CN106520588B - 一株铜绿假单胞菌和其菌剂以及它们在钝化铅中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体公开了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及其应用，该铜绿假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.10844。还公开了一种含有该铜绿假单胞菌的菌剂和钝化铅的方法。本发明提供的铜绿假单胞菌在水体中对铅具有很强的钝化能力，能够在4‑5小时内完成对铅的钝化，对铅的最大去除率可高达97.33％；将该菌株接种于铅污染的土壤后，能够明显提高土壤的脱氢酶活性，同时能够有效地将铅从可变换态转变为稳定形态以达到钝化铅的效果。并且，采用本发明提供的铜绿假单胞菌对铅进行钝化，操作简便、周期较短且不会造成二次污染，具有较高的经济效益和社会效益。

Description

一株铜绿假单胞菌和其菌剂以及它们在钝化铅中的应用

技术领域

本发明涉及一株铜绿假单胞菌，具体地，涉及一株具有钝化铅功能的铜绿假单胞菌及其菌剂，以及它们在钝化铅中的应用。

背景技术

当前国内土壤的重金属污染十分严重，有16％的土壤在不同程度上受到重金属的毒害，每年损失的粮食有上千万吨，严重危害生产生活和人体健康。近几年，铅中毒事件频频发生，尤其是一系列儿童血铅超标事件引起了国内极大的关注和广泛的讨论。由于铅在环境中广泛存在，通过呼吸道和消化道进入人体后，会引起机体的神经系统、血液系统和消化系统的一系列异常，严重影响人体正常机能。儿童由于代谢和发育方面的特点，对铅毒性特别敏感，因此，铅中毒在儿童体内的表现更为突出。

目前重金属土壤的治理方法主要分为物理法、化学法和生物法。目前常用的物理修复法主要有气相抽提技术和热脱附技术；化学修复法主要有淋洗技术、固定/稳定化技术以及氧化-还原技术；生物修复方法主要有植物修复技术和微生物修复技术。物理和化学方法主要适用于工业污染地下水、污泥以及土壤的修复，它们往往存在工程量大、花费高和易产生二次污染的弊端。相比之下，生物修复方法更为环保，更适合农业种地的治理，但是植物修复方法往往周期较长，无法达到快速高效的治理目的。而微生物修复法是通过生物的代谢作用或其产生的酶降低重金属毒性。微生物修复方法因其具有经济友好、对环境扰动小的优势，在土壤和水体环境的修复中具有广阔前景，是一种事宜的重金属治理方法。所以筛选对重金属具有较强钝化能力的菌株对重金属的生物钝化至关重要。虽然目前已经报道了多种具有重金属钝化作用的菌株，但是真正具有较强重金属钝化能力并能够大规模直接用于重金属污染土壤生物修复的却不多，尤其是特别适用于铅钝化的菌株。

因此，急需开发一株能够高效钝化环境中的重金属，尤其是铅的微生物菌株。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有的修复重金属污染方法所具有的工程量大、易产生二次污染及修复周期长的缺陷，提供一株能够在简单操作的条件下，无污染的且具有较短修复周期的对重金属铅进行钝化的菌株及其应用。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，其中，所述铜绿假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.10844。

第二方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的铜绿假单胞菌的菌体。优选地，该菌剂含有上述铜绿假单胞菌的活菌体和/或死菌体。

第三方面，本发明提供了上述铜绿假单胞菌和/或上述菌剂在钝化铅中的应用。

第四方面，本发明提供了一种钝化铅的方法，该方法包括：将上述铜绿假单胞菌和/或上述菌剂与含有铅污染的环境接触，以对上述环境中的铅进行钝化，其中，所述含有铅污染的环境包括土壤或水体。

本发明提供的铜绿假单胞菌在水体中对铅具有很强的钝化能力，能够在4-5小时内完成对铅的钝化，对铅的最大去除率可高达97.33％；将该菌株接种于铅污染土壤后，能够明显提高土壤的脱氢酶活性，同时能够有效地将铅从可变换态转变为稳定形态以达到钝化铅的效果。并且，采用本发明提供的铜绿假单胞菌对重金属铅进行钝化，操作简便、周期较短且不会造成二次污染，具有较高的经济效益和社会效益。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明提供的菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，并于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.10844。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1表示的是本发明提供的铜绿假单胞菌及其菌剂与参比菌株及其菌剂对水体中铅的去除率(％)。

图2表示的是本发明提供的铜绿假单胞菌及其菌剂与参比菌株及其菌剂对土壤脱氢酶活性的影响。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

