CN108070535A - 防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫的苏云金芽孢杆菌及制剂与应用 - Google Patents

防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫的苏云金芽孢杆菌及制剂与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物农药技术领域。具体涉及防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫的苏云金芽孢杆菌及制剂与应用。分离得到一株对南方根结线虫和孢囊线虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)HAN055，由该菌株制成的制剂WP‑HAN055对南方根结线虫和大豆孢囊线虫病害有显著的防治效果。所述的苏云金芽孢杆菌菌株HAN055保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015608。

Description

防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫的苏云金芽孢杆菌及制剂 与应用
技术领域
本发明属于微生物农药制备技术领域。具体涉及防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫的苏云金芽孢杆菌及制剂与应用。
背景技术
植物病原线虫隶属于线形动物门(Nematoda)，侧尾腺纲(Secernentea)，且大部分属于垫刃目。主要的致病途径是幼虫从植物嫩根根尖侵入植物体内，病原在植物体内，掠夺植物营养，对植物造成营养缺失、物理损伤、化学致病和复合侵染等危害(Sharon et al.,2001)。一般症状表现为植株矮小、萎焉、畸形、色泽失常、早枯等，严重时整株枯萎而死。
植物病原线虫给农业、林业、园林等的发展带来的严重危害，已经超过了细菌和病毒病害，仅次于真菌病害。据Sasser等(1987)估计，由于植物病原线虫的严重危害，全世界农作物每年因此造成的平均损失为12％-23％。联合国粮食及农业组织(FAO)估计，因为植物病原线虫的危害，大约损失了12％的粮食和纤维作物；而花生、烟草、蔬菜和水果因植物病原线虫而造成的损失则达到20％。目前已知的粮食作物、经济作物、油料作物、果树蔬菜等100多种植物都已发生了植物病原线虫病，其中危害最为严重的植物病原线虫病害是根结线虫病和大豆孢囊线虫病引起的，其中根结线虫(Meloidogyne spp.)能够侵染大多数的植物，对世界范围内的农作物造成了严重的危害，是植物病原线虫中危害最严重的(Sahebani et al.,2008)。据统计，因根结线虫病的危害造成的损失占世界农作物病虫害损失的10％以上(Anastasiadis et al.,2008)；由大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)引起的经济损失则达到了10％-80％，每年的经济损失超过6-8亿元，病害发生严重时甚至会造成农作物的绝收(黄云，2010)。
传统的农业措施防治，如控制种源、苗源，以防污染；轮作倒茬等方式无法达到根治的目标，同时也会在一定程度上影响农民经济效益。目前最常用的方式仍然是化学农药防治。最早使用防治农药主要是熏蒸剂，如：二溴氯丙烷等；之后逐渐被3％呋喃丹、5％涕灭威等高毒化学农药替代。但是高毒化学农药的大量使用，线虫对农药抗性不断提高，常规化学农药的实际防治效果越来越差，而且由于农产品的农药残留严重，产品缺乏市场竞争力，同时对生态环境以及人类健康安全造成了严重的威胁。
近年来生物农药以其高效、低毒甚至无毒、环境相容性好，对人畜安全、选择性强、病虫害不易产生抗性等特点受到越来越多的关注，被誉为“绿色农药”，成为二十一世纪农药发展的一个重要热点。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)简称B.t，属于革兰氏阳性菌，在生长后期能够形成内生芽孢的细菌，自然界土壤中广泛的分布。在《伯杰细菌鉴定手册》第九版中，苏云金芽孢杆菌归为第二类、第十八群，属于形成于内生芽孢的杆菌和球菌部，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属的一个种(关雄1997)。
