CN103937720B - 一株蜡状芽胞杆菌及其分泌的杀线虫蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株蜡状芽胞杆菌(Bacillus？cereus)其代号为CM7，用于专利程序的保藏编号为CGMCC？No.4233。该菌株的发酵液中存在一种菌体分泌的蛋白物质能杀死线虫，该蛋白能通过硫酸铵沉淀和柱层析分离出来，分子量大小为38.5kD，等电点(pI)为7.77，由376个氨基酸组成。CM7菌株能稳定定殖在番茄等多种植物根内并抑制根结线虫的侵入减少结瘤，根结抑制率在90％以上。因此，该菌株制成的菌剂可以防治植物根结线虫病。

Description

一株蜡状芽胞杆菌及其分泌的杀线虫蛋白

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体是涉及生物防治植物寄生线虫的技术和功能菌株的应用，主要是一株蜡状芽胞杆菌及其分泌的杀线虫蛋白物质在生物防治植物寄生线虫的应用，属于农作物防病技术领域。

背景技术

植物线虫是植物侵染性病原之一，它们寄生在各种植物的根、茎、叶、花、芽和果实上。线虫比其他重要病原---真菌、细菌、病毒等，具有主动侵袭寄主和自行转移为害的特点，它们对植物的危害，除吸取寄主的营养和对植物的组织造成机械的损伤外，主要在于现场的分泌物和唾液等，能引起植物产生一系列的生理病变，从而破坏植物的正常代谢和机能，影响生长和发育，致使植物的产量减少，品质下降，甚至死亡和绝产。根结线虫Meloidogynespp.是严重危害农业生产的一类土传病原，可以寄生于多种农作物，尤其是蔬菜，在热带和亚热带地区造成了严重减产。近年来，随着我国温室蔬菜种植面积不断扩大，蔬菜根结线虫并的发生逐年加重，已经成为无公害温室蔬菜生产的一大障碍。多年来，国内外不断加强对根结线虫的防治工作，包括化学杀线剂的使用、选育抗病品种和生物防治等。由于化学杀线剂的使用会产生农药残留对环境造成污染以及破坏人体健康，而生物防治不会有此问题的产生，有利于环境保护、维护人类健康和维护生态平衡等优点，因此生物防治植物寄生线虫已经成为今年来研究热点。

植物内生细菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各个组织和器官内部、可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生的细菌。研究表明，植物内生细菌可以在植物体内稳定定殖并且自身代谢产物可以影响到植物，因此使其具有促生作用，生防作用，非豆科植物的固氮作用以及作为外源基因的载体等生物学作用。蔡学清等(蔡学清，林彩萍，何红，等.内生枯草芽孢杆菌Bs－2对水稻苗生长的效应[J].福建农林大学学报(自然科学版)，2005，34(2)：189—194)在研究内生枯草芽孢杆菌Bs-2菌株对水稻苗促生作用机制中发现，用该菌的菌体、不同菌液含量及外分泌物对水稻苗生长均表现出不同程度的促进作用，提高其对外界环境的抗逆性，促其生长。因此植物内生细菌作为自然界广泛存在又能稳定定殖的菌种资源在促生以及生防等方面具有广阔的应用价值。

植物线虫是植物侵染性病原之一，它们寄生在各种植物的根、茎、叶、花、芽和果实上。线虫比其他重要病原---真菌、细菌、病毒等，具有主动侵袭寄主和自行转移为害的特点，它们对植物的危害，除吸取寄主的营养和对植物的组织造成机械的损伤外，主要在于现场的分泌物和唾液等，能引起植物产生一系列的生理病变，从而破坏植物的正常代谢和机能，影响生长和发育，致使植物的产量减少，品质下降，甚至死亡和绝产。根结线虫Meloidogynespp.是严重危害农业生产的一类土传病原，可以寄生于多种农作物，尤其是蔬菜，在热带和亚热带地区造成了严重减产。近年来，随着我国温室蔬菜种植面积不断扩大，蔬菜根结线虫并的发生逐年加重，已经成为无公害温室蔬菜生产的一大障碍。多年来，国内外不断加强对根结线虫的防治工作，包括化学杀线剂的使用、选育抗病品种和生物防治等。由于化学杀线剂的使用会产生农药残留对环境造成污染以及破坏人体健康，而生物防治不会有此问题的产生，有利于环境保护、维护人类健康和维护生态平衡等优点，因此生物防治植物寄生线虫已经成为今年来研究热点。

