CN102154159B

CN102154159B - 防治番茄根结线虫的拮抗菌及其微生物有机肥料

Info

Publication number: CN102154159B
Application number: CN2010106101154A
Authority: CN
Inventors: 沈其荣; 肖同建; 冉炜; 李�荣; 杨兴明
Original assignee: JIANGSU XINTIANDI BIO-FERTILIZER ENGINEERING CENTER CO LTD; Nanjing Agricultural University
Current assignee: JIANGSU XINTIANDI BIO-FERTILIZER ENGINEERING CENTER CO LTD; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2010-12-29
Filing date: 2010-12-29
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2030-12-29
Also published as: CN102154159A

Abstract

本发明涉及防治番茄根结线虫的拮抗菌和利用其生产的微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。固体发酵拮抗菌X5和有机肥制成微生物有机肥，肥料中含有1×10⁸个/g以上的拮抗菌、全氮4~5%，总氮磷钾6~10%、有机质30~35%。试验表明，菌株X5的菌体和过滤液对根结线虫胚胎发育过程都具有显著的破坏作用，虫卵孵化率减少34%，对二龄幼虫致死率达到73%。该微生物有机肥料施入土壤后能够使拮抗菌迅速繁殖，在根结线虫严重的连作土壤中的根结发病指数减少40%，每株卵块数量减少68%，每卵块虫卵数量减少58%。施用本微生物有机肥料能有效防治作物根结线虫的危害。

Description

防治番茄根结线虫的拮抗菌及其微生物有机肥料

一、技术领域

本发明涉及一种防治番茄根结线虫的拮抗菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术，专用于防治番茄根结线虫的危害。

二、背景技术

根结线虫是危害作物的主要土传病害之一。根结线虫在全世界各地和大部分作物上都有发生，每年造成全世界粮食产量和经济收入的巨大损失。根结线虫侵染根系后，严重影响植株根系的发育，出现大量根结现象，导致植株对水分和养分的吸收受阻，植株出现矮小黄化现象。作物连作后，随着连作年限的增加，根结线虫在植物根系中产生大量的虫卵并孵化出来，土壤中二龄幼虫数量逐年积累，危害逐年加重，常造成作物大量减产，甚至死苗。研究结果表明，连作番茄根结线虫病害的关键问题不是养分缺乏或营养不平衡，也不是土壤次生盐渍化问题，而是土壤中的微生物区系变化及其次生代谢物质的致毒问题。

另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等，使大量的养分资源流失于土壤-植物系统之外，不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥生产原料的有机物资源，不利于我国农业的可持续发展。如何将从土壤中因作物收获而取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥料再施入土壤。将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用作功能菌的载体，制成功能明确的微生物有机肥料，具有广阔的应用前景。

三、发明内容

1. 技术问题

本发明的目的是提供一种能防治连作番茄根结线虫的拮抗菌及其微生物有机肥料，使连作番茄根结线虫的根结发病指数减少，使大量的设施农业土壤和露地番茄连作障碍土壤得到较大程度的生物修复，确保集约化农业的顺利发展。

技术方案

能防治连作番茄根结线虫的拮抗菌X5，属于蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），保藏日期 2010年9月14日，保藏号CGMCC 4161 ；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。

拮抗菌X5的主要形态特性为：革兰氏染色阳性G⁺，能运动，有侧生鞭毛，形状为杆状，产芽孢，菌落呈乳白色，圆形，边缘不整齐，表面湿润光滑。

拮抗菌X5的主要生理生化特性：革兰氏染色阳性G⁺，细胞形状为杆状，芽孢中生，接触酶阳性、V.P.反应阴性，甲基红试验阳性，吲哚试验阳性，发酵葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇产酸，能利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性，油脂水解阳性，苯丙氨酸脱氢酶试验阴性。

用上述拮抗菌X5生产的防治番茄根结线虫的微生物有机肥料，该肥料中含有1×10⁸cfu·g^-1以上的拮抗菌、全氮质量比含量为4~5%，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6~10%、有机质质量比含量为30~35%。

所述以上微生物有机肥料的生产方法，包括：

1）拮抗菌X5分别接种到改良的牛肉膏液体培养基，进行发酵生产，其发酵生产的条件为：pH 6.8~7.5, 培养温度30~35℃，搅拌速度为180~300 rpm，发酵中后期形成芽孢，发酵液中的拮抗菌含菌或芽孢量≥1×10¹⁰ cfu·ml^-1；改良的牛肉膏液体培养基的配制方法：称量2.0克牛肉膏，玉米粉5.0克，麦麸5.0克，土豆淀粉5.0克，氯化钠5.0于烧杯中，搅拌，使之充分溶解混匀，pH值调至7.2~7.4，并用自来水定容至1000 ml，121℃灭菌20 min。

2）将拮抗菌X5发酵液与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入X5发酵液55L，混合均匀，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50℃，发酵5天后结束，使拮抗菌X5含量达到1×10⁸cfu·g^-1以上，获得含拮抗菌X5的微生物有机肥。将此微生物有机肥在低于60℃下干燥至30%的含水量，包装出厂即为能防治番茄根结线虫的微生物有机肥。其中：