苏云金芽孢杆菌区别于蜡状芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌的最显著的特征是，在芽孢形成的同时，会在菌体的一端或两端形成一种杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProtein，ICPs)，是一种碱性蛋白。这种杀虫晶体蛋白由一个或多个多肽组成，其晶体的形状、大小因菌株的不同而异，形状有菱形、圆形、方形、米粒型或其他一些不规则形状等。杀虫晶体蛋白对敏感昆虫有特异性的毒杀作用，如鞘翅目、鳞翅目、双翅目、膜翅目等昆虫，由于其作用的专一性，只对特异的靶标生物具有生物活性，而不会对人、畜等的健康造成危害，因而苏云金芽孢杆菌制剂被广泛的应用于农业害虫的防治(Carlberg et al 1995)。
苏云金芽孢杆菌具有非常广的杀虫活性谱，靶标对象有节肢动物门、原生动物门、变形动物们、线形动物门等有害生物。发挥生物活性的物质除了伴胞晶体蛋白外，还有许多次代谢产物，如抗生素、细菌素等活性物质(Capalbo 1995)。目前，苏云金芽孢杆菌制剂是世界上应用最为广泛的微生物农药。
发明内容
本发明的目的在于分离得到一株对大豆孢囊线虫、南方根结线虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌，并由该菌制备一种杀大豆孢囊线虫、南方根结线虫的苏云金芽孢杆菌制剂，通过田间试验证明其防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫的良好效果，最高防效达到了80％以上。。
本发明是技术方案如下所述：
申请人从中国甘肃省兰州市分离筛选得到一株对大豆孢囊线虫、南方根结线虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌菌株，申请人将该菌株命名为苏云金芽孢杆菌HAN055，Bacillus thuringiensis HAN055，于2015年10月16日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2015608。
本发明筛选的苏云金芽孢杆菌HAN055菌株具有下列明显特征：
(1)该菌株对大豆孢囊线虫、南方根结线虫具有高毒力。
(2)由本发明的菌株苏云金芽孢杆菌HAN055菌株制备的制剂(命名为WP-HAN055)在防治田间大豆孢囊线虫和南方根结线虫上取得效果显著。
苏云金芽孢杆菌HAN055菌株的菌学特征如下：
该菌营养体为短杆状，具周生鞭毛或无鞭毛，大小为1.2-1.8μm x 3.0-5.4μm，革兰氏染色呈阳性反应，芽孢为椭圆形，大小约为0.8μm x 2.0μm，在芽孢成熟后产生菱形伴胞晶体。在LB培养基上28℃培养，镜检观察，菌落呈乳白色，蜡状，近似圆形，边缘不整齐。最适生长温度为28℃，pH6-8均生长良好，最适生长pH为7.0-7.2。
按照常规甘油管保藏方法保藏该菌株。
更详细的技术方案参见实施例部分的描述。
附图说明
序列表SEQ ID NO:1是本发明分离苏云金芽孢杆菌的16S rRNA基因序列。
图1：是本发明的苏云金芽孢杆菌HAN055 16s rRNA基因系统发生树，附图标记说明：图示各节点处为不同的苏云金芽孢杆菌菌株的16S rRNA基因序列。
图2：是本发明的苏云金芽孢杆菌HAN055及杀虫晶体蛋白的显微照片。
图3：是本发明菌株HAN055的杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE检测结果。附图标记说明：图中泳道：M为蛋白质maker，P为HAN055的杀虫晶体蛋白。
具体实施方案
以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。本发明中所涉及的其他各项实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日前的各种常用工具书、科技文献或相关说明书、手册等加以实施。
实施例1 苏云金芽孢杆菌的分离、鉴定及其杀虫晶体蛋白的检测
1、苏云金芽孢杆菌的分离
土样的采集：2010年8月在甘肃省兰州市郊区采集距地表面0-15cm的土壤，去掉其中的枯枝、石子等杂物后，室温下晾干，研磨破碎并过40目筛，装入土样瓶常温保存备用。
Bt的分离：称取1克土样于含有20mlLB+醋酸钠的液体培养基(按1L培养基计算：蛋白胨10g；酵母粉5g；氯化钠10g；醋酸钠34.02g，补充蒸馏水至1L；调pH至7.0)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm，培养4小时；将培养物于80℃水中热处理3分钟；取100ul处理后的培养液使用LA固体培养基(按1L培养基计算：蛋白胨0.5g；酵母粉1.5g；氯化钠10g；琼脂粉15g；补充蒸馏水至1L；调pH至7.0)平板涂布，然后置于30℃培养12-16小时；再从LA平板上挑取疑似苏云金芽孢杆菌的菌落于T3培养基(按1L培养基计算：蛋白胨0.5g；酵母粉1.5g；磷酸二氢钠3.9g、磷酸氢二钠8.95g；MnCl20.005g；琼脂粉：15g；补充蒸馏水至1L；调pH至7.0)平板上，置于30℃培养48小时后，挑取菌苔中少量菌制片，碱性复红染色后在普通光学显微镜下镜检观察；能够观察到蛋白晶体产生的菌株即为苏云金芽孢杆菌。
