CN108486021A

CN108486021A - 微生物菌株及其筛选方法与在重金属污染土壤处理中的应用

Info

Publication number: CN108486021A
Application number: CN201810506695.9A
Authority: CN
Inventors: 贺志刚; 王佳斌; 蔡慧; 程刚
Original assignee: Suzhou Yifante Environment Restoration Co ltd; Suzhou Zhongyishiji Ecological Environment Design Research Co ltd
Current assignee: Suzhou Yifante Environment Restoration Co ltd; Suzhou Zhongyishiji Ecological Environment Design Research Co ltd
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: CN108486021B

Abstract

本发明公开了微生物菌株的筛选方法及其在重金属污染土壤处理中的应用，得到的微生物菌株为氧化烃微杆菌，保藏编号为CCTCC NO:M 2017835；将微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理。本发明的微生物菌株对土壤中的重金属铬、铜具有较强的钝化作用以及耐受作用，通过钝化作用将铬、铜固定在污染土壤中，降低铬的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复土壤的目的。

Description

微生物菌株及其筛选方法与在重金属污染土壤处理中的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，是设计一种微生物菌株及其筛选方法与其在重金属污染土壤处理中的应用。

背景技术

皮革加工、木材防腐、冶金、电镀、颜料、军工等无机化工行业中常使用到重金属铬及其化合物，比如为了防止工业生产过程中循环水对设备的腐蚀，常使用的铬酸盐。在这些产品的生产使用过程当中不可避免地产生含铬废水、废气和废渣，其排放可能会污染周边场地和地下水。工业部门排放的废水和废气，是环境中铬的人为来源。工业废水中的铬主要是三价化合物，三价铬和六价铬对人体健康都有害，被怀疑有致癌作用。三价铬有致畸作用。土壤中铬过多时，会抑制有机物质的硝化作用，并使铬在植物体内蓄积。一般认为六价铬的毒性强，更易为人体吸收，而且可在体内蓄积。六价铬的毒性比三价铬要高100倍，是强致突变物质，可诱发肺癌和鼻咽癌。

冶金、水泥等工业，以及煤和石油燃烧的废气中，而铜由于农药的滥用极易残留在土壤中。铜的化合物以一价或二价状态存在。

在冶炼、金属加工、机器制造、有机合成及其他工业的废水中都含有铜，其中以金属加工、电镀工厂所排废水含铜量最高，每升废水含铜几十至几百毫克。这种废水排入水体，会影响水的质量。水中铜含量达0.01毫克/升时，对水体自净有明显的抑制作用；超过3.0毫克/升,会产生异味；超过15毫克/升，就无法饮用。若用含铜废水灌溉农田,铜在土壤和农作物中累积,会造成农作物特别是水稻和大麦生长不良，并会污染粮食籽粒。灌溉水中硫酸铜对水稻危害的临界浓度为0.6毫克/升。铜对水生生物的毒性很大，有人认为铜对鱼类毒性浓度始于0.002毫克/升,但一般认为水体含铜0.01毫克/升对鱼类是安全的。在一些小河中，曾发生铜污染引起水生生物的急性中毒事件；在海岸和港湾地区，曾发生铜污染引起牡蛎肉变绿的事件。

重金属污染土壤的修复方法可分为物理法、化学法以及生物法。物理方法往往工程量大，能耗大；化学方法大多花费高，易造成二次污染；生物法中的植物修复受到较多研究人员的青睐，但植物生长缓慢，修复周期长。目前比较受关注的修复技术大多处于实验室试验阶段，且实验效果也不够理想，在实地修复中，我国并没有很好的成功案例。因此，寻找一种高效节能，经济环保的修复措施至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种修复重金属铬、铜污染土壤的微生物菌株及其筛选方法和应用，所获得的微生物菌株对土壤中的重金属铬、铜具有较强的钝化作用以及耐受作用，通过钝化作用将铬、铜固定在污染土壤中，降低铬的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复土壤的目的。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种针对重金属污染土壤处理的微生物菌株，为氧化烃微杆菌，已于2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017835；保藏地址为中国武汉，武汉大学，命名为氧化烃微杆菌G-Cr32。

