CN108893420A - 处理重金属污染土壤用微生物菌株及其筛选方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了处理重金属污染土壤用微生物菌株及其筛选方法与应用；筛选的微生物菌株为枯草芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC NO:M 2017831。将该微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；通过将高毒性的Cr6+还原成低毒性的Cr3+，来降低铬的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复受污染土壤的目的。

Description

处理重金属污染土壤用微生物菌株及其筛选方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，是一种修复重金属污染土壤用微生物菌 株及其筛选方法与应用。
背景技术
随着冶炼、采矿、化工等行业的快速发展，农田的不合理施肥及 污水灌溉等人为活动导致越来越多的重金属不断进入环境。重金属可 以经食物链转移，且具有三致作用，严重威胁着人类的健康安全。此 外，重金属活跃在各介质间，它们相互作用，循环运动，使得生态环 境遭到破坏，并最终归趋于土壤，对环境的长期性污染由此形成。污 染土壤的重金属元素主要包括汞(Hg)、镉(Cd)、铅(Pb)、铬(Cr) 和类金属砷(As)等具有显著性生物毒性元素，以及有一定毒性的锌 (Zn)、铜(Cu)、镍(Ni)等元素。
在土壤修复行业，已有的土壤修复技术已达到100多种，常用技 术也有十多种，大致可分为物理、化学和生物三大类。对于重金属污 染土壤，物理法有客土法、换土法、深耕翻土法、隔离包埋法和电动 修复法等；化学法有固化/稳定化法、化学淋洗法和热处理法等；生 物法有动物、植物和微生物修复法等。尽管物理和化学法有一定的重 金属去除效果，但存在成本高、解毒不彻底，适用性不广泛，易产生 二次污染等问题；在生物法中，由于微生物修复法具有无二次污染、 适用范围广等优点而被广泛关注。当前针对铬污染土壤的治理，物理 方法普遍需要耗费大量资金、人力物力，且移除的污染土壤又易引起 二次污染。化学方法则易再度活化重金属。生物方法也具有局限性， 如修复周期长，在实地修复中并没有很好的成功案例。目前多数受关 注的修复技术均处于实验室试验阶段，实际修复效果并不理想。因此， 寻找一种节能高效，经济环保的修复措施至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一微生物菌株及其筛选方法与该菌株在 处理重金属污染土壤中的应用，所获得的微生物菌株对土壤中的重金 属铬具有较强的耐受性以及钝化作用，通过将高毒性的Cr6+还原成低 毒性的Cr3+，来降低铬的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而 达到修复土壤污染的目的。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种处理重金属污染土壤用微生物菌株，为芽孢杆菌属，已于2017年12月 25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017831；保藏 地址为中国武汉，武汉大学，命名为芽孢杆菌NiuCr1(Bacillus sp.NiuCr1)。
本发明还公开了上述处理重金属污染土壤用微生物菌株的筛选 方法，包括以下步骤：
(1)将未受污染土壤与含有Cd6+的牛肉膏蛋白胨液体培养基混 合，振荡培养获得土壤混合液；然后将土壤混合液离心，得到上清液；
(2)将步骤(1)得到的上清液梯度稀释后分别涂布于含有Cd6+的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在37℃培养2天，比较菌株的生长 状况，从中筛选出目标微生物菌株。
将步骤(2)获得的微生物菌株接种到含有不同浓度Cd6+的牛肉 膏蛋白胨液体培养基中，培养2～3天后观察培养基中是否有该特异 菌株长出，无特异菌株长出的培养基浓度为该菌株最大耐受浓度。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述振荡培养的温度为28℃， 速度为150rpm，时间为72小时，对微生物菌株进行驯化，所述含有 Cd6+的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，Cd6+的浓度为100mg/L；步骤(2) 中，所述培养为倒置培养；步骤(2)中，将上清液分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后将不同浓度梯度的上 清液分别涂布于含有100mg/L Cd6+的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在 37℃培养2天；选取在稀释10-5倍数时易于菌株单独分离、在含有 100mg/L Cd6+的牛肉膏蛋白胨固体培养基上能正常生长的菌株划线 分离，得到目标微生物菌株，纯化后制作斜面保存。