本发明中分离到的苏云金芽孢杆菌HAN055，能够产生菱形晶体。
2、苏云金芽孢杆菌菌种鉴定
(1)苏云金芽孢杆菌HAN055总DNA的抽提
将HAN055进行纯培养后，在新的LB固体培养基(按1L培养基计算：蛋白胨：10g；酵母粉：5g；氯化钠：10g；琼脂粉：15g；补充蒸馏水至1L；调pH至7.0)平板上划线，用接种环通过无菌操作接种于5mL的LB液体培养基(1L：蛋白胨：10g；酵母粉：5g；氯化钠：10g；补充蒸馏水至1L；调pH至7.0)中，置于28℃、200rpm的摇床中培养过夜；然后通过无菌操作将50μL的培养物转移至5mL的LB液体培养基中，同样条件培养3-4小时；然后以12000rpm，0.5min离心收集菌体，用1mL STE[配方：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1m mol/L EDTA(pH 8.0)]洗涤一次，加100μL溶液I[配方：1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5mol/L EDTA(pH8.0)，50mmol/L葡萄糖]和10μL溶菌酶(浓度：50mg/mL)，在37℃作用30min以上；加入200μL2％的十二烷基磺酸钠(SDS)于55℃水浴30min；加入200μL 5mol/L NaCl混和，再加入500μL苯酚/氯仿/异戊醇(按体积比：25:24:1)，离心12000rpm，5min，吸取上清液，重复抽提1－2次；将上层DNA溶液转移至1.5ml离心管，加入等体积95％乙醇，室温静置5min后以12000rpm离心5min，沉淀用200μL 70％乙醇洗涤一次，冷冻抽干后溶于50μL TE溶液中。
(2)PCR扩增苏云金芽孢杆菌HAN055的16S rDNA
根据真细菌16S rDNA保守区通用引物27F和1492R(Reysenbach AL,Wickham GS,Pace NR.Phylogenetic analysis of the hyperthermophilic pink filamentcommunity in octopus spring,yellow stone national park〔J〕.Applied andEnvironmental Microbiology,1994,60:2113-2119.)并进行PCR扩增。
通用引物序列如下：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR反应体系为：10×buffer 2μl，2mmol/L dNTP 1.5μl，10μmol/L通用引物各0.4μl，Taq酶1U，拮抗细菌总DNA 1μl，补加灭菌去离子H2O至20μl。
PCR扩增反应程序为：第1步94℃预变性5min；第2步94℃变性1min，第3步55℃复性1min，第4步72℃延伸1.5min；第5步转到第2步继续运行28个重复；第6步72℃延伸5min。
(4)PCR产物的序列测定及分析
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，进行琼脂糖凝胶检测后，将PCR产物送至北京奥科生物技术有限责任公司测序。通过两个测序反应获得PCR扩增产物的全长1443bp，测序结果输入NCBI，用Blastn程序交送GenBank数据库进行比较分析，表明该序列与GenBank数据库中的苏云金芽孢杆菌属的不同菌株的16S rDNA同源性较高，相似性达到100％，鉴定该菌株属于芽孢杆菌科(Bacillaceae)芽孢杆菌属(Bacillus)，申请人将其命名为HAN055。
从GenBank数据库中下载与其16S rRNA基因序列相近的蜡状芽孢杆菌群菌株及苏云金芽孢杆菌标准菌株的16S rRNA基因序列(包括不完整的16S rRNA基因序列)，利用ClustalX与HAN055的16S rRNA基因序列作多序列比对(multiple sequence alignment)。根据多序列比对结果绘制成系统发生树，图中线段的长度不同表示同源性的差异。
3、苏云金芽孢杆菌菌株HAN055中杀虫晶体蛋白图谱与鉴定
(1)苏云金芽孢杆菌菌株HAN055杀虫晶体蛋白的提取
将苏云金芽孢杆菌菌株HAN055过夜活化后，转接到40mL ICPM培养基(蛋白胨0.6％，葡萄糖0.5％，CaCO3 0.1％，MgSO4·7H2O 0.1％，K2HPO4 0.05％；补充蒸馏水至1L；调pH至7.0)培养基中，于28℃摇床培养32～48h，至芽孢基本脱落。12000r/min 4℃离心2min收集菌体，依次用1mol/L NaCl-10mmol/LEDTA溶液及ddH2O分别洗涤沉淀3次，然后向洗涤后的晶胞混合物加入适量的50mmol/L Na2CO3(pH10.5，含3％β-巯基乙醇)，充分混匀，于37℃处理40min。12000r/min，4℃离心2min收集上清，在离心两次，以充分去除芽孢及营养体细胞。用4mol/L NaAc-HAc溶液(pH4.5)调节溶液pH值至晶体蛋白等电点附近，冰上沉淀4～5h或过夜。12000r/min，4℃离心10min收集沉淀，并用无菌ddH2O洗涤3次，于-80℃保存备用，使用前用碱性Heps溶液溶解。