本发明还公开了上述处理重金属污染土壤的微生物菌株的筛选方法，包括以下步骤：

(1)将铬和铜污染土壤与高氏一号液体培养基振荡混合，获得土壤混合液；然后将土壤混合液离心，得到上清液；

(2)将步骤(1)得到的上清液接种到含有铬和铜的高氏一号液体培养基中，经过重复次数培养、离心、取上清液，获得菌液；然后将菌液在高氏一号液体培养基上进行平板划线，分离出单菌落；

(3)取步骤(2)获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液，将上清液梯度稀释后分别涂布含有铬和铜的高氏一号固体培养基，在28～30℃培养2～3天，比较菌株的生长状况，从中筛选出目标微生物菌株。

上述技术方案中，步骤(1)中，所述振荡混合在玻璃珠存在下进行，振荡混合的温度为28～30℃，速度为160～170rpm。

上述技术方案中，步骤(2)中，所述复数次为3～5次，所述培养为在28～30℃、160～170rpm下振荡培养，所述含有铬和铜的高氏一号液体培养基中，Cr⁶⁺的含量为60mg/L，Cu² ⁺的含量为30mg/L，之后再逐步提高铬、铜浓度，浓度梯度为Cr⁶⁺70mg/L，Cu²⁺35mg/L；Cr⁶⁺80mg/L，Cu²⁺40mg/L；Cr⁶⁺90mg/L，Cu²⁺45mg/L；即将步骤(1)得到的上清液接种到第一含有重金属的高氏一号液体培养基中，经过3～5次培养、离心、取上清液，获得第一菌液；将第一菌液接种到第二含有重金属的高氏一号液体培养基中，经过3～5次培养、离心、取上清液，获得第二菌液；将第二菌液接种到第三含有重金属的高氏一号液体培养基中，经过3～5次培养、离心、取上清液，获得第三菌液；将第三菌液接种到第四含有重金属的高氏一号液体培养基中，经过3～5次培养、离心、取上清液，获得第四菌液；然后将第四菌液在高氏一号液体培养基上进行平板划线，分离出单菌落；所述第一含有重金属的高氏一号液体培养基中，Cr⁶⁺的含量为60mg/L，Cu²⁺的含量为30mg/L；所述第二含有重金属的高氏一号液体培养基中，Cr⁶⁺的含量为70mg/L，Cu²⁺的含量为35mg/L；所述第三含有重金属的高氏一号液体培养基中，Cr⁶⁺的含量为80mg/L，Cu²⁺的含量为40mg/L；所述第四含有重金属的高氏一号液体培养基中，Cr⁶⁺的含量为90mg/L，Cu²⁺的含量为45mg/L；优选驯化在30℃、160～170rpm下振荡培养，每个浓度梯度重复两次；通过上述富集培养的方式对微生物菌株进行，驯化完成后获得的菌液，在高氏一号固体培养基进行平板划线，分离单菌落。

步骤(3)中，将上清液分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后将不同浓度梯度的上清液分别涂布于含有梯度铬、铜浓度的高氏一号固体培养基，在28～30℃培养2～3d；选取在稀释10^-5倍数时易于菌株单独分离、在含有100mg/L Cr⁶⁺与50mg/LCu²⁺的高氏一号固体培养基上能正常生长，培养后取该条件下菌株划线分离，得到目标微生物菌株；步骤(3)具体为取步骤(2)获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液，将上清液分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后将不同浓度梯度的上清液分别涂布含有铬与铜的高氏一号固体培养基，在28～30℃培养2～3天；选取在稀释10^-5倍数时易于菌株单独分离、在含有100mg/L Cr⁶⁺与50mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基上能正常生长，培养后取该条件下菌株划线分离，得到目标微生物菌株；所述含有铬和铜的高氏一号固体培养基为含有40mg/L Cr⁶⁺以及20mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基、含有60mg/L Cr⁶⁺以及30mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基、含有80mg/L Cr⁶⁺以及40mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基、含有100mg/L Cr⁶⁺以及50mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基、含有200mg/L Cr⁶⁺以及100mg/LCu²⁺的高氏一号固体培养基和含有300mg/L Cr⁶⁺以及150mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基。

