CN108893419A

CN108893419A - 微生物菌株及其筛选方法与在处理重金属污染土壤中的应用

Info

Publication number: CN108893419A
Application number: CN201810511076.9A
Authority: CN
Inventors: 王佳斌; 蔡慧; 贺志刚; 程刚
Original assignee: Suzhou Yifante Environment Restoration Co ltd; Suzhou Zhongyishiji Ecological Environment Design Research Co ltd
Current assignee: Suzhou Yifante Environment Restoration Co ltd; Suzhou Zhongyishiji Ecological Environment Design Research Co ltd
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2018-11-27
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: CN108893419B

Abstract

本发明公开了处理重金属污染土壤用微生物菌株及其筛选方法与应用；筛选的微生物菌株为枯草芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC NO:M 2017830。将该微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；通过钝化作用将镉和铜固定在污染土壤中，降低镉的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复土壤的目的。

Description

微生物菌株及其筛选方法与在处理重金属污染土壤中的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，是设计一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其筛选方法和应用。

背景技术

根据2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示，我国土壤环境状况总体不容乐观。工矿业、农业等人为活动以及是造成土壤污染或超标的主要原因。全国土壤总的超标率为16.1％，污染类型以无机型为主。其中镉污染物点位超标率为8种无机污染物之首，占7.0％，不同程度污染点位比例分别为：轻微5.2％、轻度0.8％、中度0.5％、重度0.5％。镉污染物含量分布呈现从西北到东南、东北到西南方向逐渐升高的态势。

镉是人体非必需的微量元素，具有较强的致癌致畸及致突变作用，会对人体会产生较大的危害。镉一般通过呼吸系统和消化系统进入人体，在人体内半衰期达20～30a。镉对人体的毒害分为急性毒害和慢性毒害两种，镉的急性毒害主要表现为肺损害、胃肠刺激反应、全身疲乏、肌肉酸痛和虚脱等；慢性毒害主要表现为对骨骼、肝脏肾脏、免疫系统、遗传等的系列损伤，并诱发多种癌症。我国土壤镉背景值为0.097mg/kg，远低于世界平均水平。人类工农业生产活动直接或间接地将镉排到环境当中是土壤镉污染的主要途径，将其细分主要有四种方式：大气镉沉降、施肥不当、污水灌溉、金属矿山酸性废水污染。

为了有效利用现有的土地资源、减少镉等重金属对人体造成危害，需要采取有效的治理措施，修复受污染的土壤。当前针对镉污染土壤的治理方法主要可以分为物理方法、化学方法和生物方法等。物理方法需要耗费大量人力物力，且移除的污染土壤又易引起二次污染。化学方法则易再度活化重金属，生物方法也具有一定局限性，在实地修复中并没有很好的成功案例。因此。寻找一种节能高效，经济环保的修复措施至关重要。

近年来，由于含铜矿产的开采、冶炼厂三废的排放、含铜杀菌剂的长期大量使用和城市污泥的堆肥利用，使土壤含铜量达到原始土壤的几倍甚至几十倍，远远超出了土壤环境的承载力，对植物、动物和土壤微生物产生危害，严重威胁到生态系统的稳定和人类的安全。因此，土壤中铜的污染也逐渐引起了人们的重视。

铜是植物必需的微量元素，它在调整蛋白质构成、参与光合电子转移、线粒体的呼吸作用和细胞壁的新陈代谢等方面起着重要作用。但过量的铜会对植物产生毒害作用，当土壤中的铜浓度达到某一阈值时，植物的生长发育受阻，严重的可造成植物死亡。

土壤微生物在土壤生态系统物质循环与养分转化过程中起着十分重要的作用。一方面微生物可通过多种方式影响重金属的活动性，使重金属在其活动相和非活动相之间转化，从而影响重金属的生物有效性；另一方面微生物能吸附和转化重金属及其化合物。但当铜等重金属的浓度超过一定限度时，土壤微生物数量和种群结构发生改变，微生物的生长代谢受到抑制，甚至死亡。

土壤中酶的活性是衡量土壤质量变化的重要指标之一。重金属通过破坏酶的活性位点和空间结构，导致土壤中酶的活性下降；也可以通过抑制微生物的生长、繁殖，减少微生物体内酶的合成和分泌，最终使单位土壤中酶的活性降低。与Cu污染关系密切的土壤酶有脲酶、硝酸还原酶、过氧化氢酶、纤维素酶、磷酸酶、水解酶等。土壤酶活性与重金属之间的关系，受土壤有机质、黏粒等含量的高低及它们对土壤酶的保护容量和对重金属缓冲容量的大小等因素的影响。