(2)SDS-PAGE的制备
选择好15mm的玻璃板、对应的样品梳以及Spacer用ddH20洗干净晾干备用；将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，然后配制10％分离胶(ddH20 4mL，1.0Mol/L Tris-HClpH8.8 2.5mL，30％丙烯酰胺溶液3.3mL，10％SDS 0.1mL，10％APS 0.1mL，TEMED 0.004mL)10.0mL，混匀。然后缓缓倒入玻璃板之间，立即覆一层正丁醇溶液。1h后分离胶凝固，倒掉正丁醇后，再用ddH20冲洗几次，然后用滤纸吸干。然后按照相同的步骤配制5％浓缩胶(ddH202.2mL，30％丙烯酰胺溶液0.67mL，0.5Mol/L Tris-HCl pH6.81.0mL，10％SDS 0.04mL，10％APS 0.04mL，TEMED 0.004mL)4mL，然后灌制浓缩胶，插入梳子，待凝固后拔掉梳子，加入10x电极缓冲液(按1L培养基计算：Tris 30.36g，Glycine 144.13g，SDS 5g)。
(3)凝胶电泳
装好电泳系统，将晶体蛋白样品与2x样品缓冲液(0.125M Tris-HCl pH6.8，20％甘油，4％SDS，10％巯基乙醇，0.02％溴酚蓝v/v＝1:1)混合，上样1uL，稳压电泳至溴酚蓝带刚跑出分离胶时停止电泳。卸下胶板，剥离浓缩胶后放入考马斯亮蓝染色液中染色，再脱色，照胶。
实施例2 苏云金芽孢杆菌制剂WP-HAN055的制备
1、菌种制备：首先，将保存的苏云金芽孢杆菌菌株HAN055接种至斜面(BP培养基1L：蛋白胨5g；牛肉膏3g；氯化钠5g；补充蒸馏水至1L；调pH至7.0)，30℃培养3-5天(形成有力的芽孢)；再用5mL无菌水将菌体洗下，在75-80℃水浴上保温15-20分钟；取芽孢悬液接种到含有100mL TP液体培养基(按1L培养基计算：胰蛋白胨20g；右旋糖2g；磷酸氢二钠2.5g；氯化钠5g；补充蒸馏水至1L；调pH至7.0)的500mL三角瓶，摇床培养(30℃，220rpm)6-8小时，即为一级种子；然后以2％体积接种量转接新的TP培养基1000mL，得到二级种子；再用二级种子以0.5％接种量接种种子罐，获得发酵菌种。
2、工业发酵培养基的制备(按1L培养基计算：黄豆饼粉18g；玉米粉5g；玉米浆36g；淀粉7.5g；鱼粉3g；K2HPO4 2.16g；MgSO4·7H2O 0.75g；CaCO3 1.5g；(NH4)2SO4 2g；补充蒸馏水至1L；调pH至7.0)。
3、发酵培养条件：温度为30±0.5℃；接种时pH 6.8-7.2；消泡剂是发酵用有机硅消泡剂(活性成分：聚硅氧烷、分散剂、非离子表面活性剂)，用量为按配料体积的0.15％-0.2％；溶氧控制，在接种至延迟期之间通气量为1:0.6-1.0(v/v，指发酵培养基体积与每分钟通入空气的体积之比)，罐压0.3-0.5Kg/cm2，进入对数期后通气量增大至1:1.0-1.2或更大。
4、发酵终点：接种后32-36小时，芽孢形成率达到95-98％，此刻下罐。
5、发酵液后处理：离心浓缩(16000转/分)；喷雾干燥(塔顶进口温度40-150℃，塔中层温度保持在60-65℃)；添加高岭土作分散剂，添加量为55％(w/w)。
6、将粉剂包装为成品，成品中苏云金杆菌制剂WP-HAN055中活芽孢数量为200亿CFU/g。
实施例3 苏云金芽孢杆菌制剂WP-HAN055对南方根结线虫和大豆孢囊线虫的生测实验
1、苏云金芽孢杆菌制剂WP-HAN055对南方根结线虫的生测试验
(1)南方根结线虫2龄幼虫的制备：从感染南方根结线虫的番茄根系上挑取南方根结线虫卵块，用1％H2O2和0.25％KI消毒液消毒后置于培养箱中25℃培养3-5天，卵块孵化出的南方根结线虫即2龄幼虫，保存备用。
(2)在96孔板上进行生物活性测定：将苏云金杆菌制剂WP-HAN055稀释成5个浓度，用无菌去离子水设置一个空白对照，每个处理做4次重复。每孔吸入大约40头2龄幼虫，将不同浓度的样品加入至相应处理中，用无菌去离子水补足总体积至200μL，样品终浓度为2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL，40mg/mL，3天后统计死亡头数，计算死亡率和校正死亡率。
(3)试验结果
表1本发明的苏云金杆菌制剂WP-HAN055对南方根结线虫的生测鉴定