彭双等(彭双，杨茹，闫淑珍，陈双林.杀线虫植物内生细菌和根际放线菌对根结线虫的防效[J].植物保护学报，2012，,39(1)：63-69)从六种植物体内分离出112株内生细菌，以松材线虫为靶标筛选到16株内生细菌具有杀线虫活性，其中13株内生细菌的发酵上清液对松材线虫的24h杀线虫率均达到了100％，在番茄移栽时施入内生细菌BCM2的固体菌剂抑制根结率达到了83.31％。

发明内容

为了生物防治植物寄生线虫，减少高度农药的使用，本发明提供了一株能分泌杀线虫蛋白的蜡状芽孢杆菌，以及该菌株在生防植物根结线虫的应用。

本发明所说的蜡状芽胞杆菌，其代号为CM7，是蜡状芽胞杆菌(Bacilluscereus)它的保藏编号为CGMCCNo.4233。

本发明还公开了蜡状芽胞杆菌CM7菌体分泌的杀线虫蛋白，该杀线虫蛋白能在蜡状芽胞杆菌CM7发酵液中通过常规的硫酸铵沉淀和柱层析方法分离出来，分子量和等电点测定采用常规的电泳技术方法，该杀线虫目的条带单一，共计有376个氨基酸，相对分子质量(Mr)为38.5kD,其等电点(pI)值为7.77，详见附图1。

蜡状芽胞杆菌CM7菌株能通过沾根或伤根接种方法稳定定殖在番茄等多种植物根内并抑制根系结瘤，调查结瘤抑制率防效在90％以上。因此，该菌株制成的菌剂可以防治植物根结线虫病，本发明还公开了由所述的蜡状芽胞杆菌CM7制成的杀线虫菌剂。。

本发明公开了上述蜡状芽胞杆菌CM7在防治植物根结线虫中的应用。具体的应用方法是将蜡状芽胞杆菌CM7通过人工接种方法在番茄等植物根内定殖。

蜡状芽胞杆菌CM7用于生物防治植物根结线虫的人工接种方法：可以是在番茄等植物移栽时采用常规沾根接种或菌剂施入植物根部接种的方法。

上述方法中的蜡状芽胞杆菌CM7用于沾根接种的菌悬液，是采用下述两种方法制备：方法一：选用常规发酵方法繁殖菌体，去除发酵液，留下菌体用生理盐水悬浮制成的菌悬液，含菌量用血球计数板计数达到1×10⁵～5.0×10⁵个.g-1为CM7的菌悬液。方法二：干燥的菌剂1:100加入温水(20-40℃)搅拌均匀5-8小时后为菌悬液。

上述方法中的干燥菌剂的制备方法是常规发酵菌体，发酵液和载体(土壤细粉或滑石粉或麦麸细粉等)4:1比例混合均匀，40℃烘干到完全干燥，该干燥菌剂在干燥条件保藏时间是1-2年。

上述方法中的蜡状芽胞杆菌CM7用于菌剂施入植物根部接种的方法是：干燥菌剂拌入细土，比例是1:50，番茄等植物移栽时施入根部，每株植物用量30-50克。

附图说明

图1是CM7菌株杀线虫蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中：样品1是柱层析时收集杀线虫活性最高的第一管，样品2是第二管，样品3是第三管，随着时间的延长，蛋白浓度降低。

