CN108130294A - 一种用于重金属污染原位修复微生物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于重金属环境治理领域，公开了一种用于重金属污染原位修复微生物及应用，所述的微生物为拉乌尔菌X13，保藏编号为：CCTCC NO：M2016662。该菌株对多种重金属离子具有高耐受性和广泛的抗生素抗性；具有合成吲哚乙酸的能力；具有溶无机磷的作用；同时在添加半胱氨酸情况下可以高效的去除液体中的镉离子。此外，本发明所公开的拉乌尔菌X13能够在液体环境中有效吸附固定重金属，在土壤环境中高效阻止重金属进入植物的体内，并促进土壤中的水溶态镉离子向无机结合态镉离子转化，实现土壤中重金属的钝化，同时可以明显促进植株增产，适用于面源污染土壤的原位修复。

Description

一种用于重金属污染原位修复微生物及应用

技术领域

本发明属于环境治理领域。具体公开了一种用于重金属污染原位修复微生物及应用，所述的微生物一种对重金属镉、铜、锌具有高耐受性和高吸附能力。

背景技术

重金属广泛地分布于大气圈、生物圈、岩石圈和水圈中，在自然情况下，其浓度一般不会达到危害环境和人类的程度。但是，由于人类的活动，环境中重金属含量明显增加，如重金属矿山的开采、金属冶炼、电镀、印染、农药等导致重金属污染。根据2014年环境保护部和国土资源部公布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，全国土壤环境状况总体不容乐观，部分地区土壤污染较重，耕地土壤点位超标率为19.4％，主要污染物为镉、镍、铜、砷、汞、铅、滴滴涕和多环芳烃，其中镉污染是最为严重的无机物污染，占比达到7％。此外，一系列的重金属污染事件频发，例如2006年湖南株洲工厂排放含Cd废水事件，2012广西Cd污染等突发性污染事件等，重金属的污染问题已成为目前最主要的环境问题之一。

目前关于重金属污染的治理主要有物理化学修复法和生物修复法。物理化学修复法主要有离子交换，吸附，化学沉淀，氧化，还原，和反渗透的几种方法，但存在着投资大、能耗高、操作困难、易产生二次污染等。近年来，生物修复由于其生态，环保，成为土壤重金属污染修复的研究热点。生物修复与物理化学修复相比，具有成本低、操作简单、不易形成二次污染。细菌作为自然界微生物中一个庞大的群体，是土壤中最活跃的组份，具有比表面积大、繁殖快、携带电荷等特点。受重金属污染的土壤中，常常会因为重金属的筛选压力而富集大量的对重金属有耐受性的细菌菌株，它们可以通过不同的作用方式来影响土壤中重金属的形态。因此利用细菌菌株作为生物修复剂对重金属污染土壤进行修复意义重大。

土壤环境中，镉以多种形态存在。依据Sposito连续提取法(1982)，土壤中的镉的形态可分为水溶/交换态、有机结合态、无机结合态和残渣态。利用重金属抗性细菌菌株对重金属污染土壤进行原位修复，主要是依赖于细菌菌株对重金属的解毒机制如生物吸附、生物沉淀、生物转化等，使环境中的重金属向低毒性状态转化，降低其对生态系统的毒害作用。

因而本发明利用微生物在受到自然环境重金属胁迫而产生耐性这个特点，对抗多种重金属镉、铜、锌微生物进行筛选，获得并提供了可用于生物治理重金属污染的高效耐受菌株。同时，本发明将该菌株用于重金属镉污染土壤中，发现该菌株具有良好的重金属镉污染环境的修复能力和运用潜力。本发明旨在为微生物修复重金属污染提供对多种重金属具有相对高吸附能力且性能稳定的抗性菌株。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种用于重金属污染原位修复微生物，所述的微生物为拉乌尔菌，该菌株已于2016年11月21日送往中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M2016662，分类命名：拉乌尔菌(Raoultellasp.)X13，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了拉乌尔菌的应用，本发明提供的菌株具有多种重金属抗性和广泛的抗生素耐受性，该菌株在实验室条件下在高浓度镉离子存在条件下显著的生长，对镉、铜和锌都有一定的吸附能力，其中镉吸附能力最强，同时发现添加一定量的半胱氨酸可以极其显著去除镉离子，并在模拟土壤修复实验中能够显著地降低土壤中生物毒性镉的含量。实验结果显示本发明所提供的拉乌尔菌在重金属污染的土壤的原位修复领域具有重要的运用前景。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种用于重金属污染原位修复微生物，为申请人自大冶矿区重金属污染的土壤中分离得到，，所述的微生物为拉乌尔菌，该菌株已于2016年11月21日送往中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M2016662，分类命名：拉乌尔菌(Raoultellasp.)X13，地址：中国武汉武汉大学。