上述技术方案中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为7.0～7.5， 包括以下质量百分数的组分：0.8～1.2％蛋白胨、0.4～0.6％牛肉浸膏、 0.3～0.6％氯化钠、其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的 pH为7.0～7.5，包括以下质量百分数的组分：0.8～1.2％蛋白胨、 0.4～0.6％牛肉浸膏、0.3～0.6％氯化钠、2～3％琼脂、其余为去离子水。
优选的，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组 分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、5％氯化钠、其余为去离子水；所述 牛肉膏蛋白胨固体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、 0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、2％琼脂、其余为去离子水。
本发明的土壤取自苏州大型化工厂物料堆积点或者东山镇农林 种植场，由于长期施用化肥、农药和禽畜粪便等，致使此种植场受到 重金属污染。
通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，根据Ezup柱式 细菌基因组DNA抽提试剂盒步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定； 在比对匹配度最高的结果中，菌种所测得到的16srDNA序列部分 (SEQ ID NO:1所示)与Bacillus sp.(芽孢杆菌属)的16srDNA序 列有100％的同源性，可确定菌属为Bacillus(芽孢杆菌属)，与已知 菌种的匹配中，与bacillus sp.(枯草芽孢杆菌)的16SrDNA序列有 100％的同源性；与bacillus sp.(枯草芽孢杆菌)在RDP-II数据库中 (S ab score:1.000)，序列相似性最高；可确定菌种为bacillus sp.(枯 草芽孢杆菌)，命名为芽孢杆菌NiuCr1。
本发明还公开了一种重金属污染土壤处理试剂的制备方法，包括 以下步骤，将上述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期， 获得菌液为重金属污染土壤处理试剂；或将菌液真空冷冻干燥后制备 重金属污染土壤处理试剂。
本发明还公开了上述微生物菌株在重金属污染土壤处理或制备 重金属污染土壤处理试剂中的应用，优选的，所述重金属为铬。加入 本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态铬在28d内由200mg/kg降 到0.115mg/kg；用水洗脱土壤，未检出Cr6+，这说明本发明菌株对土 壤中的铬具有极强的钝化能力。此外，本发明所述菌株在水相中对铬 具有极强的耐受性以及较强的钝化能力；土壤中可交换态铬的含量越 低，则土壤中铬的钝化效果越好，植物可利用度越低。
本发明还公开了一种重金属污染土壤的处理方法，将上述微生物 菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重 金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液 真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理。
上述技术方案中，所述培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基或者牛 肉膏蛋白胨液体培养基；所述重金属为铬。
上述技术方案中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为 7.0～7.5，包括以下质量百分数的组分：0.8～1.2％蛋白胨、0.4～0.6％牛 肉浸膏、0.3～0.6％氯化钠、其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体 培养基的pH为7.0～7.5，包括以下质量百分数的组分：0.8～1.2％蛋白 胨、0.4～0.6％牛肉浸膏、0.3～0.6％氯化钠、2～3％琼脂、其余为去离子 水。
优选的，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组 分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、5％氯化钠、其余为去离子水；所述 牛肉膏蛋白胨固体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、 0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、2％琼脂、其余为去离子水。
作为优选，所述微生物菌株接种于培养基时，接种量为2％。
本发明筛选微生物用的培养基与培养微生物的培养基可一样也 可不同。国内外虽然已经开展了铬污染土壤的修复研究，但是物理化 学方法成本高、工艺复杂；本发明针对现有治理重金属污染土壤的方 法具有一定局限性、实施成本高、对土壤破坏严重、易带来其他污染 等问题，通过利用筛选出功能性微生物菌株的生物钝化作用来实现对 污染土壤的原位修复。本发明从土壤中通过重金属铬培养基筛选出的 枯草芽孢杆菌对铬具有极强的耐受性，能够将土壤中的可交换态铬钝 化，同时对土壤扰动小，具有较强的生物修复功能，能够应用于修复 重金属污染土壤和制备重金属污染修复材料中，另外还具有成本低、 效果好、操作方便、对土壤扰动小等特点。