图2：植物内生细菌CM7的16SrDNA系统发育树。

本发明所说的蜡状芽胞杆菌CM7，于2010年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为蜡状芽胞杆菌(Bacilluscereus)，它的保藏编号为CGMCCNo.4233。

具体实施方式

实施例1：具杀线虫活性植物内生细菌的筛选和定殖测定

取植物材料流水清洗表面，用0.1％升汞浸泡1min，无菌水清洗5次后于1％NaClO中浸泡5min，再用无菌水清洗5次，转移至无菌组织匀浆器中捣碎，加入10mL无菌水，静置5min后取上层汁液梯度稀释，各稀释度取0.1mL分别涂布NA平板，28℃培养1～7d，挑取形态不同的单菌落纯化保存。取0.1mL最后一次漂洗消毒材料的无菌水，涂平板，验证消毒是否彻底。从六种植物体内分离出112株植物内生细菌，其中有64株可以在黄瓜无菌苗中稳定定殖，接种7d定殖量均能达到1×10⁵cfu/株，其中CM7菌株能达到2×10⁶cfu/株，对照处理苗中未检测到细菌。从这64株内生细菌中筛选到16株对松材线虫具有杀线虫活性，其中CM7菌株的发酵上清液对松材线虫的24h杀线虫率达到了100％。

取饱满的黄瓜种子清水浸泡2h，表面消毒(方法同上)，放到装有10mL马铃薯葡萄糖培养基的带盖试管中，25℃光照培养箱中培养7d，取子叶展开生长状况良好的试管苗，将OD600＝0.5±0.02(约10⁷cell/mL)的待测菌株菌液用伤根法穿刺接种到试管苗茎基部，0.2mL/株，每菌处理3株黄瓜无菌苗，无菌水处理为空白对照。置25℃光照培养箱中培养7d，取出整株苗按照上述方法分离内生细菌，并统计内生细菌定殖数量。CM7菌株可以在黄瓜无菌苗中稳定定殖，接种7d定殖量均能达到2×10⁶cfu/株，对照处理苗中未检测到细菌。

实施例2：CM7菌株的鉴定

CM7菌株形态学及生理生化鉴定方法按常规方法进行(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社，2001.)。菌株CM7态特征和生理生化特性见表1：菌落圆形，边缘缺刻，表面光滑干燥有光泽(似蜡)，无粘性，不透明，淡黄色，在LB液体培养基中呈混浊，不形成菌膜。

表1：杀线虫活性植物内生细菌CM7的形态特征和生理生化特性

CM7菌株的16SrDNA的扩增和序列分析，采用菌落PCR方法(QiuFB，HuangY，SunL.ZhangXX.LiuZH.SongW.Leifsoniaginsengsp.nov.isolatedfromginsengroot[J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology，2007(57)：405～408.)。CM7菌株划线接种于NA培养基上，在28℃条件下培养24h，先在1.5mL离心管中加入30μL无菌水，用灭菌牙签挑取少量菌体于水中制成悬液，煮沸10min，迅速放入冰中5min，4℃12000r/min离心5min，上清液作为PCR模板。反应体系(50μL):10×PCRbuffer(5μL)、dNTPmixture(10mmol/L)1μL、MgCl2(25mmol/L)4μL、引物P0(5μmol/L)1μL、引物P5(5μmol/L)1μL、TaqDNApolymerase(5U/L)0.5μL、5μL上清液作为Template模板、加入ddH2O32.5μL至终体积50μL。

PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性40s；46℃退火40s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃冷却10min，4℃至恒定。