重金属污染土壤的修复方法有2大类：物理化学修复和生物修复。物理化学修复包括客土法、化学固化、电动修复、土壤淋洗等，这些技术不仅非常昂贵，难以大规律改良，而且常导致土壤结构破坏、土壤生物活性下降和土壤肥力退化。近年来污染，国内外学者在土壤 Cu污染领域做了很多工作，并取得了许多重要成果，特别是在Cu污染修复方面取得了可喜的成绩。但总的看来，许多方面的工作还有待进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一微生物菌株及其筛选方法与其在处理重金属污染土壤中的应用，所获得的微生物菌株对土壤中的重金属镉和重金属铜具有较强的钝化作用以及耐受作用，通过钝化作用将镉和铜固定在污染土壤中，降低镉的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复土壤的目的。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种微生物菌株，为芽孢杆菌，已于2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017830；保藏地址为中国武汉，武汉大学，命名为芽孢杆菌NiuH(Bacillus sp.NiuH)。

本发明还公开了上述微生物菌株的筛选方法，包括以下步骤：

(1)将镉和铜共同污染的土壤与牛肉膏蛋白胨液体培养基振荡混合，获得土壤混合液；然后将土壤混合液离心，得到上清液；

(2)将步骤(1)得到的上清液接种到含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，经过复数次培养、离心、取上清液，获得菌液；然后将菌液在牛肉膏蛋白胨液体培养基上进行平板划线，分离出单菌落；

(3)取步骤(3)获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液，将上清液梯度稀释后涂布于含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在28～30℃培养3～4天，比较菌株的生长状况，从中筛选出目标微生物菌株。

上述技术方案中，步骤(1)中，所述振荡混合在玻璃珠存在下进行，振荡混合的温度为28～30℃，速度为160～170rpm；步骤(2) 中，所述复数次为3～5次，所述培养为在28～30℃下振荡培养，所述含有镉的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，Cd²⁺的含量为100mg/L，Cu²⁺的含量为50mg/L，步骤(2)首先在28～30℃下振荡培养，培养完成后离心，然后取上清液转移接种至另一个含有镉的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在28～30℃下振荡培养，重复上述转移接种的操作3～5次，通过富集培养的方式，对微生物菌株进行驯化，驯化完成后获得的菌液在牛肉膏蛋白胨液体培养基上进行平板划线，分离出单菌落。

上述技术方案中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为 7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.3～0.6％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为蒸馏水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的 pH为7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.3～0.6％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、1.5～2.5％琼脂、其余为蒸馏水。优选的，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、 0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为蒸馏水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、1.5％琼脂、其余为蒸馏水。

上述技术方案中，步骤(3)中，将上清液分别稀释为10^-1、10^-2、 10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后将不同浓度梯度的上清液分别涂布于含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在28～30℃培养 3～4d；选取在稀释10^-6倍数时易于菌株单独分离、在含有100mg/LCd²⁺和50mg/L Cu²⁺牛肉膏蛋白胨固体培养基上能正常生长的菌株划线分离，得到目标微生物菌株；所述含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨固体培养基为20mg/L Cd²⁺以及10mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有40mg/L Cd²⁺以及20mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有60mg/L Cd²⁺以及30mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有80mg/L Cd²⁺以及40mg/LCu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基和含有 100mg/L Cd²⁺以及50mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基。

自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。微生物及植物实现重金属土壤污染的修复，关键是微生物及植物的筛选。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表 10cm～30cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量较少。由此可知，土壤来源不同，所分离出的菌株也各不相同。本发明中所用的土壤来源如下：农田污染土壤取自东山镇农林种植场，由于长期施用化肥、农药和禽畜粪便等，致使此种植场收到重金属污染。选取其中含有镉和铜污染的土壤，有利于本实验的开展。

通过上述方法，本发明筛选出剂盒步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定；在比对匹配度最高的结果中，菌种所测得到的16s rDNA 序列部分与Bacillus(芽孢杆菌属)的16srDNA序列有100％的同源性，可确定菌属为Bacillus(芽孢杆菌属)，与已知菌种的匹配中，与 Bacillus thuringiensis(苏云金芽孢杆菌)的16s rDNA有100％同源性；与Bacillusthuringiensis(苏云金芽孢杆菌)在RDP-II数据库中，序列相似性最高；可确定菌种为Bacillus thuringiensis(苏云金芽孢杆菌)，命名为芽孢杆菌NiuH。

