CN109362787A - 暹罗芽胞杆菌在防治线虫中的应用 - Google Patents

暹罗芽胞杆菌在防治线虫中的应用 Download PDF

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Abstract

暹罗芽胞杆菌(Bacillus siamensis)在防治线虫中的应用，所述生物菌剂包括作为活性成分的暹罗芽胞杆菌和载体，所述生物菌剂为暹罗芽胞杆菌发酵液。防治线虫的方法为，将含有权利要求1中的暹罗芽胞杆菌和/或其发酵液的生物菌剂喷施于患处。本发明的暹罗芽胞杆菌在防治线虫中的应用，以暹罗芽胞杆菌防治线虫，无农药残留，无环境污染，不对人畜造成安全威胁；以绿针假单胞菌的发酵液制备防治线虫的生物菌剂，制备过程简单，成本低，效果好，使用方便。

Description

暹罗芽胞杆菌在防治线虫中的应用
技术领域
本发明涉及生物防治与生物菌剂，尤其涉及暹罗芽胞杆菌在防治线虫中的应用。
背景技术
线虫病的防治方法主要有物理防治、化学防治和生物防治。物理防治包括汰洗、热处理、射线和超声波处理等，在物理防治方法中应用最多的是热处理，即热水浸泡处理，利用高温将线虫杀死。热水浸泡法能达到一定程度防治线虫的效果，但由于处理的水温不容易控制，易造成死苗情况等。因此，寻找开发针对线虫的高效、低毒、无污染的生防制剂，是控制、治理线虫病的最直接且最经济有效的途径。
植物内生菌资源丰富，且有数据表明许多内生菌具有杀虫、抑菌、抗病毒及抗肿瘤活性，说明植物内生菌中广泛存在具有杀线虫作用的菌种资源，目前已发现的具有防治植物寄生线虫作用的内生真菌有尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、菜豆拟茎点霉(Phomopsisphaseoli)、Melanconium betulinum、Geotrichumsp.AL4、球毛壳菌(Chaetomium globosum)等；内生细菌有假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
内生菌与植物长期共存，在协同进化过程中，可产生与其相同或相似的具有杀线活性次生代谢产物，已有发现围涎树、银合欢、四棱豆、酸豆、毛鱼藤、狼牙刺、苦参、苦豆子等7种豆科植物及一些中草药植物的提取液具有抗线活性(彭双,2011；焦宏伟等,2014)，这些植物内生菌很可能产生与其相同或相似的具有杀虫活性的物质。例如银杏的种皮具有杀虫活性，王一杰从银杏组织中分离筛选出一株具有杀褐飞風活性的青霉菌属(Pmiciuiumsp)内生真菌(王一杰，2013；贺小锋，2015)，另有研究人员在银杏内生菌中，筛选获得一株对小菜蛾具有较高杀虫活性的银杏内生链霉菌HG2393(徐红星,2005)；袁永平等从药用植物使君子249株内生真菌中筛选到10株菌株培养滤液杀线活性达到A级，而使君子植物自身能产生杀虫成分(袁永平等,2010)。植物内生菌资源丰富，对生态环境的安全性更高，可产生与植物相同或相似的药用活性物质，筛选获得高效安全杀虫菌株的天然宝库。
发明内容
为了克服化学农药在防治线虫中存在的环境污染、农药残留及威胁人畜健康等问题，本发明提供了暹罗芽胞杆菌(Bacillus siamensis)在防治线虫中的应用，此构成本发明的第一个方面。
本发明还提供了暹罗芽胞杆菌在制备防治线虫的生物菌剂中的应用，包括作为活性成分的暹罗芽胞杆菌和载体，此构成本发明的第二个方面。
本发明还提供了一种防治线虫的方法，将含有暹罗芽胞杆菌和/或其发酵液的生物菌剂喷施于患处，此构成本发明的第三个方面。
本发明的有益效果：以暹罗芽胞杆菌防治线虫，无农药残留，无环境污染，不对人畜造成安全威胁；以暹罗芽胞杆菌的发酵液制备防治线虫的生物菌剂，制备过程简单，成本低，效果好，使用方便。
本发明的菌株spe-37为暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis KCTC13613(T)，文献出处：Haeyoung J，et al.2012.Draft Genome Sequence of the Plant Growth-Promoting Bacterium.Genome Announcem.194:4148–4149.
暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis KCTC13613(T)可从各地甘薯种植区的甘薯根际土壤上通过常规方法分离筛选而获得，也可联系本申请申请人索取。申请人声明从本申请申请日起二十年内，公众可联系申请人索取该菌种。
附图说明
图1为本发明实施例中的基于16S rRNA基因构建的菌株spe-37的系统发育树；
图2为本发明实施例中的spe-37菌株杀线虫活性的生测结果。
具体实施方式：
实施例
1菌株的筛选与鉴定
选择健康且长势良好的甘薯植株，用铲子将带有细根的储藏根挖出，抖去表面浮土，用毛刷将根际表面的土壤轻轻刷下装入自封袋中密封，作为根际土壤。取2g根际土壤置于盛有20mL无菌水的的100mL三角瓶中，三角瓶内放有若干玻璃珠。充分振荡后，制成10-1稀释液。吸取10-1稀释液0.5mL至装有4.5mL的无菌水试管中，充分搅匀。重复上述操作，直至获得10-6稀释液。吸取10-4、10-5或10-6稀释液各0.1mL，涂布于LB分离培养基上。将LB分离培养基平板倒置在37℃下培养1-2天。对长出的菌落及时进行分离纯化获得一株编号为spe-37的细菌，用LB固体斜面于4℃条件下保藏。
使用LB液体培养基于37℃、200rpm摇瓶培养24h后，以8000rpm离心收集菌体，通过微波法提取菌体基因组DNA，用细菌通用引物进行16S rDNNA基因PCR扩增。PCR反应体系为：10×buffer Mix(包含Taq酶)12.5μL，10μmol/L 27F 0.5μL，10μmol/L 1492R 0.5μL，ddH2O10.5μL，模板DNA 1μL，PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海生工有限公司测序，结果如SEQ ID No.1所示。测序结果在NCBI以及EzBio Cloud网站上比对测序结果，之后使用Mega 6.0软件进行序列比对及分析，最后用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统进化树并进行系统发育分析。如图1所示，序列比对发现菌株spe-37与暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis KCTC13613(T)的相似最高，其相似性为99.8％。因此，菌株spe-37应属于暹罗芽孢杆菌。
2杀线活性检测培养基的制作