PCR结束后，取3-4μL跑琼脂糖凝胶电泳，观察条带的大小及纯度。

制备50mL浓度为1％的琼脂糖凝胶，用100V电压跑胶，结束后在割胶仪上割取目的荧光条带，按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒上的方法回收PCR产物，并用琼脂糖凝胶电泳法检测回收条带的纯度为单一条带，测序：扩增后PCR产物由上海生工生物技术有限公司直接测序。从GenBank中调取假单胞菌、芽孢杆菌、泛菌属的菌株的16SrDNA序列用于系统发育学分析，CM7菌株的16SrDNA的全序列用Bioedit软件拼接，OrientationChecker和Mallard检测序列的方向一致性和嵌合体的有无，用ClustalX(1.8)软件包排序，选择大肠杆菌(Escherichiacoli)为外群，用MEGAversion4软件包中的Kimura2-ParameterDistance模型计算进化距离，用Neighbor-Joining法构建系统发育树(图2)，1000次随机取样，计算自引导值(Bootstrap)以评估系统发生树的置信度。

通过PCR得到CM7菌株1.5kb左右的16SrDNA(SEQIDNO.2)。16SrDNA序列分析显示植物内生细菌CM7属于蜡样芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。CM7形成淡黄色和乳白色稍有光泽的圆形菌落(似蜡)，边缘不规则，表面平滑；兼性厌氧，接触酶、VP测定、明胶水解、淀粉水解、柠檬酸盐测定、硝酸盐还原及吲哚反应均为阳性；菌体细胞杆状，大小约1.0μm×2.5μm，芽孢柱形，无伴孢晶体。根据以上结果鉴定CM7为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。

实施例3：蜡状芽胞杆菌CM7菌株抗生素标记和菌悬液的制备

参照文献(何红，邱思鑫，蔡学清，等.辣椒内生细菌BS-1和BS-2在植物体内的定殖及鉴定[J].微生物学报，2004，44(1)：13-18.)将蜡状芽胞杆菌CM7菌株标记到能在含300μg/mL链霉素的牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上稳定生长，且其菌落形态和杀线虫效果保持不变的突变体菌株。将标记菌株接种于装有含300μg/mL链霉素的30mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃、150r/min培养48h，发酵液经过8000rpm离心去上清液后，取菌体用无菌水稀释至108cfu/mL制备成菌悬液。

实施例4：蜡状芽胞杆菌CM7菌株在盆栽黄瓜和番茄根内定殖测定

番茄和黄瓜种子经清水浸泡30min，漂浮去瘪后，放置28℃温箱中催芽，播种到装有营养土的花盆中，黄瓜和番茄生长到2-3叶时将实施例1的菌悬液以伤根法穿刺接种黄瓜和番茄苗，1ml/株，每菌处理20株。用无菌蒸馏水处理为空白对照。置温室中培养。

分别于1d、3d、5d、7d和15d取处理苗及空白苗，剪取根部用无菌蒸馏水洗5次后，放于无菌的研钵中捣碎，再以无菌蒸馏水梯度稀释，每处理设3个重复。将10^-3、10^-4、10^-5的稀释液分别涂布在含300μg/mL链霉素的牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上，每梯度3个重复，于28℃培养24h后将单菌落分别计数，统计其定殖量。根部菌体含量达到1×10⁵cfu/mL以上为有效定殖。证明CM7菌株在自然条件下接种定殖数量能达到1×10⁵cfu/mL以上。

实施例5：蜡状芽胞杆菌CM7菌株对番茄根结线虫的防治

根结线虫虫卵土的准备：从田间采集感染根结线虫的植物病根，将病根切成小块埋于无线虫土中并高密度种植番茄或黄瓜，温室内培养40～50天，拔掉植株切下长有根结的病根并切碎后混拌土中，再种植植物。用相同方法继续扩繁，收集根结线虫繁殖后的虫卵土混合均匀。

