将滤纸置于，50℃下烘干至恒重，进行粗纤维利用率的测定。结果如表6所示·

由表4可以看出，所选菌株均可不同程度的降解玉米秸秆中的纤维素，但是木霉与青霉的混合语养表现出明显的协同效应。可以提高纤维素的降解量，玉米秸秆中的纤维素被部分降解后其颜色由黄色转为棕黑色和黑色，产生较强的粘滑感，其中颜色和粘滑感是有机质含量和降解后产糖的一个直观标准，而且加入木霉与青霉混合菌培养的玉米秸秆在经过30天的发酵后已降解至原来体积的32％·而单独加入曲酶或青霉的玉米秸秆则为原来体积的45％左右。这说明采用本发明的混合菌株可加速玉米秸秆的分解速度。

上述结果表明，木霉和青霉菌株混合培养对纤维素的降解能力要明显强于该菌株的单独培养，具有最大的协同效应和优势效应·它与青霉至独培养的CMC酶活相比较可达到差异极显著。

木霉与曲霉，木霉与曲霉+青霉的混合培养虽然同木霉相比差异较小，但比曲霉、青霉的单独培养有较好的降解效果。在实验的过程中，发现培养时间的不同对产酶的影响较大，木霉与青霉的混合培养在72h时达到产酶高峰，而后在近100h内一直保持比较平稳的变化，木霉同曲霉二者混合，木霉同曲霉+青霉三者混合在96h时达到产酶高峰。而后略有上升或下降。这为菌种产酶时间的确定提供了一定的理论依据，防止在实际生产中错过最佳的产酶时机。我们将所远出的优良菌株进行再次复筛，最后确定本发明使用的微生物菌群定为三个系列：JCJ-01(青霉+木莓+其他)、JGJ-02(青霉加木霉)、JGJ-03(青霉加木霉加固氮再加其他)。这三个系列由均包含木霉和青霉，其中，在第三个系列中增加了固氮菌，用来满足秸秆降解物中氯含量的不足·

这个技术方案有以下有益效果：

一、通过发明的方法可以提供大量的有机肥，降解胶合纤维

我国每年农作物秸秆达7亿吨之多，其中玉米秸秆达2.2亿吨。估记每年近有90％的纤维素资源不能被利用，多数被白白地烧掉·近十几年来我国把注意力主要集中在开发植物纤维资源上，以期解决蛋白质资源短缺这一全球问题。目前植物纤维素资源经微生物发酵转化生产蛋白质强化饲料或SCP的研究方面已取得了一定的进展。但这只能利用一小部分的秸秆。剩余的大部分的农作物秸秆都被农民在田里焚烧掉。这样不仅影响环境，而且极大的浪费资源·

秸秆中含有丰富的纤维素和半纤维素。在微生物的作用下，通过好氧发酵过程，可转化为腐殖质，增加了土壤的肥力，促进作物生长。应用高温微生物降解方法对其进行无害化、资源化处理是绿色食品基地大规模生产有机肥的重要途径。但是，由于腐殖质在木质素，纤维素腐解过程中形成，加强木质素·纤维素的腐解变成为秸秆发酵充分腐熟的关键。农作物中玉米秸秆粗纤维含量达到30-45％。含木质素含量达到9-14％，灰分中硅酸盐达30％。其中纤维素、半纤维素。和果胶质被木质素胶合在一起，木质素和硅酸盐组成细胞壁外壳坚硬光滑，使得其很难被降解，本发明采用复合菌群，能够快速有效的降解这种胶合后的外壳，使其全部成为有机肥。

二、提高资源利用率，创建绿色农业

仅以哈尔滨市为例，郊区农村仅玉米秸秆就达800万吨之多。其中有50％上的剩余量需要处理。用传统的堆肥方法处理农作物秸秆，存在着周期长、有机肥质量难以保证的缺点；作物秸秆传统的焚烧处理方法不仅污染了环境，还浪费了秸秆中蕴藏的宝贵资源和能源，已经越来越不适应社会发展的要求·