本发明还公开了一种重金属污染土壤处理试剂的制备方法，包括以下步骤，将上述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液为重金属污染土壤处理试剂；或将菌液真空冷冻干燥后制备重金属污染土壤处理试剂。

本发明还公开了上述微生物菌株在重金属污染土壤处理或制备重金属污染土壤处理试剂中的应用，优选的，所述重金属为镉和铜。加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态镉在15d内由 33.28mg/kg降到1.73mg/kg，土壤可交换态铜由16.04mg/kg降到0.45mg/kg；用水洗脱土壤，未检出Cd²⁺和Cu²⁺，这说明本发明菌株对土壤中的镉和铜具有极强的钝化能力。此外，本发明所述菌株在水相中对镉和铜具有极强的耐受性以及较强的钝化能力；土壤中可交换态镉和铜的含量越低，则土壤中镉和铜的钝化效果越好，植物可利用度越低。

本发明还公开了一种重金属污染土壤的处理方法，将上述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理。

上述技术方案中，所述培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基或者牛肉膏蛋白胨液体培养基；所述重金属为镉和铜。

上述技术方案中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为 7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.3～0.6％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为蒸馏水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的 pH为7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.3～0.6％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、1.5～2.5％琼脂、其余为蒸馏水。

优选的，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为蒸馏水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、 0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、1.5％琼脂、其余为蒸馏水。

作为优选，所述微生物菌株接种于培养基时，接种量为2％。

国内外虽然已经开展了镉和铜污染土壤的修复研究，但是物理化学方法成本高工艺复杂，已筛选的降解菌耐受性差，实际应用受限；本发明针对现有治理重金属污染土壤的方法具有一定局限性、实施成本高、对土壤破坏严重、易带来其他污染等问题，通过筛选出功能性微生物菌株的生物钝化作用来实现对污染土壤的原位修复。本发明从受重金属镉和铜共同污染的土壤中筛选出的苏云金芽孢杆菌能够将土壤中的可交换态镉钝化显著降低其含量，同时对镉和铜都具有极强的耐受性，对土壤扰动小，具有较强的生物修复功能，能够应用于修复重金属污染土壤和制备重金属污染修复材料中，且具有成本低、效果好、操作方便、对土壤扰动小等特点。

附图说明

图1为本发明所述微生物菌株的生长曲线；

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的微生物菌株及其筛选方法与在重金属污染土壤处理中的应用进行详细说明。本发明筛选微生物菌株时的培养基与培养微生物菌株时的培养基可以一样，也可以不一样。

实施例1

本发明微生物菌株的筛选采用液相富集法，包括以下步骤：

(1)称取5g镉和铜共同污染土壤样品(东山镇农林种植场，Cd²⁺的含量为100mg/L，Cu²⁺的含量为50mg/L)，加入到装有牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，加入玻璃珠，将锥形瓶在28℃、160rpm下振荡，获得土壤混合液；

(2)将土壤混合液转入离心管，取离心后的上清液作为镉和铜钝化微生物的来源；

(3)将步骤(2)获得的上清液接种到含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨液体培养基(Cd²⁺的含量为100mg/L，Cu²⁺的含量为50mg/L)中，在28℃、160rpm下振荡培养，培养完成后，离心，用无菌吸管吸取 2mL上清液，移入另一个含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨液体培养基 (Cd²⁺的含量为100mg/L，Cu²⁺的含量为50mg/L)中，如此转移三次，通过上述富集培养的方式对微生物菌株进行驯化，驯化完成后获得的菌液，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行平板划线，分离单菌落；

(4)取步骤(3)获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液，上清液分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后将不同浓度梯度的上清液分别涂布于含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在28～30℃培养3～4d；选取在稀释10^-6倍数时易于菌株单独分离、在含有100mg/L Cd²⁺和50mg/L Cu²⁺牛肉膏蛋白胨固体培养基上能正常生长的菌株划线分离，得到目标微生物菌株；所述含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨固体培养基为20mg/LCd²⁺以及10mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有40mg/L Cd²⁺以及20mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有60mg/L Cd²⁺以及30mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有80mg/L Cd²⁺以及40mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基和含有100mg/L Cd²⁺以及50mg/LCu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基。

通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，命名为芽孢杆菌 NiuH(Bacillussp.NiuH)，已于2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017830；保藏地址为中国武汉武汉大学。