上述技术方案中，所述高氏一号液体培养基的pH为7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：0.1％～0.3％硝酸钾、0.05％～0.1％硫酸镁、0.05％～0.1％氯化钠、0.05％～0.1％磷酸氢二钾、0.001％～0.005％硫酸亚铁、2％～2.5％可溶性淀粉、其余为蒸馏水；所述高氏一号固体培养基的pH为7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：0.1％～0.3％硝酸钾、0.05％～0.1％硫酸镁、0.05％～0.1％氯化钠、0.05％～0.1％磷酸氢二钾、0.001％～0.005％硫酸亚铁、2％～2.5％可溶性淀粉、1.5～2.5％琼脂、其余为蒸馏水。优选的，所述高氏一号液体培养基包括以下质量百分数的组分：0.1％～0.3％硝酸钾、0.05％～0.1％硫酸镁、0.05％～0.1％氯化钠、0.05％～0.1％磷酸氢二钾、0.001％～0.005％硫酸亚铁、2％～2.5％可溶性淀粉、其余为蒸馏水；所述高氏一号固体培养基包括以下质量百分数的组分：0.1％～0.3％硝酸钾、0.05％～0.1％硫酸镁、0.05％～0.1％氯化钠、0.05％～0.1％磷酸氢二钾、0.001％～0.005％硫酸亚铁、2％～2.5％可溶性淀粉、1.5～2.5％琼脂、其余为蒸馏水。

通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，根据Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定；在比对匹配度最高的结果中，菌种所测得到的16s rDNA序列部分(SEQ ID NO:1所示)与Microbacterium(微杆菌属)的16s rDNA序列有100％的同源性，可确定菌属为Microbacterium(微杆菌属)，与已知菌种的匹配中，与Microbacterium hydrocarbonoxydans(氧化烃微杆菌)的16s rDNA有100％同源性；与Microbacterium hydrocarbonoxydans(氧化烃微杆菌)在RDP-II数据库中，序列相似性最高；可确定菌种为Microbacterium hydrocarbonoxydans(氧化烃微杆菌)，命名为氧化烃微杆菌G-Cr32。

上述技术方案中，重金属污染土壤采自于苏州大型化工厂物料堆积点土壤，由于土壤用途不同，理化性质、所受到的污染种类等方面均有不同，使用不同的筛选方法均可以筛选出不同菌株。

本发明还公开了一种重金属污染土壤处理试剂的制备方法，包括以下步骤，将上述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液为重金属污染土壤处理试剂；或将菌液真空冷冻干燥后制备重金属污染土壤处理试剂。

本发明还公开了上述微生物菌株在重金属污染土壤处理或制备重金属污染土壤处理试剂中的应用，优选的，所述重金属为铬与铜。加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态铬在10d内由36.49mg/kg降到0.78mg/kg，可交换态铜在10d内由17.89mg/kg降到2.34mg/kg；用水洗脱土壤，未检出铬，检出少量铜，这说明本发明菌株对土壤中的铬具有极强的钝化能力，本发明菌株对土壤中铜具有较强钝化能力，同时也说明土壤中铬与铜存在一定竞争吸附。此外，本发明所述菌株在水相中对铬、铜具有极强的耐受性以及较强的钝化能力；土壤中可交换态重金属的含量越低，则土壤中重金属的钝化效果越好，植物可利用度越低。

本发明还公开了一种重金属污染土壤的处理方法，将上述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理。

上述技术方案中，所述培养基为高氏一号固体培养基或者高氏一号液体培养基；所述重金属为铬和铜。

上述技术方案中，所述高氏一号液体培养基的pH为7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：0.1％～0.3％硝酸钾、0.05％～0.1％硫酸镁、0.05％～0.1％氯化钠、0.05％～0.1％磷酸氢二钾、0.001％～0.005％硫酸亚铁、2％～2.5％可溶性淀粉、其余为蒸馏水；所述高氏一号固体培养基的pH为7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：0.1％～0.3％硝酸钾、0.05％～0.1％硫酸镁、0.05％～0.1％氯化钠、0.05％～0.1％磷酸氢二钾、0.001％～0.005％硫酸亚铁、2％～2.5％可溶性淀粉、1.5～2.5％琼脂、其余为蒸馏水。

本发明优选的，所述高氏一号液体培养基包括以下质量百分数的组分：0.1％硝酸钾、0.05％硫酸镁、0.05％氯化钠、0.05％磷酸氢二钾、0.001％硫酸亚铁、2％可溶性淀粉、其余为蒸馏水；所述高氏一号固体培养基包括以下质量百分数的组分：0.1％硝酸钾、0.05％硫酸镁、0.05％氯化钠、0.05％磷酸氢二钾、0.001％硫酸亚铁、2％可溶性淀粉、1.5～2.5％琼脂、其余为蒸馏水。