将种植在无菌土壤中的4～6叶期的生长均一的番茄苗拔出，用清水洗净根部并浸泡在实施例1中的菌悬液中5min后移栽在装有虫卵土的花盆中，每个花盆装土约500克，移栽番茄苗4株，共栽种100盆，置温室内培育，每2～3d浇水管理。分别设计三个实验，实验一：番茄苗沾根接种后培育15d再移栽到含根结线虫虫卵土中培育；实验二：沾根接种后直接栽种到含有线虫虫卵土中的花盆中培育；实验三：不沾根接种的番茄苗移栽到虫卵土的花盆中培育15天后，采用伤根接种法接种菌悬液。每个实验中的每个处理4个花盆，每个花盆4株番茄苗。以沾根清水和沾根1‰阿维菌素为对照；置温室内培养，移栽30d后小心拔出番茄植株，用清水将根部的土壤洗净，计数所有植株的根结数量，计算严重度(0级---无根结，1级---有少数根结，2级---大部分根上有根结，3级---在虫瘿上再次根结，4级---根结上互相连接成为根结团块)，并计算根结抑制率。根结抑制率(％)＝[(对照植株根结数－处理植株根结数)/对照植株根结数]×100。测量番茄植株的株高，鲜重以及干重等。实验结果见表2，CM7菌株对番茄根结线虫的预防效果在90％以上，治疗效果在70％以上。

表2内生细菌CM7菌株接种对番茄根结线虫的根结抑制效果

实施例6：蜡状芽胞杆菌CM7菌株发酵液杀线虫活性的测定

将保存在试管中的CM7菌株活化后,用常规方法发酵，将发酵液8000rpm离心10min后取上清液过0.22μm滤膜去除残余菌体后为发酵液上清液。

用本专业常用的方法培养和分离植物寄生线虫(本实验采用松材线虫)，3000rpm离心3min浓缩线虫，用0.1％的链霉素对其进行表面消毒3min后，无菌水换洗3次，制成线虫悬浮液，浓度约为2000条/mL。供试线虫即用即提。

取2mL发酵液上清液加入小管中，加入线虫悬液200μL，每个处理重复3次，以不加发酵液上清液为对照，25℃，静置处理12h，小心吸除1mL上清，加入400μL浓度为2％的NaCl溶液，混匀，取70μL(观察的线虫总数不少于30头)点到单凹载玻片上，5min后在4倍光学显微镜下计数死亡线虫数(线虫僵直不动视为死亡)及线虫总数，计算3个处理的死亡率及校正死亡率并计算平均校正死亡率。计算各个处理的校正死亡率。

校正死亡率(％)＝(处理死亡率－对照死亡率)/(1－对照死亡率)×100

实验结果见表3，菌株CM7发酵液12小时内能100％杀死线虫。而未加发酵液的处理线虫在12小时内仅有1.57％的死亡。

表3蜡状芽胞杆菌CM7菌株发酵液对松材线虫的致死结果

实施例7：硫酸铵分级沉淀法提取蜡状芽胞杆菌CM7菌株杀线虫物质

采用常规方法对蜡状芽胞杆菌CM7菌株发酵液上清液进行硫酸铵分级沉淀，杀线虫方法和计算方法参考实施例6。如表4，结果表明：杀线虫活性随着硫酸铵的浓度的增加而增加，说明杀线虫物质是一种蛋白质或肽类物质，CM7菌株在70％和80％浓度的硫酸铵时沉淀下来的物质杀线虫效果较高。

表4蜡状芽胞杆菌CM7菌株发酵液上清液硫酸铵分级沉淀提取物的杀线虫效果

硫酸铵浓度	CM7	Duncan氏0.05水平
			10	3.93％±5.33％	d
20	6.00％±5.52％	d
			30	1.65％±1.48％	d
40	21.83％±10.56％	c
			50	63.18％±11.70％	b
60	66.25％±1.64％	b
			70	85.56％±4.52％	a
80	84.44％±1.71％	a
			90	6.33％±5.10％	d
100	18.63％±2.04％	c