附图说明
图1为本发明筛选的微生物菌株的生长曲线。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的微生物 菌株及其筛选方法与在重金属污染土壤处理中的应用进行详细说明。
实施例1
本发明处理重金属污染土壤用微生物菌株的筛选采用液相富集 法，包括以下步骤：
在Cr6+含量为100mg/L的牛肉膏液体培养基加入过筛的未受污 染土样(东山镇农林种植场)，于振荡培养箱下28℃、150r/min驯化 培养72h，得到悬浊液；取5毫升的驯化后的悬浊液，离心后取上清 液，上清液分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8， 分别采用稀释涂布法均匀涂布在Cr6+含量为100mg/L的牛肉膏蛋白 胨固体培养基平板上，置于37℃恒温培养箱中倒置培养48h，挑选 在稀释10-5倍数时易于菌株单独分离、菌落形态不同的优势单菌落划 线分离，纯化后制作斜面保存。
通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，命名为芽孢杆菌 NiuCr1(Bacillus sp.NiuCr1)，已于2017年12月25日保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017831；保藏地址为中国武汉，武汉大 学。
本发明筛选的微生物菌株的鉴定根据Ezup柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定；在比对匹配度最 高的结果中，菌种所测得到的16srDNA序列部分(SEQ ID NO:1所 示)与Bacillus(芽孢杆菌属)的16srDNA序列有100％的同源性，可确定菌属为Bacillus(芽孢杆菌属)，与已知菌种的匹配中，与 bacillus sp.(枯草芽孢杆菌)的16SrDNA序列有100％的同源性；与 bacillus sp.(枯草芽孢杆菌)在RDP-II数据库中(S ab score:1.000)， 序列相似性最高；可确定菌种为bacillus sp.(枯草芽孢杆菌)，命名 为芽孢杆菌NiuCr1。
本发明筛选的微生物菌株的序列(SEQ ID NO:1)如下：
AGGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATCCATTCGCTCGA CTGCATG
将分离到的纯菌株接种到含Cr6+浓度分别为60mg/L、80mg/L、100 mg/L、120mg/L的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在30℃、160rpm下振 荡培养2～3天，每个浓度重复两次，共六次；通过上述富集培养的方 式对微生物菌株进行驯化完成后获得菌液，在牛肉膏蛋白胨固体培养 基进行平板划线，进行富集培养。
将上述菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为2wt％ 的新鲜菌液，30℃、170rpm下振荡培养，间歇取样。如图1所示， 为菌株的生长曲线，8h时，进入对数生长期，25h到达稳定期，55h 后生长有下降趋势，进入衰亡期，浓度最高能达到OD600为1.65。
实施例2
将本发明筛选的微生物菌株(质量分数为2％的新鲜菌液)接种 于经121℃灭菌30min的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，其中，牛肉膏 蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：0.5％牛肉膏、1％蛋 白胨、0.5％氯化钠、其余为蒸馏水，震荡培养(160rpm，30℃下培养 12h)至对数生长期，得到菌液。
可以将菌液加入含有重金属铬的污染土壤中，混合均匀，培养 10d左右，用BCR连续提取法，提取土壤中各种形态的铬；并用清 水洗脱土壤，测定可被植物吸收利用的可交换态铬，用ICP-AES检 测。具体做法如下：
a.可交换态：准确称取通过100目筛的风干土壤样品1g，加40mL 0.1mol/L的HAc，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后 5000r/min下离心20min；取上清液，用ICPAES测定Cr6+含量；加入 无菌水清洗残余物，振荡30min，离心，弃去清洗液；
b.可还原态：向a离心分离出的残渣中加入40mL0.5mol/L的盐 酸羟胺，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后5000r/min 下离心15min；其余步骤同步骤a；
c.可氧化态：向b离心分离出的残渣中加入10mL H2O2，搅拌 均匀，室温下静置1h左右后用水浴加热保持85℃±2℃1h左右，再 加入10mLH2O2，在恒温水浴箱中加热保持85℃±2℃1h左右；冷却 后，加入50mL 1mol/L的NH4Ac，放在恒温振动器中24±1℃下连续 震荡16h，然后5000r/min下离心20min；其余步骤同步骤a；