根据本发明，第一方面，本发明提供了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，其中，所述铜绿假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.10844。

本发明提供的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分离自安徽宣城土壤。在所述铜绿假单胞菌的分离过程中，可以采用本领域常规的用于新菌株分离的方法，例如可以为液相富集法或土壤环流法。

液相富集法具体可以包括：称取适量铅污染土壤样品加入到装有LB液体培养基的三角瓶中，加入适量玻璃珠。将三角瓶在28-30℃，160-170rpm下振荡；将土壤混合液转入离心管，取离心后的上清液作为铅钝化微生物的来源。将所述上清液接种到含有铅的LB液体培养基中，在28-30℃，160-170rpm下振荡培养。用无菌吸管吸取1-2mL，移入另一个富集培养三角瓶中。如此转移三次后，将上清液分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7或10^-8倍，吸取适量涂布于含有50、100、200或300mg/L铅(Pb²⁺)的LB固体培养基上进行平板划线，28-30℃培养3-4天后，分离单菌落。

土壤环流法具体可以包括：称取100g铅污染土壤与适量粒径约为3mm的砂粒混合均匀，置于环流装置的上层。下层装入LB培养基200mL作为环流液。启动空气压缩机，开始驯化过程，期间根据环流液的蒸发情况定期补加环流液。驯化结束后，将下层环流液分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7或10^-8倍，吸取适量涂布于含有50、100、200或300mg/L铅(Pb²⁺)的LB固体培养基上进行平板划线，28-30℃培养3-4天后，分离单菌落。

本发明从筛选出的菌株中选取一株对铅耐抗性最强的细菌进行了DNA提取与鉴定，鉴定结果显示，该菌株的16SRDNA序列SEQ ID No：1所示与铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)有100％的同源性，可以确定该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，并于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10844。

本发明提供的铜绿假单胞菌经过培养能够产生大量的铜绿假单胞菌的活菌体。本发明对培养方法没有特别的限制，只要通过该培养方法可以使所述铜绿假单胞菌大量增殖即可，例如可以按照10⁷CFU/mL的接种量将铜绿假单胞菌的活菌体接种于培养基中，并且在好氧条件下，在28-30℃的温度下培养10-12小时后，得到培养液。其中，所述培养基可以为本领域常规使用的培养基，例如可以为LB液体培养基(0.8-1重量％蛋白胨，0.5-0.8重量％酵母粉，1-1.5重量％氯化钠；pH为6.8-7.0；培养温度为28-30℃)或营养肉汤培养基(0.8-1重量％蛋白胨，0.3-0.5重量％牛肉膏，0.5-0.8重量％氯化钠；pH为7.2-7.6；培养温度为28-30℃)。优选为LB液体培养基。

本发明可以进一步分离上述培养液中的铜绿假单胞菌的菌体，对所述分离的方法没有特别的限制，只要能够从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为本领域的常规条件。

根据本发明，第二方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有本发明提供的铜绿假单胞菌的菌体。在该菌剂中，对所述铜绿假单胞菌的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择。优选情况下，在该菌剂中所述铜绿假单胞菌的菌体含量至少为1克/千克。

本发明对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分，例如所述菌剂可以为菌液或者冻干后的菌体。

根据本发明，所述菌剂含有所述铜绿假单胞菌的活菌体和/或死菌体。优选地，所述菌剂含有所述铜绿假单胞菌的活菌体或者活菌体和死菌体的混合菌体。当所述菌剂含有所述铜绿假单胞菌的活菌体和死菌体的混合菌体时，优选为活菌体的数量高于死菌体的数量。最优选为所述菌剂含有所述铜绿假单胞菌的活菌体。

另外，本发明的发明人发现，虽然本发明提供的铜绿假单胞菌是在高浓度Pb²⁺(100mg/L)条件下筛选得到的，但其对土壤中常规的重金属污染，例如铅、镉、砷、铜、汞和铬等均有一定的钝化作用。

基于以上发现根据本发明，第三方面，本发明提供了上述铜绿假单胞菌和/或上述菌剂在钝化铅中的应用。

在本发明中，术语“钝化”是指使重金属固定在污染土壤的表面，降低重金属的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复重金属污染的环境的目的。

根据本发明，第四方面，本发明提供了一种钝化铅的方法，该方法包括：将上述铜绿假单胞菌和/或上述菌剂与含有铅污染的环境接触，以对上述环境中的铅进行钝化，所述含有铅污染的环境包括土壤或水体。