此项研究所提供的产品和工艺将能有效地处理各种秸秆，清洁了人类生存环境：并且施用这种优质有机肥还可以生产出品质优良的绿色农产品，捉高农产品的科技含量，在为农民朋友带来可观经济效益的同时又改善了土壤的理化性质，生产绿色食品，必须依靠有机肥，所以，有机肥料在农业生产中所占的比重开始明显增加，而利用固体废弃物生产有机肥不但能解决生产原料短缺的问题，而且对改善环境有很大的帮助。这恰恰满足了生态农业建设和绿色食品基地建设的要求。

三、减少了周期性的病害来源，充分的利用了资源

采用本发明，消除了玉米螟、病菌、虫卵等病害的越冬场所。普通的带菌秸秆施入田间，无异埋下一颗定时炸弹。近年来，各地农业生工中周期性的病虫害与此密切相关。采用本发明的方法，可以避免这种危害。

采用本发明，是将秸秆通过微生物菌群处理后还田，这对增加土壤肥力有一定的效果，避免了秸秆中所蕴藏的宝贵资源和能源的浪费。采用本方法不需要因此补充施用氮肥，不会造成秸秆腐解与农作物生长争水争肥，致使当年作物减产的问题。该项技术可以高速、大量、优质地降解农作物秸秆生产有机肥，是绿色食品生产和生态农业建设的急需产品，同时为停止使用秸秆焚烧这一落后做法提供关键的技术支持。这不仅保护了生态环境，又有利于农业可持续发展，具有巨大的经济效益和社会效益

表1是本发明涉及的微生物的分类和菌的特性。

表2是复合菌群在不同时间的纤维素酶的活力

表3是不同组合的菌群在72小时的酶活力

表4是不同时间降解程度的观察情况

图1是酶活力随时间变化的曲线

图2是本发明涉及的复合菌群的生产流程图

实施例1：

以木霉菌为主的微生物菌群在秸秆降解中的应用。

上述的微生物菌群中可以包括青霉菌和/或曲霉菌。

上述的微生物菌群中可以含有固氮菌。

上诉的微生物菌群中还可以包括表1中的其他微生物、细菌和真菌。

1.菌群准备

本生物菌群的大规模生产由液体发酵和固体发酵过程共同完成·

其中种子纯培养的扩大培养采用液体发酵的形式，菌群的大规模培养采用固体好氮发酵的形式。我们将微生物菌群大规模生产所需要的生产条件用于生产(比如微生物菌群的几种组成方式：青霉和木霉，木霉和曲霉，木霉青霉和固氮菌的组合，含有其他的辅助性的菌株等等，发酵基质的配比·环境条件的调控等均见本发明的内容部分，为了避免文件的重复和臃肿，不再复述)。

针对农作物秸秆中含氯量较少的现象，我们还可以在微生物菌落(真菌·细菌)中增加了固氮菌组成·

而且可以在发酵基质中添加营养液成分，以利于微生物菌中在短时间内大量繁殖，由于我们所采用的基质属于高碳源基质，其倾向于往酸性方向演变，为了达到徽生物充分繁殖和大量合成酶的目的，我们在固体发酵的过程中严格控制其温度和水分，并采取通风和搅拌的方式，在给培养基质以大量氧气的同时，保持其温度在最适宜范围内的一致性，这样有利于营养物质和代谢物的快速分散。每天通过镜检计算微生物数目，当达到我们所要求的菌体数量，每克1亿活菌数时·即可停止发酵，干燥封存，作为本发明应用的菌群，采用该工艺方法可以使活菌数达到最高每克20亿个。

具体流程如图2示。

通过以上的工艺方法，经过5天的培养，所得到的菌群制剂所含活菌数为1-20亿超过同类单品的活菌数量。菌剂呈深褐色·含水量为30％左右。

应用过程：

所用秸秆材料为玉米秸秆，用切草机将其粉碎成生-3mm的小段。分别设置两个发酵池，每池的堆制体积为：3×3×10.2m³、

其成分比例为：秸秆·水分·菌群＝1∶2∶0.001-0.003在自然条件下进行发酵，I池每3天翻动一次。II池每7天翻动一次，每两天观察一次结果，分别测定表层·中层·底层的温度，pH值，每4天取样测定其微生物量和微生物种类，分析环境条件对菌群生长和秸秆降解的影响·