表1的说明：死亡率(％)＝(死虫数/总虫数)x100。
正死亡率(％)＝[(处理死亡率－对照死亡率)/(1－对照死亡率)]x 100。
2、苏云金杆菌制剂WP-HAN055对大豆孢囊线虫的生测试验
(1)大豆孢囊线虫2龄幼虫的准备：从大豆孢囊线虫发病较重的土壤中用漂浮法分离孢囊，将孢囊置于3mM ZnSO4溶液中，在常温下孵化后，稀释至每1ml悬浮液中约有400头左右二龄幼虫，备用。
(2)在24孔板上进行生物活性测定：将苏云金杆菌制剂HAN055和96.6％噻唑膦稀释成5个处理浓度，用无菌去离子水设置一个空白对照，每个处理做4次重复。各取1毫升供试样品置于小孔中，加入等体积的线虫悬浮液，空白处理加入等量的清水，苏云金杆菌制剂HAN055样品终浓度分别为2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL，24h后统计大豆孢囊线虫2龄幼虫死亡数量和存活数量，计算死亡率和校正死亡率。
(3)实验结果
表2本发明的苏云金杆菌制剂WP-HAN055对大豆孢囊线虫的生测鉴定
浓度(mg/ml) 总虫数(头) 死虫数(头) 死亡率(％) 校正死亡率(％)
CK 177 7 4.0 -
1.25 151 22 14.6 11.0
2.5 159 29 18.2 14.8
5 161 49 29.8 26.9
10 131 79 60.3 58.6
20 142 104 73.2 72.1
40 167 135 80.8 80.0
表2的说明：死亡率(％)＝(死虫数/总虫数)x100。
校正死亡率(％)＝[(处理死亡率－对照死亡率)/(1－对照死亡率)]x100
实施例3 苏云金芽孢杆菌制剂WP-HAN055防治南方根结线虫田间药效试验
1、试验具体步骤
(1)苏云金杆菌制剂WP-HAN055设置3个处理浓度：2kg/亩，4kg/亩，6kg/亩；同时设置清水和噻唑磷(2kg/亩)两个对照，共5个处理。每个处理设置3个小区，共15个小区，每个小区面积0.1亩，各小区间随机排列。
(2)试验在2015年8月进行，番茄幼苗育苗一个月后移栽至大田内。
(3)分别在移栽时和移栽一周后，将苏云金杆菌制剂兑水稀释后灌根使用。
(4)45天后调查防治效果。
2、根结线虫危害评级标准及防效计算：
(1)中华人民共和国农业行业标准(NY/T 1858.8-2010)，对线虫危害评级并计算病情指数和防治效果。
0级 所有根上都没有根结；
1级 0％＜有根结的根数占总根系＜10％；
3级 10％≤有根结的根数占总根系＜25％；
5级 25％≤有根结的根数占总根系＜50％；
7级 50％≤有根结的根数占总根系＜75％；
9级 75％≤有根结的根数占总根系≤100％。
(2)防效计算方法：
病情指数(％)＝∑(各级病株数x病级数)×100％/(调查总株数x最高病级数)。
防治效果(％)＝(对照区病情指数-处理区病情指数)x100％/对照区病情指数。
3、试验结果
表3本发明的苏云金制剂WP-HAN055防治南方根结线虫的田间药效鉴定
处理 用量(kg/亩) 病情指数(％) 防治效果(％)
清水对照 0 43.39 -
本发明WP-HAN055 2 35.43 18.35
本发明WP-HAN055 4 27.21 37.29
本发明WP-HAN055 6 10.18 76.42
噻唑磷10％颗粒剂 2 9.64 78
实施例4 苏云金芽孢杆菌制剂WP-HAN055防治大豆孢囊线虫田间药效试验
1、试验具体步骤：
(1)设置3个浓度：3kg/亩，5kg/亩，7kg/亩；同时设置无处理和噻唑磷(2kg/亩)两个对照，共5个处理。每个处理设置3个小区，共15个小区，每个小区面积0.1亩，各小区间随机排列。
(2)试验在2015年春进行，制剂在大豆播种前混土后沟施。
(3)播种3个月后，统计每株大豆的孢囊数量，并计算病情指数和防治效果。
2、大豆孢囊线虫危害评级标准及防效计算：参照标准GB/T 17980.37-2000，中华人民共和国国家标准，《农药田间药效试验准则(一)：杀线虫剂防治胞囊线虫病》。
防治效果(％)＝(对照区孢囊数-处理区孢囊数)x100/对照区孢囊数。
3、试验结果
表4苏云金芽孢杆菌制剂WP-HAN055防治大豆孢囊线虫的田间药效鉴定
药剂处理 用量(kg/亩) 孢囊数量(个/20株) 防治效果(％)
清水对照 0 375.7 -
WP-HAN055 3 216.8 42.3
WP-HAN055 5 164.5 56.2
WP-HAN055 7 89.6 76.2
噻唑磷10％颗粒剂 2 85.3 77.3
从以上实例中可以看出，苏云金芽孢杆菌制剂WP-HAN055对大豆孢囊线虫和南方根结线虫的致死率均达到了80％以上。田间药效试验也表明，苏云金杆芽孢菌制剂WP-HAN055对大豆孢囊线虫和南方根结线虫病害具有显著的防治效果，防效也达到了70％以上，与已商业化的噻唑磷10％颗粒剂(日本石原产业株式会社研制开发的产品)的防治效果相当。以上说明本发明的苏云金芽孢杆菌HAN055及制剂对防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫的防治具有很强的应用价值和潜力。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