d.残渣态：向c离心分离出的残渣中加入10mL HNO3，使酸和 样品充分混合均匀；进行微波消解(参考EPA3052中的微波消解法)；
e.测总量：准确称取过100目筛的风干土壤样品0.5g，加入10mL HNO3，微波消解方法同上；
f.水洗脱：将处理前后的土壤样品烘干或自然风干后过100目 筛，准确称取5g土壤，加入20ml无菌水，置于恒温振荡器中振荡洗 脱16h，然后离心测定上清液中被洗脱下来铬的量。表1为各种形态 的铬检测结果。由表1可知，加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可 交换态铬在10d内由15.88mg/kg降到0.34mg/kg；用水洗脱土壤，未 检出Cr6+，这说明本发明菌株对土壤中的铬具有较强的钝化能力；通 过总量的检测，处理前后的铬总量基本一致，检测方法未造成铬的增 加或减少，各种状态下的铬含量检测准确。也可以取真空干燥后冻干 的菌体；效果近似。
表1土壤中各形态铬检测结果(mg/kg)
实施例3
向牛肉膏蛋白胨液体培养基(0.5％牛肉膏、1％蛋白胨、0.5％氯 化钠、其余为蒸馏水)中加入20，40，60，80，100mg/L的Cr6+， 121℃灭菌15min；然后接种本发明筛选的微生物菌株，30℃、170rpm 下培养，不同时间取样测OD值；在Cr6+浓度分别为20，40，60，80，100mg/L时，该菌株分别在9、10、15、21h、30时进入对数生长 期，能达到的最高OD值分别为1.4、1.3、0.89、0.6、0.34；数据表 明，该菌株对Cr6+仍具有极强的耐受能力。
上述接种本发明筛选的微生物菌株为取质量分数为2％的新鲜菌 液，或在牛肉膏蛋白胨固体培养基上挑取单菌落接入培养基中，本实 施例为取质量分数为2％的新鲜菌液。
实施例4
本发明菌株在水相对铬的钝化效果实验结果。
用100g/L K2Cr2O7溶液配置Cr6+的初始浓度分别为50mg/kg、200 mg/kg、550mg/kg、900mg/kg的土壤样品各1Kg，编号分别为1、2、 3、4，加入5％的常规营养液搅拌均匀，置于烧杯中，培养箱中培养， 定期取样测定毒性浸出液中Cr6+浓度。
表2为菌株在水相对不同初始Cr6+浓度的钝化效果结果，由表2 可知，28天后，在Cr6+的初始浓度分别为50mg/kg、200mg/kg、550 mg/kg、900mg/kg的四个样品中，Cr6+去除率最高的为浓度为200 mg/kg的2号，28d后去除率达到99.1％，而浓度为500mg/kg的3 号，去除率为94.8％，浓度为900mg/kg的土样Cr6+去除率较低，这 是因为Cr6+具有强烈的毒性，且其浓度超过了微生物的最高耐受浓 度，故强烈抑制微生物的生长及其活性。也可以取真空干燥后冻干的 菌体；效果近似。
表2菌株在水相对铬的钝化效果(mg/kg)
实施例5
添加外源营养物质对土壤中Cr6+去除的影响结果
取6份土壤样品各100g，分别加入不同成分的营养物质，在28℃ 培养箱中培养7d，取样测酸性毒性浸出液中Cr6+浓度。
与未加营养物质的处理相比，营养物质的添加可以显著提高了土 著微生物将Cr6+还原的程度。液体的营养物质进入土壤能继续快速地 往下层土壤渗透，持续作用更久，与土壤颗粒和的接触更充分，易于 土壤中微生物的摄食利用，营养液的主要成分为乳酸乙酯，乳酸乙酯 由乳酸和乙醇在硫酸存在下酯化而得，工业生产，价格便宜，是一种 环保溶剂，而且对土壤的扰动性小，从经济和实用的角度，可将其作 为处理过程中添加的营养物质。
表3不同营养物质的加入对酸性浸出液中Cr6+浓度的影响
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思 想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发 明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和 修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 苏州逸凡特环境修复有限公司
苏州中益世纪生态环境设计研究有限公司
<120> 处理重金属污染土壤用微生物菌株及其筛选方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggcggctgg ctccaaaagg ttaccccacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt 60
gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta 120
ctagcgattc cagcttcatg taggcgagtt gcagcctaca atccgaactg agaacggttt 180
tatgagatta gctccacctc gcggtcttgc agctctttgt accgtccatt gtagcacgtg 240
tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300
tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact aaatgatggc aactaagatc aagggttgcg 360
ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc 420
tgtcactctg ctcccgaagg agaagcccta tctctagggt tgtcagagga tgtcaagacc 480
tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540
ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600
gttaacttca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc gtttacggcg 660
tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc agtgtcagtt 720
acagaccaga aagtcgcctt cgccactggt gttcctccat atctctacgc atttcaccgc 780
tacacatgga attccacttt cctcttctgc actcaagtct cccagtttcc aatgaccctc 840
cacggttgag ccgtgggctt tcacatcaga cttaagaaac cacctgcgcg cgctttacgc 900
ccaataattc cggataacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960
gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtgccagctt attcaactag cacttgttct 1020
tccctaacaa cagagtttta cgacccgaaa gccttcatca ctcacgcggc gttgctccgt 1080
cagactttcg tccattgcgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt 1140
gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt tgccttggtg 1200
agccgttacc tcaccaacta gctaatgcga cgcgggtcca tccataagtg acagccgaag 1260
ccgcctttca atttcgaacc atgcggttca aaatgttatc cggtattagc cccggtttcc 1320
cggagttatc ccagtcttat gggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt ccgccgctaa 1380
cttcataaga gcaagctctt aatccattcg ctcgactgca tg 1422

Claims (10)

1.一种处理重金属污染土壤用微生物菌株，其特征在于：所述处理重金属污染土壤用微生物菌株为枯草芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC NO:M 2017831。
2.权利要求1所述处理重金属污染土壤用微生物菌株在重金属污染土壤处理或制备重金属污染土壤处理试剂中的应用。
3.一种重金属污染土壤处理试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，将权利要求1所述处理重金属污染土壤用微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液为重金属污染土壤处理试剂；或将权利要求1所述处理重金属污染土壤用微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液，将菌液真空冷冻干燥后制备重金属污染土壤处理试剂。
4.一种重金属污染土壤的处理方法，其特征在于：将权利要求1所述处理重金属污染土壤用微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理。
5.根据权利要求3或者4所述的方法，其特征在于：所述培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基或者牛肉膏蛋白胨液体培养基；所述重金属为铬。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：0.8~1.2%蛋白胨、0.4~0.6%牛肉浸膏、0.3~0.6%氯化钠、其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：0.8~1.2%蛋白胨、0.4~0.6%牛肉浸膏、0.3~0.6%氯化钠、2~3%琼脂、其余为去离子水。
7.权利要求1所述处理重金属污染土壤用微生物菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将未受Cd6+污染土壤与含有Cd6+的牛肉膏蛋白胨液体培养基混合，振荡培养获得土壤混合液；然后将土壤混合液离心，得到上清液；