作为优选，所述微生物菌株接种于培养基时，接种量为2％。

本发明筛选方法中所采用的高氏一号固体培养基、高氏一号液体培养基，与微生物菌株培养基中采用的高氏一号固体培养基、高氏一号液体培养基，可采用相同或不同的组分配比。国内外虽然已经开展了铬、铜污染土壤的修复研究，但是物理化学方法成本高工艺复杂，已筛选的降解菌耐受性差，实际应用受限；本发明针对现有治理重金属污染土壤的方法具有一定局限性、实施成本高、对土壤破坏严重、易带来其他污染等问题，通过筛选出功能性微生物菌株的生物钝化作用来实现对污染土壤的原位修复。本发明从受重金属铬、铜污染的土壤中筛选出的丝鳍链霉菌能够将土壤中的可交换态铬、铜钝化显著降低其含量，同时对铬具有极强的耐受性，对土壤扰动小，具有较强的生物修复功能，能够应用于修复重金属污染土壤和制备重金属污染修复材料中，且具有成本低、效果好、操作方便、对土壤扰动小等特点。

附图说明

图1为本发明筛选的微生物菌株的生长曲线。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的微生物菌株及其筛选方法与在重金属污染土壤处理中的应用进行详细说明。

本发明实施例公开了一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的微生物菌株和相关应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术

实施例1

本发明处理重金属污染土壤的微生物菌株的筛选采用液相富集法，包括以下步骤：

(1)称取Cr⁶⁺与Cu²⁺污染土壤样品(化工厂土壤、经过筛预处理)5g，加入到装有高氏一号液体培养基的三角瓶中，加入玻璃珠，将三角瓶在28℃、160rpm下振荡，获得土壤混合液；

(2)将土壤混合液转入离心管，取离心后的上清液作为铬、铜钝化微生物的来源；

(3)将步骤(2)获得的上清液接种到含有铬、铜的高氏一号液体培养基中，其中Cr⁶⁺的含量为60mg/L，Cu²⁺的含量为30mg/L(Cr⁶⁺和Cu²⁺浓度之比为2：1)，在30℃、170rpm下振荡培养，培养完成后，离心，用无菌吸管吸取1mL上清液，移入另一个Cr⁶⁺的含量为60mg/L、Cu²⁺的含量为30mg/L的高氏一号液体培养基中，进行培养离心，反复三次；之后再逐步提高Cr⁶⁺与Cu²⁺浓度，浓度梯度为Cr⁶⁺70mg/L、Cu²⁺35mg/L，Cr⁶⁺80mg/L、Cu²⁺40mg/L，Cr⁶⁺90mg/L、Cu²⁺45mg/L，驯化在30℃、160rpm下振荡培养，每个浓度梯度重复两次，共六次；通过上述富集培养的方式对微生物菌株进行，驯化完成后获得的菌液，在高氏一号固体培养基进行平板划线，分离单菌落；

(4)取步骤(3)获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液，上清液分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，吸取2mL分别涂布于含有不同浓度Cr⁶⁺与Cu²⁺的高氏一号固体培养基(六种)上，其中Cr⁶⁺的浓度为40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L，对应的Cu²⁺的浓度为20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L(每一种梯度高氏一号固体培养基中，Cr⁶⁺与Cu²⁺浓度比为2：1)，28℃培养2d；比较菌株的生长状况；

选取在稀释10^-5倍数时易于菌株单独分离，在含有100mg/L Cr⁶⁺、50mg/L Cu²⁺高氏一号固体培养基上能正常生长，培养后取该条件下菌株划线分离。

通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，命名为氧化烃微杆菌G-Cr32，已于2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017835；保藏地址为中国武汉武汉大学。

根据Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定；在比对匹配度最高的结果中，菌种所测得到的16s rDNA序列部分(SEQ ID NO:1所示)与Microbacterium(微杆菌属)的16s rDNA序列有100％的同源性，可确定菌属为Microbacterium(微杆菌属)，与已知菌种的匹配中，与Microbacteriumhydrocarbonoxydans(氧化烃微杆菌)的16s rDNA有100％同源性；与Microbacteriumhydrocarbonoxydans(氧化烃微杆菌)在RDP-II数据库中，序列相似性最高；可确定菌种为Microbacterium hydrocarbonoxydans(氧化烃微杆菌)。