本发明筛选的微生物菌株的鉴定根据根据Ezup柱式细菌基因组 DNA抽提试剂盒步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定；在比对匹配度最高的结果中，菌种所测得到的16srDNA序列部分与Bacillus(芽孢杆菌属)的16s rDNA序列有100％的同源性，可确定菌属为Bacillus (芽孢杆菌属)；与已知菌种的匹配中，与Bacillus thuringiensis(苏云金芽孢杆菌)的16s rDNA有100％同源性；与Bacillus thuringiensis (苏云金芽孢杆菌)在RDP-II数据库中，序列相似性最高；可确定菌种为Bacillus thuringiensis(苏云金芽孢杆菌)。

本发明筛选的微生物菌株的序列表如下：

ATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTGAGAGCTTGCTCTCAAGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAG ATGATTGGGGTGAAG

将上述菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为2wt％， 28℃、160rpm下振荡培养，间歇取样。图1为本发明筛选的微生物菌株的生长曲线，菌株起初进入对数生长期，后到达生长稳定期，最终生长呈下降趋势，进入衰亡期，浓度最高能达到OD600为1.721。

上述牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为蒸馏水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、1.5％琼脂、其余为蒸馏水。

实施例2

向牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入不同浓度的Cd²⁺和Cu²⁺， 121℃灭菌15min；然后接种本发明筛选的微生物菌株(接种量为 2wt％)；在Cd²⁺、Cu²⁺浓度分别为5mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L 时，该菌株分别在4、5、9、16h时进入对数生长期，能达到的最高OD值分别为5.45、4.99、4.20和3.16，从数据表明，该菌株对Cd²⁺和Cu²⁺仍具有极强的耐受能力。

上述牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为蒸馏水。

实施例3

将本发明筛选的微生物菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为蒸馏水，培养至对数生长期，得到菌液；或将菌液用真空冷冻干燥机冻干，备用。

实施例4

取实施例3制备的新鲜菌液，然后加入浓度分别为5mg/L、20 mg/L、50mg/L、100mg/L的Cd²⁺和Cu²⁺，继续振荡培养12h后，取 8ml菌液，8000rpm离心7min，用ICP-AES检测上清液中残余Cd²⁺和Cu²⁺的浓度。

公式如下:

本发明筛选的微生物菌株对5mg/L、20mg/L、50mg/L、100 mg/LCd²⁺的去除率分别为78.17％、93.33％、59.06％、36.16％；对5 mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L Cu²⁺的去除率分别为88.12％、 83.57％、56.87％、25.98％。

也可以在固体培养基上挑取单菌落接入经121℃灭菌15min的LB 液体培养基中，170rpm，28℃下培养11h，得到菌液，效果近似。

实施例5

取实施例3制备的新鲜菌液，将菌液加入到含有重金属镉的污染土壤中，搅拌均匀，培养15d，保证含水量为27％，15天后，将土壤在70℃下烘干，准确称取1g，用BCR连续提取法，提取土壤中各种形态的镉和铜。具体做法如下：

a.可交换态：准确称取通过100目筛的风干土壤样品1g，加 40mL 0.1mol/L的HAc，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后5000r/min下离心16min；取上清液，用ICPAES测定Cd²⁺和Cu²⁺的含量；加入无菌水清洗残余物，振荡23min，离心，弃去清洗液；

b.可还原态：向a离心分离出的残渣中加入40mL0.5mol/L的盐酸羟胺，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后5000r/min 下离心17min；其余步骤同步骤a；

c.可氧化态：向b离心分离出的残渣中加入10mL H₂O₂，搅拌均匀，室温下静置1h左右后用水浴加热保持85℃±2℃1h左右，再加入10mLH₂O₂，在恒温水浴箱中加热保持85℃±2℃1h左右；冷却后，加入50mL 1mol/L的NH₄Ac，放在恒温振动器中24±1℃下连续震荡16h，然后5000r/min下离心16min；其余步骤同步骤a；