（2）将步骤（1）得到的上清液梯度稀释后分别涂布于含有Cd6+的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在37℃培养2天，比较菌株的生长状况，从中筛选出目标微生物菌株。
8.根据权利要求7所述处理重金属污染土壤用微生物菌株的筛选方法，其特征在于：步骤（1）中，所述振荡培养的温度为28℃，速度为150rpm，时间为72小时，所述含有Cd6+的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，Cd6+的浓度为100mg/L；步骤（2）中，所述培养为倒置培养。
9.根据权利要求7所述处理重金属污染土壤用微生物菌株的筛选方法，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：0.8~1.2%蛋白胨、0.4~0.6%牛肉浸膏、0.3~0.6%氯化钠、其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：0.8~1.2%蛋白胨、0.4~0.6%牛肉浸膏、0.3~0.6%氯化钠、2~3%琼脂、其余为去离子水。
10.根据权利要求7所述处理重金属污染土壤用微生物菌株的筛选方法，其特征在于：步骤（2）中，将上清液分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后将不同浓度梯度的上清液分别涂布于含有100mg/L Cd6+的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在37℃培养2天；选取在稀释10-5倍数时易于菌株单独分离、在含有100 mg/L Cd6+的牛肉膏蛋白胨固体培养基上能正常生长的菌株划线分离，得到目标微生物菌株。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110004089A (zh) * 2019-04-15 2019-07-12 微生物肥料技术研究推广中心 微生物菌剂及其修复土壤的方法与应用
CN112474788A (zh) * 2020-10-21 2021-03-12 华南理工大学 一种异位纳米材料强化生物淋洗修复土壤的方法
CN113174357A (zh) * 2021-06-11 2021-07-27 南昌航空大学 一种微生物吸附剂及其制备方法和应用
CN114540223A (zh) * 2022-01-21 2022-05-27 山东德信生物科技有限公司 一株枯草芽孢杆菌及其在防治Cr(VI)诱导的机体损伤中的应用
CN115094005A (zh) * 2022-07-06 2022-09-23 四川大学 枯草芽孢杆菌、生物材料及在六价铬污染治理中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103153883A (zh) * 2011-05-04 2013-06-12 Rm泰科株式会社 利用微生物燃料电池去除重金属或回收贵金属的方法
CN106119170A (zh) * 2016-08-11 2016-11-16 中国烟草总公司广西壮族自治区公司 修复重金属污染土壤的微生物菌株及其筛选方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103153883A (zh) * 2011-05-04 2013-06-12 Rm泰科株式会社 利用微生物燃料电池去除重金属或回收贵金属的方法
CN106119170A (zh) * 2016-08-11 2016-11-16 中国烟草总公司广西壮族自治区公司 修复重金属污染土壤的微生物菌株及其筛选方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOHONG PAN等: "Investigation of Cr(VI) reduction and Cr(III) immobilization mechanism by planktonic", 《WATER RESEARCH》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110004089A (zh) * 2019-04-15 2019-07-12 微生物肥料技术研究推广中心 微生物菌剂及其修复土壤的方法与应用
CN112474788A (zh) * 2020-10-21 2021-03-12 华南理工大学 一种异位纳米材料强化生物淋洗修复土壤的方法
CN113174357A (zh) * 2021-06-11 2021-07-27 南昌航空大学 一种微生物吸附剂及其制备方法和应用
CN114540223A (zh) * 2022-01-21 2022-05-27 山东德信生物科技有限公司 一株枯草芽孢杆菌及其在防治Cr(VI)诱导的机体损伤中的应用
CN114540223B (zh) * 2022-01-21 2024-02-02 山东德信生物科技有限公司 一株枯草芽孢杆菌及其在防治Cr(VI)诱导的机体损伤中的应用
CN115094005A (zh) * 2022-07-06 2022-09-23 四川大学 枯草芽孢杆菌、生物材料及在六价铬污染治理中的应用

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