本发明筛选的微生物菌株的序列(SEQ ID NO:1)如下：

TTCGACGGCTCCCTCCCAAGGGTTAGGCCACCGGCTTCAGGTGTTACCGACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGAGGTCGAGTTGCAGACCTCAATCCGAACTGGGACCGGCTTTTTGGGATTCGCTCCACCTCACGGTATTGCAGCCCTTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTATCCCATGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACATAGAACGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTTTACGAGTGTCCAAAGAGTTGACCATTTCTGGCCCGTTCTCGTATATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGTCACGGAATCCGTGGAATGGACCCCACAACTAGTTCCCAACGTTTACGGGGTGGACTACCAGGGTATCTAAGCCTGTTTGCTCCCCACCCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACGGCCCAGAGATCTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTCCACCGCTACACCAGGAATTCCAATCTCCCCTACCGCACTCTAGTCTGCCCGTACCCACTGCAGGCCCGAGGTTGAGCCTCGGGATTTCACAGCAGACGCGACAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTTTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTAAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTTGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGACGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGAGCCCATCCCCAACCGAAATTCTTTCCAACCACTGAAGATGCCTTCGCGGTTCGTATCCAGTATTAGACGCCGTTTCCAGCGCTTATCCCAGAGTCAGGGGCAGGTTGCTCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTGATCCCACAGAGCAAGCTCCGTGTTCACCGTTCGACTGCATGTG

将上述菌株接种于高氏一号液体培养基中，接种量为2％，30℃、170rpm下振荡培养，间歇取样。如图1所示，为菌株的生长曲线，4h时，进入对数生长期，10h到达稳定期，25h后生长有下降趋势，进入衰亡期，浓度最高能达到OD600为1.1。

本实施例中，高氏一号液体培养基的pH为7.6，包括以下质量百分数的组分：0.1％硝酸钾、0.05％硫酸镁、0.05％氯化钠、0.05％磷酸氢二钾、0.001％硫酸亚铁、2％可溶性淀粉其余为蒸馏水；高氏一号固体培养基的pH为7.4，包括以下质量百分数的组分：0.1％硝酸钾、0.05％硫酸镁、0.05％氯化钠、0.05％磷酸氢二钾、0.001％硫酸亚铁、2％可溶性淀粉、2％琼脂、其余为蒸馏水。

实施例2

将本发明筛选的微生物菌株接种于经121℃灭菌30min的高氏一号液体培养基中(接种量2％)，培养(160rpm，28℃下培养10-12h)至对数生长期，得到菌液。

可以将菌液加入含有Cr⁶⁺和Cu²⁺的污染土壤中，混合均匀，培养10d左右，用BCR连续提取法，提取土壤中各种形态的铬与铜；并用清水洗脱土壤，测定可被植物吸收利用的可交换态铬、铜，用ICP-AES检测。

或将菌液用真空冷冻干燥机冻干后加入含有Cr⁶⁺和Cu²⁺的污染土壤中，混合均匀，培养10d左右，用BCR连续提取法，提取土壤中各种形态的Cr⁶⁺和Cu²⁺；并用清水洗脱土壤，测定可被植物吸收利用的可交换态铬、铜，用ICP-AES检测。

高氏一号液体培养基的pH为7.6，包括以下质量百分数的组分：0.1％硝酸钾、0.05％硫酸镁、0.05％氯化钠、0.05％磷酸氢二钾、0.001％硫酸亚铁、2％可溶性淀粉、其余为蒸馏水。

实施例3

向高氏一号液体培养基中加入不同浓度的Cr⁶⁺和Cu²⁺，其中Cr⁶⁺浓度为10、20、50、80、100mg/L，与之对应的Cu²⁺浓度为5、10、25、40、50mg/L，121℃灭菌15min；然后接种本发明筛选的微生物菌株，28℃、160rpm下培养，不同时间取样测OD值；在Cr⁶⁺浓度分别为10、20、50、80、100mg/L，,与之对应的Cu²⁺浓度分别为5、10、25、40、50mg/L时，该菌株分别在4、5、9、16、20h时进入对数生长期，能达到的最高OD值分别为0.97、0.85、0.69、0.44和0.23，从数据表明，该菌株对Cr⁶⁺和Cu²⁺具有极强的耐受能力。