<120> 防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫的苏云金芽孢杆菌及制剂与应用
<130>
<141> 2016-10-29
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1442
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1442)
<223>
<400> 1
ccaccgctta atgcagtcga gcgaatggat tgagagcttg ctctcaagaa gttagcggcg 60
gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc cataagactg ggataactcc gggaaaccgg 120
ggctaatacc ggataacatt ttgaactgca tggttcgaaa ttgaaaggcg gcttcggctg 180
tcacttatgg atggacccgc gtcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc 240
aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag 300
actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa 360
cgccgcgtga gtgatgaagg ctttcgggtc gtaaaactct gttgttaggg aagaacaagt 420
gctagttgaa taagctggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt 480
gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg ggcgtaaagc 540
gcgcgcaggt ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat 600
tggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gaaagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaa 660
tgcgtagaga tatggaggaa caccagtggc gaaggcgact ttctggtctg taactgacac 720
tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780
cgatgagtgc taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgaagttaa cgcattaagc 840
actccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960
atcctctgaa aaccctagag atagggcttc tccttcggga gcagagtgac aggtggtgca 1020
tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
tgatcttagt tgccatcatt aagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga 1140
ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200
caatggacgg tacaaagagc tgcaagaccg cgaggtggag ctaatctcat aaaaccgttc 1260
tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320
atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga 1380
gagtttgtaa cacccgaagt cggtggggta accttttgga gccagccgcc tagagagtcc 1440
ag 1442

Claims (4)