拉乌尔菌X13菌株在LB固体平板上28℃培养48h后，菌落呈为乳白色，边缘整齐，湿润，粘稠，不易挑起，革兰氏阴性，球形，不产芽胞，可运动，过氧化氢酶和氧化酶呈阳性，产吲哚乙酸和硫化氢。在LB液体培养中，在不同酸碱(pH5-9)条件下可以正常生长，不同盐浓度(1％-8％NaCl)下正常生长。

拉乌尔菌X13的应用，包括利用该菌株制备重金属污染原位修复制剂或重金属离子吸附剂，或是利用该菌株制备植物生长促进剂；或是利用该菌株制备吲哚乙酸合成促进剂；或是利用该菌株制备无机磷溶解剂中的应用。

以上所述的应用中，优选的，当拉乌尔菌X13作为重金属污染原位修复制剂或重金属离子吸附剂时，所述的重金属优选镉离子，铜离子或锌离子。

以上所述的应用中，优选的，当拉乌尔菌X13作为重金属污染原位修复制剂或重金属离子吸附剂时，是将乌尔菌X13与半胱氨酸联合使用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

在拉乌尔菌X13菌剂的在含镉、铜和锌离子的各自液体环境条件下，对镉、铜和锌离子都有一定的吸附能力，其中镉吸附能力最强；此外，接种到含半胱氨酸的M9培养基中，可以极其显著去除镉离子，实验结果表明在含半胱氨酸4mmol/L，镉浓度为1mmol/L条件下对镉去除效果高达100％，镉浓度为2mmol/L条件下对镉去除效果高达90％以上；在土壤环境下接种10⁸cfu/Kg镉污染土壤能够高效降低植物对土壤镉离子的摄入量，同时有效促进土壤中的水溶态镉离子向无机结合态镉离子转化，实现土壤中重金属的钝化。本发明所提供的拉乌尔菌X13菌株对环境中的重金属具有较高的固定能力，能降低其生物毒害性，适用于水环境以及面源污染土壤的原位修复。

附图说明

图1为拉乌尔菌(Raoultellasp.)X13菌株的菌落形态和细胞形态示意图。

图2为拉乌尔菌(Raoultellasp.)X13菌株在不同初始镉离子浓度条件下的生长趋势示意图。

图3为拉乌尔菌(Raoultellasp.)X13菌株溶无机磷和pH的动态变化示意图。

图4为拉乌尔菌(Raoultellasp.)X13在添加半胱氨酸情况下对镉的去除能力示意图。

图5为拉乌尔菌(Raoultellasp.)X13菌株合成IAA和生长曲线的动态变化。

图6为不同镉污染水平土壤中施加X13菌株对小白菜产量的影响示意图。

图7为不同镉污染水平土壤中施加X13菌株对小白菜吸收的总镉量的影响示意图。

图8为不同镉污染土壤中施加X13菌株对土壤中镉形态分布的影响示意图。

具体实施方案

以下结合实施例对本发明进行详细地说明。应该说明的是，本发明的实施例仅限于对于本发明进行说明，而没有限制作用。本发明中所涉及的其它各种操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。