上述接种本发明筛选的微生物菌株为取质量分数为2％新鲜菌液，或在高氏一号固体培养基上挑取单菌落接入培养基中，本实施例为取质量分数为2％新鲜菌液。

实施例4

本发明筛选的微生物菌株接种经121℃灭菌30min的高氏一号液体培养基中，160rpm，30℃下培养12h，然后将菌液加入含有Cr⁶⁺和Cu²⁺的高氏一号液体培养基中，其中Cr⁶ ⁺浓度为10、20、50、80、100mg/L，对应Cu²⁺的浓度为5、10、25、40、50mg/L，继续振荡培养12h后，取8ml菌液，8000rpm离心7min，用ICP-AES检测上清液中残余Cr⁶⁺和Cu²⁺的浓度。

公式如下:

I＝aC

I为谱线强度，a为常数(通过预先测定的标准曲线确定，常识)，C为重金属的浓度。

本发明筛选的微生物菌株对10、20、50、80、100mg/L Cr⁶⁺的去除率分别为98.67％、88.29％、79.66％、56.87％、34.65％；对5、10、25、40、50mg/L Cu²⁺的去除率分别为88.89％、78.96％、59.75％、50.21％、46.89％。

上述接种本发明筛选的微生物菌株为取2％的新鲜菌液，或在高氏一号固体培养基上挑取单菌落接入培养基中，两者效果近似；本实施例为取2％的新鲜菌液。

高氏一号液体培养基的pH为7.5，包括以下质量百分数的组分：0.1％硝酸钾、0.05％硫酸镁、0.05％氯化钠、0.05％磷酸氢二钾、0.001％硫酸亚铁、2％可溶性淀粉、其余为蒸馏水；高氏一号固体培养基的pH为7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：0.1％硝酸钾、0.05％硫酸镁、0.05％氯化钠、0.05％磷酸氢二钾、0.001％硫酸亚铁、2％可溶性淀粉、2.5％琼脂、其余为蒸馏水。

实施例5

取实施例2制备的菌液加入到实验室制备的Cr⁶⁺和Cu²⁺污染土壤中，其中铬的含量各为100mg/kg，铜的含量为50mg/kg，搅拌均匀，培养10d，保证含水量为20％，10天后，将土壤在60℃下烘干，准确称取1g，用BCR连续提取法，提取土壤中各种形态的铬与铜。具体做法如下：

a.可交换态：准确称取通过100目筛的风干土壤样品1g，加40mL0.1mol/L的HAc，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后5000r/min下离心20min；取上清液，用ICP-AES测定铬与铜含量；加入蒸馏水清洗残余物，振荡30min，离心，弃去清洗液；

b.可还原态：向a离心分离出的残渣中加入40mL0.5mol/L的盐酸羟胺，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后5000r/min下离心20min；其余步骤同步骤a；

c.可氧化态：向b离心分离出的残渣中加入10mLH₂O₂，搅拌均匀，室温下静置1h左右后用水浴加热保持85℃±2℃1h左右，再加入10mLH₂O₂，在恒温水浴箱中加热保持85℃±2℃1h左右；冷却后，加入50mL1mol/L的NH₄Ac，放在恒温振动器中24±1℃下连续震荡16h，然后5000r/min下离心15-20min；其余步骤同步骤a；

d.残余态：向c离心分离出的残渣中加入10mLHNO₃、5mLH₂O₂、8mLHF，放置1h后，盖上消解罐盖，放入微波消解仪中按照设定程序消解，微波消解条件见表1。消解结束后冷却，取出。置于电热板上赶酸完全后，加入20mLHNO₃(1:4)和10mLHCl(1:1)加盖后，低温加热2h.如果有沉淀过滤后，用去离子水定容至50mL，摇匀备用；

表1微波消解条件

e.测总量：准确称取过100目筛的风干土壤样品0.5g，加入10mLHNO₃、5mLH₂O₂、8mLHF，微波消解方法同上；

f.水洗脱：将处理前后的土壤样品烘干或自然风干后过100目筛，准确称取5g土壤，加入20ml蒸馏水，置于恒温振荡器中振荡洗脱16h，然后离心测定上清液中被洗脱下来铬的量。