注：表中abcd表示经Duncan氏新复极差检验在0.05水平差异显著性(P<0.05)，在70％和80％饱和浓度沉淀的物质杀虫活性显著性最高,用a表示。

实施例8：蜡状芽胞杆菌CM7菌株发酵液中蛋白物质的杀线虫活性

将蜡状芽胞杆菌CM7菌株发酵液8000rpm离心10min后取上清液过0.22μm滤膜去除残余菌体后，采用硫酸铵分级沉淀法提取粗蛋白，取发酵滤液在磁力搅拌器上缓慢加入硫酸铵分别使其浓度达到70％。待完全溶解后放在4℃冰箱静置过夜，12000rpm，4℃离心10min后取沉淀用50mMpH8.0Tris-Hcl缓冲溶液悬浮后置于截留分子量为3.5kD透析袋中4℃透析48h，用同样浓度的缓冲液透析，将透析液冷冻干燥制得杀线虫蛋白干粉。

取蛋白干粉0.1g溶解于含有1mL无菌水的2mL离心管中，加入线虫悬液200μL，每个处理重复3次，以不加粗蛋白为对照，25℃，静置处理12h，小心吸除1mL上清，加入400μL浓度为2％的NaCl溶液，混匀，取70μL(观察的线虫总数不少于30头)点到单凹载玻片上，5min后在4倍光学显微镜下计数死亡线虫数(线虫僵直不动视为死亡)及线虫总数。统计和计算方法参照实施例4。实验结果是12h校正死亡率100％，半数致死时间是2.5h.

实施例9：蜡状芽胞杆菌CM7菌株产生的杀线虫蛋白物质稳定性的测定

取实施例8制备的粗蛋白干粉0.1g，用1mL无菌水溶解，用1mol/LNaOH和1mol/LHCL将pH分别调节为3.0、5.0、7.0、8.0、9.0、11.0，静置1h后将pH调到pH7.0，测定杀线虫活性，以未经处理的粗蛋白液为对照，测定其对酸碱的稳定性。结果是过酸或强碱会使粗蛋白的杀线虫效果明显下降，在pH值为7.0和8.0时具有较高的杀线虫活性，说明该粗蛋白中的杀线虫活性物质蛋白耐弱碱，在强酸强碱中极易失活。

取0.1g粗蛋白干粉用1mL无菌水溶解后分别在25℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴锅中处理30min，待冷却至室温测定处理后的杀线虫活性，以未经处理的粗蛋白液为对照，测定其对温度的稳定性。结果是在4℃和60℃时保持原来的高杀线虫活性不变，在60℃后对着温度的增加，杀线虫的活性明显降低。说明粗蛋白中的杀线虫活性蛋白对热的稳定性较差。

取0.1g粗蛋白干粉用1mL无菌水溶解后分别加入等体积的甲醇、乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂，混合摇匀并静置12h后如有分层则分别将上层与下层溶液取500μL滴加到滤纸片上，不分层则取1mL滴加到滤纸片上，40℃烘干，加入与烘干前等体积的无菌水浸泡滤纸片2h，取浸泡液测定杀线虫活性，以未经处理的粗蛋白液为对照。结果是粗蛋白溶液经过甲醇、乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂处理后完全丧失杀线虫活性，说明该粗蛋白中的杀线虫活性成分对有机溶剂敏感。