NGM培养基：用975ml蒸馏水溶解3g氯化钠，17g琼脂，2.5g多聚蛋白胨，高压蒸汽灭菌。待冷却至55℃左右后，加入l ml l mol/L CaCl2，1ml l mol/L MgS04，l ml 5mg/L胆固醇，25ml磷酸钾缓冲液。混匀后倒入培养皿。
线虫Bleach裂解液：
5M NaOH 0.3ml
次氯酸钠 1.2ml
ddH2O 3.5ml
磷酸盐缓冲液
KH2PO4 119g
K2HPO4 21.5g
ddH2O 加水至1L
0.22um过滤除菌。
3线虫冻存方法
秀丽隐杆线虫可以冻存在-80度(Liang,J.,et al.,2003)，冻存线虫的具体方法如下：
1、在NGM板上培养线虫；
2、线虫培养至多数为饥饿的L1/L2线虫时，以M9缓冲液将线虫洗下，洗涤2次；
3、取四个冻存管，在每个冻存管里加入0.5ml线虫悬液和0.5ml冻存液，混匀后，于-80冰箱保存；或者一次性加入2ml线虫悬液和2ml冻存液，分装成四管；
4、第二天，取出四个冻存管中的一个进行复苏，复苏的方法是把冻存管拿出来室温融化，溶化后将线虫悬液加到含OP50的NGM板上培养，观查线虫复苏情况。
4线虫培养及同步化
固体培养基培养线虫(Lewis and Fleming,1995；Brenner,1974)
1、OP50活化：将冻存的E.coli OP50在LB平板上划线，37℃培养过夜；
2、挑单菌落接种到液体LB培养，37℃培养过夜；
3、在60mm NGM平板的中央滴加50-200μl OP50菌液，并在操净台中吹干；
4、将加有OP50的平板置于37℃培养；
5、将线虫以M9缓冲液洗下，加入到长有OP50的平板上，于20℃培养。
5细菌杀线虫活性生测
1、将暹罗芽胞杆菌spe-43菌株在LB板上划线37℃培养过夜；
2、挑单菌落于液体LB试管中，37℃，180rpm培养过夜；
3、取100μl菌液涂到到NGM(32μM)平板上，37℃培养12h，再于25℃培养12h；
4、将处理好的L4线虫加到含有细菌的NGM平板上，每隔12h进行统计，统计结果如图2所示，可以看出，暹罗芽胞杆菌spe-43对L4线虫起到了很好的抑制作用。
序列表
<110> 江苏师范大学
<120> 暹罗芽胞杆菌在防治线虫中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> 暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)
<400> 1
ggccggtgcg ggcgtgctaa tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg 60
atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact 120
ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcag acataaaagg 180
tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg 240
gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300
gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt 360
ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag 420
ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac 480
ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat 540
tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc 600
ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt 660
gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc 720
tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt 780
ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct 840
aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga 900
cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960
ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg 1020
acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080
gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg 1140
tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200
acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc 1260
acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc 1320
tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380
gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttat ggagccagcc 1440
gccgaaggtg acccg 1455

Claims (4)

1.暹罗芽胞杆菌(Bacillus siamensis)在防治线虫中的应用。
2.根据权利要求1所述的暹罗芽胞杆菌在制备防治线虫的生物菌剂中的应用，其特征在于，所述生物菌剂包括作为活性成分的暹罗芽胞杆菌和载体。
3.根据权利要求2所述的暹罗芽胞杆菌在制备防治线虫的生物菌剂中的应用，其特征在于，所述生物菌剂为暹罗芽胞杆菌发酵液。
4.一种防治线虫的方法，其特征在于，将含有权利要求1中的暹罗芽胞杆菌和/或其发酵液的生物菌剂喷施于患处。
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Ando et al. Impact of organic crop management on suppression of bacterial seedling diseases in rice

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