表2为各种形态的铬检测结果，由表2可知，加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态Cr⁶⁺在10d内由36.49mg/kg降到0.78mg/kg；用水洗脱土壤，未检出铬，这说明本发明菌株对土壤中的铬具有极强的钝化能力。由表3可知，加入本发明微生物菌株的菌液后可交换态Cu²⁺在10d内由17.89mg/kg降到2.34mg/kg，用水洗脱土壤，检出少量铜，说明本发明菌株对土壤中铜具有较强钝化能力，同时也说明土壤中铬与铜存在一定竞争吸附；通过总量的检测，处理前后的铬、铜总量基本一致，检测方法未造成铬、铜的增加或减少，各种状态下的铬含量检测准确。也可以取真空干燥后冻干的菌体；效果近似。

表2土壤中各形态Cr⁶⁺检测结果(mg/kg)

表3土壤中各形态Cu²⁺检测结果(mg/kg)

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 苏州中益世纪生态环境设计研究有限公司

苏州逸凡特环境修复有限公司

<120> 微生物菌株及其筛选方法与在重金属污染土壤处理中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcgacggct ccctcccaag ggttaggcca ccggcttcag gtgttaccga ctttcatgac 60

ttgacgggcg gtgtgtacaa gacccgggaa cgtattcacc gcagcgttgc tgatctgcga 120

ttactagcga ctccgacttc atgaggtcga gttgcagacc tcaatccgaa ctgggaccgg 180

ctttttggga ttcgctccac ctcacggtat tgcagccctt tgtaccggcc attgtagcat 240

gcgtgaagcc caagacataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccgag 300

ttgaccccgg cagtatccca tgagttccca ccattacgtg ctggcaacat agaacgaggg 360

ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca 420

ccacctgttt acgagtgtcc aaagagttga ccatttctgg cccgttctcg tatatgtcaa 480

gccttggtaa ggttcttcgc gttgcatcga attaatccgc atgctccgcc gcttgtgcgg 540

gtccccgtca attcctttga gttttagcct tgcggccgta ctccccaggc ggggaactta 600

atgcgttagc tgcgtcacgg aatccgtgga atggacccca caactagttc ccaacgttta 660

cggggtggac taccagggta tctaagcctg tttgctcccc accctttcgc tcctcagcgt 720

cagttacggc ccagagatct gccttcgcca tcggtgttcc tcctgatatc tgcgcattcc 780

accgctacac caggaattcc aatctcccct accgcactct agtctgcccg tacccactgc 840

aggcccgagg ttgagcctcg ggatttcaca gcagacgcga caaaccgcct acgagctctt 900

tacgcccaat aattccggat aacgcttgcg ccctacgtat taccgcggct gctggcacgt 960

agttagccgg cgctttttct gcaggtaccg tcactttcgc ttcttccctg ctaaaagagg 1020

tttacaaccc gaaggccgtc atccctcacg cggcgttgct gcatcaggct ttcgcccatt 1080

gtgcaatatt ccccactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt 1140

ggccggtcac cctctcaggc cggctacccg tcgacgcctt ggtgagccat tacctcacca 1200

acaagctgat aggccgcgag cccatcccca accgaaattc tttccaacca ctgaagatgc 1260

cttcgcggtt cgtatccagt attagacgcc gtttccagcg cttatcccag agtcaggggc 1320

aggttgctca cgtgttactc acccgttcgc cactgatccc acagagcaag ctccgtgttc 1380

accgttcgac tgcatgtg 1398

Claims

1.一种微生物菌株，其特征在于：所述微生物菌株为氧化烃微杆菌，保藏编号为CCTCCNO:M 2017835。

2.权利要求1所述微生物菌株在重金属污染土壤处理或制备重金属污染土壤处理试剂中的应用。

3.一种重金属污染土壤处理试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，将权利要求1所述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液为重金属污染土壤处理试剂；或将权利要求1所述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液，将菌液真空冷冻干燥后制备重金属污染土壤处理试剂。

4.一种重金属污染土壤的处理方法，其特征在于：将权利要求1所述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理。