本发明对加入至所述含有铅污染的环境中的铜绿假单胞菌或菌剂的形式并没有特别的限定，只要保证加入后所述铜绿假单胞菌能够在所述含有铅污染的环境中起作用并且可有效钝化铅即可，加入的所述铜绿假单胞菌的形式，例如可以为活菌体，也可以为死菌体，或者可以为菌液或菌体沉淀或菌落或干粉的形式。

本发明对加入的铜绿假单胞菌的量也没有特别的限制，这可以根据所述含有铅污染的环境中的铅的含量以及钝化难易程度来决定，例如，当所述环境中的铅含量较高或较难钝化时，可以提高所述铜绿假单胞菌或菌剂的加入量；当所述环境中的铅含量较低或较易钝化时，可以减少所述铜绿假单胞菌或菌剂的加入量。

在本发明中，当所述含有铅污染的环境为土壤时，为了进一步促进本发明提供的铜绿假单胞菌对铅的钝化效率，优选的，将土壤中的水含量控制在至少15重量％，更优选为18-30重量％。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中：

LB液体培养基：0.8-1重量％蛋白胨，0.5-0.8重量％酵母粉，1-1.5重量％氯化钠；pH为6.8-7.0；培养温度为28-30℃。

本发明提供的菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，并于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：1001

参比菌株为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，筛选自安徽宣城土壤。

制备例

按照10⁷CFU/mL的接种量将本发明提供的铜绿假单胞菌(菌株A)或者参比菌株嗜麦芽寡养单胞菌(菌株D)活菌体以1体积％接种于经121℃灭菌15min的LB液体培养基中，在160rpm，28-30℃条件下振荡培养10-12h。将得到的铜绿假单胞菌(菌株A)和参比菌株(菌株D)的菌液于4℃下保存备用。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的铜绿假单胞菌对水体中铅的钝化能力。

将按照上述制备例制备得到的菌株A的菌液以1-2体积％的接种量接种于LB液体培养基中，在160rpm，30℃条件下振荡培养10h，然后将铅加入到该菌液中，使其初始浓度为100mg/L。在150-170rpm，28-30℃条件下进行振荡吸附，每隔0.5h取样，测定样本中铅的浓度。

其中，铅含量的检测方法为：取适量的样本，于8000rpm离心10min，取上清，使用ICP-AES检测上清液中铅的含量，并计算铅的去除率。

铅的去除率(％)＝(铅的初始浓度-铅的残留浓度)/铅的初始浓度×100％

结果如图1所示。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的菌剂对水体中铅的钝化能力。

按照实施例1中的方法对水体中的铅进行钝化，不同的是，加入按照上述制备例制备得到的菌株A的冻干后的菌体。

结果如图1所示。

对比例1

本对比例用于说明参比菌株对水体中铅的钝化能力。

按照实施例1中的方法对水体中的铅进行钝化，不同的是，加入的菌液为按照制备例制备得到的菌株D的菌液。

结果如图1所示。

对比例2

本对比例用于说明参比菌剂对水体中铅的钝化能力。

按照实施例1中的方法对水体中的铅进行钝化，不同的是，加入按照上述制备例制备得到的菌株D的冻干后的菌体。

结果如图1所示。

对比例3

本对比例用于说明自然状态下水体中铅的钝化能力。

按照实施例1中的方法对水体中的铅进行钝化，不同的是，不加入任何菌株。

结果如图1所示。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的铜绿假单胞菌对铅污染土壤微生态的促进作用。

将按照上述制备例制备的菌株A的菌液100mL加入到含铅量为100mg/kg的铅污染土壤中，搅拌均匀，培养10d保证含水量为20-30％左右。10d后，将土壤在65℃下烘干，准确称取1g于15mL离心管中，向离心管中加入2mL 0.1mol/L葡萄糖溶液和2mL 0.5％的TTC溶液，混合均匀后于37℃，100rpm条件下避光培养16h。然后，加入1mL甲醛终止反应，再加入5mL丙酮，充分振荡，使附着在土壤颗粒上的产物TPF洗脱下来。最后静置3min，使用有机滤膜过滤上清液，使用紫外分光光度计在485nm波长下测量滤液的吸光度值，该值被用于脱氢酶活性的评价。