1.一株对大豆孢囊线虫、南方根结线虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)HAN055，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M 2015608。
2.一种由保藏编号为CCTCC NO：M 2015608得苏云金芽孢杆菌HAN055制备得到的杀大豆孢囊线虫、南方根结线虫的苏云金芽孢杆菌制剂。
3.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌HAN055在制备杀大豆孢囊线虫和南方根结线虫制剂中的应用。
4.权利要求2所述的苏云金芽孢杆菌制剂在防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫病害中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109362787A (zh) * 2018-12-07 2019-02-22 江苏师范大学 暹罗芽胞杆菌在防治线虫中的应用
CN114606155A (zh) * 2022-01-25 2022-06-10 云南大学 苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80菌株在防治植物南方根结线虫中的应用
CN115141786A (zh) * 2022-08-26 2022-10-04 甘肃省科学院生物研究所 一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100319092A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-16 Dow Agrosciences Llc Dig-10 insecticidal cry toxins
CN103421703A (zh) * 2012-10-12 2013-12-04 华中农业大学 反式乌头酸产生菌及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100319092A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-16 Dow Agrosciences Llc Dig-10 insecticidal cry toxins
CN103421703A (zh) * 2012-10-12 2013-12-04 华中农业大学 反式乌头酸产生菌及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOSEPH W. KLOEPPER等: "Rhizosphere bacteria antagonistic to soybean cyst (Heterodera glycines) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematodes: Identification by fatty acid analysis and frequency of biological control activity", 《PLANT AND SOIL》 *
喻子牛等: "苏云金芽胞杆菌新基因资源的发掘策略", 《第三届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会会议论文集》 *
成飞雪等: "杀线虫苏云金芽胞杆菌菌株YC-10的分离鉴定及活性测定", 《中国生物防治学报》 *
聂相涛: "和防治植物寄生线虫黄曲条跳甲的新型苏云金芽胞杆菌制剂H系列的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109362787A (zh) * 2018-12-07 2019-02-22 江苏师范大学 暹罗芽胞杆菌在防治线虫中的应用
CN114606155A (zh) * 2022-01-25 2022-06-10 云南大学 苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80菌株在防治植物南方根结线虫中的应用
CN114606155B (zh) * 2022-01-25 2023-08-04 云南大学 苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80菌株在防治植物南方根结线虫中的应用
CN115141786A (zh) * 2022-08-26 2022-10-04 甘肃省科学院生物研究所 一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用

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