d.残余态：向c离心分离出的残渣中加入10mL HNO₃，使酸和样品充分混合均匀；进行微波消解(参考EPA3052中的微波消解法)；

e.测总量：准确称取过100目筛的风干土壤样品0.5g，加入 10mL HNO₃，微波消解方法同上；

f.水洗脱：将处理前后的土壤样品烘干或自然风干后过100目筛，准确称取5g土壤，加入20ml无菌水，置于恒温振荡器中振荡洗脱16h，然后离心测定上清液中被洗脱下来镉的量。表2为各种形态的镉检测结果，表1为各种形态的镉检测结果，表2为各种形态的铜检测结果。由表1可知，加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态镉在10d内由33.28mg/kg降到1.73mg/kg；用水洗脱土壤，未检出 Cd²⁺，这说明本发明菌株对土壤中的镉具有极强的钝化能力；通过总量的检测，处理前后的镉总量基本一致，检测方法未造成镉的增加或减少，各种状态下的镉含量检测准确。由表2可知，加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态铜在10d内由16.04mg/kg降到 0.45mg/kg；用水洗脱土壤，未检出Cu²⁺，这说明本发明菌株对土壤中的铜具有较强的钝化能力；通过总量的检测，处理前后的铜总量基本一致，检测方法未造成铬的增加或减少，各种状态下的铬含量检测准确。也可以在固体培养基上挑取单菌落接入经121℃灭菌15min的 LB液体培养基中，170rpm，30℃下培养12h，得到菌液；或者采用实施例3制备的真空干燥后冻干的菌体；效果近似。

表1土壤中各形态镉检测结果(mg/kg)

表2土壤中各形态铜检测结果(mg/kg)

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 苏州中益世纪生态环境设计研究有限公司

苏州逸凡特环境修复有限公司

<120> 微生物菌株及其筛选方法与在处理重金属污染土壤中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1454

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atacatgcaa gtcgagcgaa tggattgaga gcttgctctc aagaagttag cggcggacgg 60

gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccataa gactgggata actccgggaa accggggcta 120

ataccggata acattttgaa ccgcatggtt cgaaattgaa aggcggcttc ggctgtcact 180

tatggatgga cccgcgtcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga 240

tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300

tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg 360

cgtgagtgat gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt tagggaagaa caagtgctag 420

ttgaataagc tggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 480

cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg 540

caggtggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg gtcattggaa 600

actgggagac ttgagtgcag aagaggaaag tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt 660

agagatatgg aggaacacca gtggcgaagg cgactttctg gtctgtaact gacactgagg 720

cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780

agtgctaagt gttagagggt ttccgccctt tagtgctgaa gttaacgcat taagcactcc 840

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tgattggggt gaag 1454

Claims

1.一种微生物菌株，其特征在于：所述微生物菌株为苏云金芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC NO:M 2017830。

2.权利要求1所述微生物菌株在重金属污染土壤处理或制备重金属污染土壤处理试剂中的应用。

3.一种重金属污染土壤处理试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，将权利要求1所述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液为重金属污染土壤处理试剂；或将权利要求1所述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液，将菌液真空冷冻干燥后制备重金属污染土壤处理试剂。

4.一种重金属污染土壤的处理方法，其特征在于：将权利要求1所述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理。

5.根据权利要求3或者4所述的方法，其特征在于：所述培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基或者牛肉膏蛋白胨液体培养基；所述重金属为镉和铜。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、其余为蒸馏水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、1.5~2.5%琼脂、其余为蒸馏水。

7.权利要求1所述微生物菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将镉和铜共同污染的土壤与牛肉膏蛋白胨液体培养基振荡混合，获得土壤混合液；然后将土壤混合液离心，得到上清液；

（2）将步骤（1）得到的上清液接种到含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，经过复数次培养、离心、取上清液，获得菌液；然后将菌液在牛肉膏蛋白胨液体培养基上进行平板划线，分离出单菌落；

（3）取步骤（3）获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液，将上清液梯度稀释后涂布于含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在28~30℃培养3~4天，比较菌株的生长状况，从中筛选出目标微生物菌株。

8.根据权利要求7所述微生物菌株的筛选方法，其特征在于：步骤（1）中，所述振荡混合在玻璃珠存在下进行，振荡混合的温度为28~30℃，速度为160~170rpm；步骤（2）中，所述复数次为3~5次，所述培养为在28~30℃下振荡培养，所述含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，Cd²⁺的含量为100 mg/L，Cu²⁺的含量为50 mg/L。

9.根据权利要求7所述微生物菌株的筛选方法，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、1.5~2.5%琼脂、其余为去离子水。

10.根据权利要求7所述微生物菌株的筛选方法，其特征在于，步骤（3）中，将上清液分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后将不同浓度梯度的上清液分别涂布于含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在28~30℃培养3~4d；选取在稀释10^-6倍数时易于菌株单独分离、在含有100 mg/L Cd²⁺和50 mg/L Cu²⁺牛肉膏蛋白胨固体培养基上能正常生长的菌株划线分离，得到目标微生物菌株；所述含有镉和铜的牛肉膏蛋白胨固体培养基为含有20 mg/L Cd²⁺以及10 mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有40mg/L Cd²⁺以及20 mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有60 mg/L Cd²⁺以及30mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有80 mg/L Cd²⁺以及40 mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基和含有100 mg/L Cd²⁺以及50 mg/L Cu²⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基。