腐熟后的猪粪堆肥：发芽指数为98%以上,有机质质量比含量≥35%，有机氮质量比含量为1.2~2%，含水量质量比25~30%。

菜粕微生物酶解物的制备方法：将保藏号为CGMCC NO.1543的嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55~65%和pH 6.0~7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35~50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55~65%和6.0~7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕微生物酶解物；

腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制备方法：将腐熟的猪粪堆肥与菜粕微生物酶解物按体积比50~70%∶50~30%的比例充分混合，并后熟2~3天，后熟过程中翻堆2次。

用上述拮抗菌X5微生物有机肥料专用于防治番茄根结线虫病。

有益效果

本发明涉及一种能克服或防治连作番茄根结线虫的微生物有机肥料及其生产方法，其产品具有如下优点：

1）肥料产品中含有抑制番茄根结线虫生长的高效拮抗菌株X5，其抑制效果显著，肥料中该菌株的含量达到1×10⁸cfu·g^-1以上，施入土壤后能形成优势群，并在土壤中存活下来。

2）肥料产品中含有丰富的可溶性有机碳和有机氮，能给功能菌提供十分优越的生长环境，极大地提高了功能菌在土壤中的定殖和活力。

3）本发明产品全磷和全氮含量较高，均达到4%。本产品原料之一为腐熟的猪粪堆肥，全磷和有效磷含量高，在制成的微生物有机肥料产品中无需添加任何含磷化肥，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。本产品原料之一为菜粕微生物酶解物，不仅全氮含量高，而且含有丰富的氨基酸和小分子多肽，确保了肥料氮素持续稳定的供应，使作物生长和抗逆能力大大增强。

4）研究结果表明，在根结线虫危害严重的土壤上施用本产品后，番茄根结指数减少40%，每株卵块数量减少68%，每卵块虫卵数量减少58%，并且植株长势良好。连续施用本肥料可有效控制根结线虫病害的发生。

四、附图说明

图1拮抗菌X5

a产胶原蛋白酶；b菌体电镜观察结果

图2 拮抗菌X5对根结线虫虫卵胚胎发育的影响（A、B、C、D为虫卵孵化过程四个阶段）

a 菌株X5菌体处理后虫卵结构变化

b 菌株X5上清液处理后虫卵结构变化

c 无菌水处理后虫卵结构变化

图3 拮抗菌对虫卵孵化率的影响

图4 拮抗菌对二龄虫死亡率的影响

五、具体实施方式

（一）菌株的分离和鉴定

拮抗菌株的获得：从番茄根结线虫发病田块中的健康番茄植株根际土壤初筛能产生胶原蛋白酶的拮抗菌株（图1），然后通过盆栽试验复筛进一步验证拮抗菌株X5生防效果（表1），最终获得拮抗菌X5并进行鉴定，菌种冻干-20℃保存。该菌在肉牛膏液体培养基发酵60 h后，其过滤液对根结线虫虫卵胚胎的正常发育有显著的破坏效果，阻碍虫卵的正常孵化（图2），并且能降低虫卵孵化率（图3）和对二龄幼虫有直接致死作用（图4）。

拮抗菌X5属于蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），主要生物学特性为革兰氏染色阳性G⁺，细胞形状为杆状，芽孢中生，兼性厌氧生长，接触酶阳性，V.P.反应阴性，甲基红试验阳性，吲哚试验阳性，发酵葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇产酸，能利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性，油脂水解阳性，苯丙氨酸脱氢酶试验阴性。

（二）菌剂生产

1）拮抗菌X5分别接种到改良的牛肉膏液体培养基，进行发酵生产，其发酵生产的条件为：pH 6.8~7.5, 培养温度30~35℃，搅拌速度为180~300 rpm，发酵中后期形成芽孢，发酵液中的拮抗菌含菌或芽孢量≥1×10¹⁰ cfu·ml^-1；改良牛肉膏液体培养基的配制方法：称量2.0克牛肉膏，玉米粉5.0克，麦麸5.0克，土豆淀粉5.0克，氯化钠5.0克于烧杯中，搅拌，使之充分溶解混匀，pH值调至7.2~7.4，并用自来水定容至1000 ml，121℃灭菌20 min。

腐熟后的猪粪堆肥：由江苏新天地生物肥料工程中心有限公司提供，本品发芽指数为98%以上,有机质质量比含量≥35%，有机氮质量比含量为1.2~2%，含水量质量比25~30%。

菜粕微生物酶解物的制备方法（公知公用，见发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品）：将保藏号为CGMCC NO.1543的嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55~65%和pH 6.0~7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35~50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55~65%和6.0~7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕微生物酶解物；

上述能防治番茄根结线虫的微生物有机肥产品中含有1×10⁸cfu·g^-1以上的拮抗菌、全氮质量比含量为4~5%，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6~10%、有机质质量比含量为30~35%。