实施例10：蜡状芽胞杆菌CM7菌株产生的杀线虫蛋白物质氨基酸构成的测定

取实施例8制备的粗蛋白干粉0.5g，用5mL双蒸水溶解后，过0.22μm滤膜后上层析柱，层析柱为葡聚糖凝胶SephadexG-75惰性柱，可分离分子量为5kD到80kD的蛋白质，层析柱体积为1.6cm×50cm。即为样品。洗脱液为5mMpH8.0Tris-Hcl缓冲溶液，流速为0.1mL每分钟，洗脱时间为5h，部分收集器收集洗脱蛋白溶液。测定每管杀线虫蛋白活性(方法参照实施例6)。将经过杀线虫活性测定的有活性的洗脱液加入垂直电泳。采用常规方法制备电泳胶，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。浓缩胶电压为90V,待样品跑至分离胶后调节电压到120V，待溴酚蓝跑至凝胶底端约1cm处停止电泳，剥下凝胶后染色2h再在脱色液中脱色1h，观察电泳条带，切下目标蛋白条带，碳酸氢氨溶液脱色，DTT还原，碘乙酸胺烷基化。在完全脱水的胶片中加入10ng/L胰蛋白酶液适量，37℃孵育过夜。50％ACN一2.5％TFA溶液于37℃提取lh，真空浓缩至近干,用MALDI-TDF-TOF质谱仪进行蛋白质的氨基酸的序列分析。该杀线虫蛋白的目的条带，共计有376个氨基酸，相对分子质量(Mr)为38.5kD,其等电点(pI)值为7.77。其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

实施例11：蜡状芽胞杆菌CM7菌株接种方法的测定

番茄种子按照常规方法处理后播种，小苗生长到子叶展开一个心叶时开始分苗，分苗时先是拔出小苗，去除根部土壤，把根部浸沾到实施例1中抗链霉素标记的蜡状芽胞杆菌CM7菌悬液中1～2min取出，栽到育苗盆中，设浸沾生理盐水为对照。常规方法培养番茄苗，在移栽15d后，即小苗生长良好时拔出小苗采用实施例1中的抗性平板的方法分离CM7菌株，计算定殖数量。定殖数量达到5.0×10⁵cfu.g-1以上时为接种成功。

实施例:12：蜡状芽胞杆菌CM7菌株对番茄根结线虫的防效测定

参照实施例5的接种方法，将蜡状芽胞杆菌CM7菌株接种到番茄上。分别设计三个实验，实验一：番茄苗沾根接种后培育15d再移栽到含根结线虫虫卵土中培育；实验二：沾根接种后直接栽种到含有线虫虫卵土中的花盆中培育；实验三：不沾根接种的番茄苗移栽到虫卵土的花盆中培育15天后，采用灌根接种法接种实施例1的菌悬液。每个实验中的每个处理4个花盆，每个花盆4株番茄苗。实验一和实验二以沾根清水和沾根1‰阿维菌素为对照；实验三以浇灌清水和1‰阿维菌素为对照。置温室内培养，移栽30d后小心拔出番茄植株，用清水将根部的土壤洗净，计数所有植株的根结数量，根据实施例5的方法统计。实验结果见表5，证明接种蜡状芽胞杆菌CM7菌株能有效的预防番茄根结线虫的危害，而根结线虫已经侵染植物根部后再接种对番茄根结线虫的治疗效果较差。

表5蜡状芽胞杆菌CM7菌株对番茄根结线虫的根结抑制率(％)

实施例13：蜡状芽胞杆菌CM7菌株对番茄促生效果

采用实施例7的方法培育番茄苗和接种蜡状芽胞杆菌CM7菌株，正常管理番茄苗，在接种后30天测量番茄植株的株高，鲜重以及干重。实验结果见表6，证明蜡状芽胞杆菌CM7菌株接种番茄后对番茄有明显的促进生长作用。

表6蜡状芽胞杆菌CM7菌株对番茄苗生长的影响

Claims (4)

1.一株蜡状芽胞杆菌(Bacilluscereus)CM7，它的保藏编号为CGMCCNo.4233。

2.杀线虫蛋白在防治植物根结线虫中的应用，其特征在于杀线虫蛋白是由由权利要求1所述的蜡状芽胞杆菌CM7菌体分泌，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

3.权利要求1所述的蜡状芽胞杆菌CM7在防治植物根结线虫中的应用。

4.一种由权利要求1所述的蜡状芽胞杆菌CM7制成的杀线虫菌剂。