结果如图2所示。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的菌剂对铅污染土壤微生态的作用。

按照实施例3中的方法评价铅污染土壤的脱氢酶活性，不同的是，加入按照上述制备例制备得到的菌株A的冻干后的菌体。

结果如图2所示。

对比例4

本对比例用于说明参比菌株对铅污染土壤微生态的作用。

按照实施例3中的方法评价铅污染土壤的脱氢酶活性，不同的是，加入的菌液为按照制备例制备得到的菌株D的菌液。

结果如图2所示。

对比例5

本对比例用于说明参比菌剂对铅污染土壤微生态的作用。

按照实施例3中的方法评价铅污染土壤的脱氢酶活性，不同的是，加入按照上述制备例制备得到的菌株D的冻干后的菌体。

结果如图2所示。

对比例6

本对比例用于说明自然状态下铅污染土壤的微生态情况。

按照实施例3中的方法评价铅污染土壤的脱氢酶活性，不同的是，不加入任何菌株。

结果如图2所示。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的铜绿假单胞菌对铅污染土壤中铅形态的作用。

将按照上述制备例制备的菌株A的菌液100mL加入到含铅量为100mg/kg的铅污染土壤中，搅拌均匀，培养10d，保证含水量为20-30％左右。10d后，将土壤在65℃下烘干，准确称取1g，用BCR连续提取法，提取土壤中各种形态的铅。步骤如下：

(1)可交换态：准确称取通过100目筛的风干土壤样品1g，加40mL 0.1mol/L的HAc，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后5000rpm下离心15min。取上清液，用ICP-AES测定Pb²⁺含量。

(2)可还原态：加入无菌水清洗步骤(1)中的洗残余物，振荡30min，离心，弃去清洗液。向残渣中加入40mL 0.5mol/L的盐酸羟胺，放在恒温振荡器中24℃下连续振荡16h，然后5000rpm下离心15min。其余同步骤(1)。

(3)可氧化态：向步骤(2)的残渣中加入10mL H₂O₂，搅拌均匀，室温下静置1h左右后用水浴加热保持80℃1h左右，再加入10mL H₂O₂，在恒温水浴箱中加热保持80℃1h左右。冷却后，加入50mL 1mol/L的NH₄Ac，放在恒温振动器中24℃下连续震荡16h，然后5000rpm下离心15min。其余同步骤(1)。

(4)残渣态：向步骤(3)的残渣中加入10mL HNO₃，使酸和样品充分混合均匀。进行微波消解。10d后使用ICP-AES检测土壤中铅各形态的含量。

结果如表1所示。

实施例6

本实施例用于说明本发明提供的菌剂对铅污染土壤中铅形态的作用。

按照实施例5中的方法评价铅污染土壤中铅的形态，不同的是，加入按照上述制备例制备得到的菌株A的冻干后的菌体。

结果如表1所示。

对比例7

本对比例用于说明参比菌株对铅污染土壤中铅形态的作用。

按照实施例5中的方法评价铅污染土壤中铅的形态，不同的是，加入的菌液为按照制备例制备得到的菌株D的菌液。

结果如表1所示。

对比例8

本对比例用于说明参比菌剂对铅污染土壤中铅形态的作用。

按照实施例5中的方法评价铅污染土壤中铅的形态，不同的是，加入按照上述制备例制备得到的菌株D的冻干后的菌体。

结果如表1所示。

对比例9

本对比例用于说明自然状态下铅污染土壤中铅的形态。

按照实施例5中的方法评价铅污染土壤中铅的形态，不同的是，不加入任何菌株。

结果如表1所示。

表1

由图1可以看出，本发明提供的铜绿假单胞菌或者含有该菌株的菌剂在水体中对铅具有很强的钝化能力，能够在4-5h内完成对铅的钝化，对铅的最大去除率高达97.33％，该作用优于参比菌株或菌剂。

由图2可以看出，将本发明提供的铜绿假单胞菌或者含有该菌株的菌剂接入铅污染土壤后，能够明显提高铅污染土壤的脱氢酶活性，改善铅污染土壤的微生态，该作用优于参比菌株或菌剂。

由表1可以看出，本发明提供的铜绿假单胞菌或者含有该菌株的菌剂对土壤中的铅具有良好的钝化作用，具体表现为其能够有效地将可交换态的铅转化成为更稳定的可还原态、可氧化态和残渣态。

上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (5)

1.一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其特征在于，所述铜绿假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.10844。

2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的铜绿假单胞菌的活菌体。

3.权利要求1所述的铜绿假单胞菌和/或权利要求2所述的菌剂在钝化铅中的应用。

4.一种钝化铅的方法，该方法包括：将权利要求1所述的铜绿假单胞菌和/或权利要求2所述的菌剂与含有铅污染的环境接触，以对含有铅污染的环境中的铅进行钝化。

5.根据权利要求4中所述的方法，其中，所述含有铅污染的环境包括土壤或水体。