（三）温室盆栽试验

盆栽试验设置以下处理：

对照: 根结线虫发病土壤；

处理1: 根结线虫发病土壤+不加拮抗菌X5的常规“田娘”牌有机肥；

处理2: 根结线虫发病土壤+拮抗菌X5菌悬液；

处理3: 根结线虫发病土壤+拮抗菌X5微生物有机肥（本发明产品）。

盆栽试验中，拮抗菌X5菌悬液处理以1×10⁸cfu·g^-1土的剂量均匀拌入根结线虫发病严重的土壤中；本发明肥料产品以2%的施用量（w /w）均匀拌入根结线虫发病严重的土壤中。三天后，将已长有3片真叶的番茄幼苗移入盆钵中，每个处理重复5次。在温室中生长45天（25~30℃）后采样，测定各项指标，统计生物防治效果，整个实验重复3次，盆栽试验结果如表1。

Figure 2010106101154100002DEST_PATH_IMAGE001

盆栽试验结果表明，在根结线虫危害严重的土壤上施用本产品后，番茄根结指数减少40%，每株卵块数量减少68%，每卵块虫卵数量减少58%，并且植株长势良好。说明本产品能有效的抑制连作根结线虫土壤中病害的发生，减少根结线虫对番茄植株的危害，从而促进了植物的健康生长。

（四）大田试验

在安徽省阜阳市阜南县，连作5年的种植番茄田块，以45kg/亩使用量，二个处理每个处理三个重复，每个小区96m²。

大田试验设置以下处理：

对照: 根结线虫发病土壤；

处理2: 根结线虫发病土壤+拮抗菌X5微生物有机肥（本发明产品）

Figure 2010106101154100002DEST_PATH_IMAGE002

大田试验结果表明，在根结线虫危害严重的土壤上施用本产品后，能够显著促进番茄地上部分的生长，比对照和施用常规有机肥增加生物量约36-38%；由于根结线虫侵入根系后根本根系形态结构，增加根结数量，从而也增加了根系的重量，施用笨产品后，能够显著减少根系根结数量，保证了根系的正常发育。根系中卵块和虫卵数量比对照分别减少了83%和63%。连续施用本肥料可有效控制根结线虫病害的发生。

本发明专利从调控根结线虫发病土壤的微生物区系这一关键问题着手，研制出一种能显著降低番茄根结线虫发病率的微生物有机肥料产品，本肥料产品的作用机制在于本肥料产品提供的功能菌能有效抑制根结线虫生长；所制成的微生物有机肥对根结线虫发病土壤中有益微生物区系的培育提供了很好的条件；此外，本肥料产品中含有较高含量的有机氮和有机磷，这些营养物质对连作障碍土壤中作物的生长十分有利，大大提高了植物的抗病能力。

Claims

1.能防治番茄根结线虫的拮抗菌菌株X5，属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏日期2010年9月14日，保藏号CGMCC No.4161；

拮抗菌X5属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，主要形态特性为：革兰氏阳性G⁺，能运动，有侧生鞭毛，形状为杆状，产芽孢，菌落呈乳白色，圆形，边缘不整齐，表面湿润光滑；

生理生化特征：接触酶阳性、V.P.反应阴性，甲基红试验阳性，吲哚试验阳性，发酵葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇产酸，能利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性，油脂水解阳性，苯丙氨酸脱氢酶试验阴性。

2.用权利要求1所述拮抗菌菌株X5生产的微生物有机肥料。

3.根据权利要求2所述的微生物有机肥料，拮抗菌X5数量为1×10⁸cfu·g^-1以上，全氮质量比含量为4～5％，全氮中质量比90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％、有机质质量比含量为30～35％。

4.权利要求2或3所述微生物有机肥料的生产方法，包括：

1)将权利要求1所述的拮抗菌菌株X5接种到改良的牛肉膏液体培养基，进行发酵生产，其发酵生产的条件为：pH 6.8～7.5，培养温度30～35℃，搅拌速度为180～300rpm，发酵中后期形成芽孢，发酵液中的拮抗菌含菌或芽孢量≥1×10¹⁰cfu·ml^-1；改良的牛肉膏液体培养基的配制方法：称量2.0克牛肉膏，玉米粉5.0克，麦麸5.0克，土豆淀粉5.0克，氯化钠5.0克于烧杯中，搅拌，使之充分溶解混匀，pH值调至7.2～7.4，并用自来水定容至1000ml，121℃灭菌20min；

2)将拮抗菌X5发酵液与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入X5发酵液55L，混合均匀，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50℃，发酵5天后结束，使拮抗菌X5含量达到1×10⁸cfu·g^-1以上，获得含拮抗菌X5的微生物有机肥，将此微生物有机肥在低于60℃下干燥至30％的含水量，包装出厂即为能防治番茄根结线虫的微生物有机肥，其中：

腐熟后的猪粪堆肥：发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2～2％，含水量质量比25～30％；

菜粕微生物酶解物的制备方法：将保藏号为CGMCC NO.1543的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55～65％和pH 6.0～7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35～50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55～65％和6.0～7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕微生物酶解物；

腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制备方法：将腐熟的猪粪堆肥与菜粕微生物酶解物按体积比50～70％∶50～30％的比例充分混合，并后熟2～3天，后熟过程中翻堆2次。

5.权利要求2或3所述微生物有机肥料在防治番茄根结线虫病中的应用。