1，水分对微生物降解效果有重大的影响，应当达到或者超过50％

对于好氧发酵工艺而言，在实验期间，充足的水分是必须的。

在I池的试验初期，含水率在40％下，只有表层水分充足，可观察到由于大量菌体生长，秸秆五天内即变棕褐色，而堆层的中部和底部较干，秸秆几乎处于原始状态未见到降解现象。而且，中部和底部的温度始终远远低于表层的温度，在35℃以下，使得高温菌无法发挥作用，阻碍了降解的速度。在半个月后的翻动过程中，我们将水分补足，秸秆的含水率保持在60％左右，此时堆温开始升高，达到50℃以上。在微生物的作用下，秸秆降解加快。

而I池中，水分一直很充足，含水率在65％。第二天堆温就升到60C，堆层的菌体丰富，秸秆很快就变为棕褐色·

可见水分在整个秸秆降解过程中起着很重要的作用。

只有在保证秸秆水分充足的条件下，才能使行降解，随着降解和生物转化的进行，秸秆在微生物作用下被降解产生水分。

从三种菌剂的微生物数目中我们可以得到C处理相对于A·B处理要多出一个数量级，活菌数远远超出A·B处理。菌体数量的多少决定着秸秆降解的速度和生物转化的质量·

从降解过程表观现象的观察中我们可以看出，在菌剂加入的最初阶段，A、B处理较早地进入发酵阶段，秸秆表面长有白色菌丝，并且颜色有所改变，这是秸秆开始降解的表现，但随着时间的延续，A、B、C处理的差别逐渐缩。，而且C处理中有大量的孢子分生，这是我们菌剂中霉菌的作用，孢子的发散有利于菌剂在降解物中迅速繁殖。增加降解速度。

通过对降解产物进行营养成分分析，C处理的有机质含量、全氮、全磷、全钾的含量在三种处理中均处于最高水上。而且其中有机质含量远超出NY/T304-1995的规定，AA级肥料所应含有的有机质含量(35％)。

根据这三种菌剂的菌体数量、降解过程中被作用对象的表现及降解产物的营养成分的分析，可以认定，本发明的降解菌群的降解效果优于国外的同类产品。并且廉价易得。

综上所述，申请人从哈尔滨市地区·大兴安岭地区·新疆天山地区进行野外采集共获得菌株106个其由包括真菌79个，细菌27个，经过对采集菌种的筛选，得到对秸秆具有较强降解能力的优良菌株13株，然后，又对其中的三种真菌进行不同菌株配比组合试验，得出本发明应用的菌群，经过田间试验可以认定，菌种的混合培养会提高菌株的产纤维素酶能力，而且产酶高峰时期有所提高，这为后期菌种大规模培养提供了一种可操作模式。我们可以在5天内生产出活菌数超过2亿的优良菌群，用于本发明的用途。

2.氧气的存在和温度对本发明的实现也有重大的影响。

在秸秆降解的中试实验过程中，环境条件对菌群的生长和秸秆降解具有决定性的影响，在秸秆降解过程中，尤其在生产过程中，一定注意水分的问题，以确保微生物的的正常生长。另外，提供充足的氧气是好氧发酵成功的重要因素。在发酵过程中起重要作用的是其中的好氧微生物菌群，如在降解期间，氧气不充足，就会影响微生物的正帝生长，甚至造成他们的大量死亡，延长了降解时间，开降低了发酵的质量，所以，通过通风散热来调解调节温度的平衡是影响发酵效的关键所在。在高温期时，应控制堆层的温叟保持在50-60℃以内·这样会保存大量有降解纤维素能力的真菌，加快降解速度。

本实施例所使用秸秆降解有机肥为中试试验产品，在肥料的制作过程中委添加任何化学有机成分和其它配料，其中有机质含量已远远超出黑龙江省绿色肥料质量标准，在该肥料的实际生产中还可以加入其它添加剂成分，用以增加其中的氮、磷、钾含量、矿质元素含量矿物质元素的含量和微量元素的含量。田间试验效果明显，表明在经受严重灾害后土地上该肥的施用对农作物有增产增收的良好效果，且该肥的应用可以在根本上改善土壤的理化性质，保持土壤的长期可持续利用，为国家和农民带来可观的经济利益。