5.根据权利要求3或者4所述的方法，其特征在于：所述培养基为高氏一号固体培养基或者高氏一号液体培养基；所述重金属为铬与铜。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述高氏一号液体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：0.1%~0.3%硝酸钾、0.05%~0.1%硫酸镁、0.05%~0.1%氯化钠、0.05%~0.1%磷酸氢二钾、0.001%~0.005%硫酸亚铁、2%~2.5%可溶性淀粉、其余为蒸馏水；所述高氏一号固体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：0.1%~0.3%硝酸钾、0.05%~0.1%硫酸镁、0.05%~0.1%氯化钠、0.05%~0.1%磷酸氢二钾、0.001%~0.005%硫酸亚铁、2%~2.5%可溶性淀粉、1.5~2.5%琼脂、其余为蒸馏水。

7.权利要求1所述微生物菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将铬与铜污染土壤与高氏一号液体培养基振荡混合，获得土壤混合液；然后将土壤混合液离心，得到上清液；

（2）将步骤（1）得到的上清液接种到含有铬与铜的高氏一号液体培养基中，经过复数次培养、离心、取上清液，获得菌液；然后将菌液在高氏一号固体培养基上进行平板划线，分离出单菌落；

（3）取步骤（2）获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液，将上清液梯度稀释后分别涂布含有铬与铜的高氏一号固体培养基，在28~30℃培养2~3天，比较菌株的生长状况，从中筛选出目标微生物菌株。

8.根据权利要求7所述微生物菌株的筛选方法，其特征在于：步骤（1）中，所述振荡混合在玻璃珠存在下进行，所述振荡混合的温度为28~30℃，速度为160~170rpm；步骤（2）中，所述复数次为3~5次，所述含有铬与铜的高氏一号液体培养基中，Cr⁶⁺的含量为60mg/L，Cu²⁺的含量为30mg/L；步骤（3）中，将上清液分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后将不同浓度梯度的上清液分别涂布含有铬与铜的高氏一号固体培养基，在28~30℃培养2~3天；选取在稀释10^-5倍数时易于菌株单独分离、在含有100mg/L Cr⁶⁺与50mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基上能正常生长，培养后取该条件下菌株划线分离，得到目标微生物菌株；所述含有铬和铜的高氏一号固体培养基为含有40 mg/L Cr⁶⁺以及20 mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基、含有60 mg/L Cr⁶⁺以及30 mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基、含有80 mg/L Cr⁶⁺以及40 mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基、含有100 mg/L Cr⁶⁺以及50 mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基、含有200 mg/L Cr⁶⁺以及100 mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基、含有300 mg/L Cr⁶⁺以及150 mg/L Cu²⁺的高氏一号固体培养基。

9.根据权利要求7所述微生物菌株的筛选方法，其特征在于：所述高氏一号液体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：0.1%~0.3%硝酸钾、0.05%~0.1%硫酸镁、0.05%~0.1%氯化钠、0.05%~0.1%磷酸氢二钾、0.001%~0.005%硫酸亚铁、2%~2.5%可溶性淀粉、其余为蒸馏水；所述高氏一号固体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：0.1%~0.3%硝酸钾、0.05%~0.1%硫酸镁、0.05%~0.1%氯化钠、0.05%~0.1%磷酸氢二钾、0.001%~0.005%硫酸亚铁、2%~2.5%可溶性淀粉、1.5~2.5%琼脂、其余为蒸馏水。

10.根据权利要求7所述微生物菌株的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，将步骤（1）得到的上清液接种到第一含有重金属的高氏一号液体培养基中，经过3~5次培养、离心、取上清液，获得第一菌液；将第一菌液接种到第二含有重金属的高氏一号液体培养基中，经过3~5次培养、离心、取上清液，获得第二菌液；将第二菌液接种到第三含有重金属的高氏一号液体培养基中，经过3~5次培养、离心、取上清液，获得第三菌液；将第三菌液接种到第四含有重金属的高氏一号液体培养基中，经过3~5次培养、离心、取上清液，获得第四菌液；然后将第四菌液在高氏一号液体培养基上进行平板划线，分离出单菌落；所述第一含有重金属的高氏一号液体培养基中，Cr⁶⁺的含量为60mg/L，Cu²⁺的含量为30mg/L；所述第二含有重金属的高氏一号液体培养基中，Cr⁶⁺的含量为70mg/L，Cu²⁺的含量为35mg/L；所述第三含有重金属的高氏一号液体培养基中，Cr⁶⁺的含量为80mg/L，Cu²⁺的含量为40mg/L；所述第四含有重金属的高氏一号液体培养基中，Cr⁶⁺的含量为90mg/L，Cu²⁺的含量为45mg/L。