分类代码	分类	形态观察	菌属显微特性
				ZJ-005	曲霉菌Aspergillus	菌落呈纯黑色，粉末状，初期为黄白色，后逐渐变黑色，菌落生长较慢，约10天后菌落直径达9Cm，难挑取	菌丝有格，多核、多分枝，无性孢子为分生孢子，生于菌丝及其分支的顶端，单生或者向内卷生2-6个，呈串珠状，孢子梗不分枝，顶端膨大，有十分发达的无性阶段
ZJ-007	青霉属Penicillium	菌落呈草绿色，背面为黄褐色，菌落生长较快，约4天后菌落直径达9厘米，易挑取	分生孢子梗从菌丝上垂直生出，无足细胞，有横膈膜，顶端排成带状的间枝，顶层为小梗，有小梗再生成分生孢子
				ZJ-011	木霉属Trichoderma	菌落草绿色，呈粉末状分布，反面为黄绿色，质地较疏松，易挑取，菌落成长较快5天后菌落直径达9cm	菌丝密集加毡，分生孢子梗从菌丝侧枝生出，直立，分支，小枝常对生，顶端不膨大，上生分生孢子团，分生孢子球状
ZJ-012	木霉属Trichoderma	菌落草绿色，呈团块状分布，反面为黄褐色，质地较疏松，易挑取，菌落成长较快，5天后菌落直径达9cm	同上
				ZJ-026		深绿色粉末状菌落，结构相对较疏松，反面为黄色，易挑取，菌落初始为白色，后逐渐变为绿色，菌落生长较快，5天后即可长满平板
ZJ-037		绿色蛛网状菌落，反面为黄褐色，质地厚密，易挑取，菌落初始为白色，后逐渐变为绿色，该菌生长较快，5天后菌落直径可达9Cm
				ZJ-031		褐色绒状菌落，反面为黄色，易挑取，菌落初始为白色，后逐渐变为褐色，该菌生长较快，5天后菌落直径可达9Cm
ZJ-033		草绿色粉末状菌落，反面为黄褐色，易挑取，该菌生长较快，5天后菌落直径可达9Cm
				XJ-003		百色乳状菌落，周边光滑，菌落向四周扩散生长
XJ-006		菌落无色，并较干燥，菌落周边不均匀，菌落向周围扩展
				XJ-007		白色乳状菌落，周边光滑
XJ-008		乳白色乳状菌落，周边光滑，菌落向四周扩散生长
				XJ-011		白色乳状菌落，周边不光滑，呈疏齿状，菌落向四周扩散增长，菌落较厚
XJ-012		白色菌落，表面较干燥、周边光滑
				XG002	固氮菌	乳白色乳状菌落，周边光滑	细胞大，短粗杆状，单生有鞭毛能游动

表1  难降解物降解菌的优秀菌株

表2  纤维素降解菌株(群)在不同培养时间的纤维素酶活力(μ)

	时间
								菌株(群)	48h	72h	96h	120h	144h	168h	216h
A	0.213	2.207	2.413	2.448	2.467	2.551	2.222
								B	0.183	0.160	0.282	0.168	0.809	1.413	0.886
C	0.098	1.454	1.848	2.131	2.230	2.154	1.818
								D	1.619	3.116	2.890	2.918	2.917	2.918	2.788
E	0.901	1.756	2.177	2.299	2.327	2.329	2.258
								F	1.266	2.000	2.300	2.392	2.589	2.527	2.100

表3  不同组合在72小时纤维素酶活显著性分析

菌株(群)	72小时纤维素酶活	显著性分析
				5％	10％
		D	0.386			a	A
A	0.296			b	B
		F	0.255			bc	BC
E	0.210			d	CD
		C	0.194			d	CD
B	0.001			e	E

表4  不同时间降解度的观察

项目	菌株(群)
					A	B	C	D
	粗纤维残余量(％)	36	52	51					32
变色程度					黑色	棕黑色	棕黑色	黑色
	体积减少量(％)	60	54	55					68

Claims (1)

1.高效降解寒地农作物秸秆生成有机肥的发酵培养方法，包括以下步骤：

(a)将农作物秸秆粉碎成3mm的小段，置入发酵池中；

(b)将发酵池中秸秆的含水率保持在60％左右；

(c)接入秸秆降解木霉和青霉菌以及固氮菌，将发酵温度保持在50℃-60℃的范围，在发酵过程中进行通风以便散热、增氧，通过所述菌种之间的特有的协同作用加速降解纤维素，增加有机物含量；

从而将农作物秸秆快速转化生成优质有机肥。

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