实施例1：拉乌尔菌X13的分离和鉴定

采用来自湖北大冶矿区重金属污染的土壤为筛选土壤，具体筛选方案如下：

(1)抗多种重金属X13筛选和分离

A、称取10g镉污染土壤于90mL无菌生理盐水的三角瓶中，在28℃恒温摇床上振荡摇匀，静置后，取上清液进行培养；

B、将上清液转至无菌的含含Cd²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺各30mg/L的LB中，置于28℃恒温摇床中培养10天左右，再10％接种量接种到含有含Cd²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺各50mg/L的LB培养基中再在28℃恒温摇床中培养10天左右，然后相同方法转接到含有含Cd²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺各100mg/L的LB培养基中培养10天左右。然后取0.2ml培养物，涂布到含有含Cd²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺各50mg/L的的Cd²⁺的LB固体平板中，置于28℃恒温培养箱中培养至单菌落长出；挑取单菌落到含有含Cd²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺各50mg/L的Cd²⁺LB液体培养基中，然后置于28℃恒温摇床中震荡培养；

C、将平板上生长的微生物进行多次划线分离纯化，然后重新涂布到上述含Cd²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺各50mg/L的LB平板上；

D、经分离筛选后，保存对多种重金属(Cd²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺)具有稳定抗性能力的菌株，在LB平板上进行保存，获得本发明菌株，进一步对菌株鉴定保存备用。

(2)抗多种重金属X13的基本特性

圆球状细菌，需氧，生长较迅速，在LB固体培养基上孵育48小时后，菌落形态为乳白色，不透明，表面湿润，中心凸起，边缘圆整，革兰氏阴性菌，不产芽胞。其菌株的菌落形态及革兰氏染色照片见图1。

(3)分子生物学鉴定：

发明人对菌株抽提DNA，用做PCR模板，以27F-1492R引物进行PCR扩增上述分离菌株的16S rDNA序列以用于菌株的分子鉴定。同时结合系统进化树和菌株形态学观察确认该菌为拉乌尔菌属(Raoultellasp.)。该菌株已于2016年11月21日送往中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M2016662，分类命名：拉乌尔菌(Raoultellasp.)X13，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

拉乌尔菌X13的生长状况

拉乌尔菌X13不同镉离子(Cd²⁺)胁迫条件下拉乌尔菌X13的生长状况。

将X13菌株接种到新鲜的LB培养基中活化过夜，然后以1％(v/v)的接种量接种到新鲜的LB培养基中，28℃恒温摇床中培养至OD600＝0.5；然后以1％(v/v)的接种量分别接种到含有不同浓度Cd²⁺离子的LB培养基中(具体的浓度梯度如图2所示)，然后放入28℃恒温箱培养3天。期间在不同的时间取2ml培养物，测定其OD₆₀₀值。每个处理设置三个平行处理。

如图2所示，不含镉条件下，培养16h后OD600值达到最大为4.3，说明X13具有极强的增值能力。同时与培养基中不含有Cd²⁺(0mmol/L)相比，随着Cd²⁺对浓度增加，X13菌株的生长逐渐受到抑制。当Cd²⁺为1mmol/L时，Cd²⁺对于菌株X13的生长有明显的抑制效应；随着Cd²⁺浓度继续增加，菌株的生长受到更加强烈的抑制。但是，即便Cd²⁺浓度增加到4mmol/L时，菌株仍然能够达到较高生长量(72小时时，OD₆₀₀约为1.0)，这说明X13菌株对镉离子具有极强的耐受性。

实施例3：

拉乌尔菌X13的环境适应特征

拉乌尔菌X13对多种重金属的耐受性及抗生素耐受能力测试

将X13菌株接种到新鲜的LB培养基中活化过夜，然后以1％(v/v)的接种量接种到新鲜的LB培养基中，28℃恒温摇床中培养至OD₆₀₀＝0.5；然后以1％(v/v)的接种量分别接种到含有不同重金属离子浓度的LB培养基中，然后放入28℃恒温箱培养4天后，穿刺接种LB固体平板。若此时固体培养条件下，无菌落形成，则可断定该浓度为最小抑菌浓度(CLSI,2006)。

重金属最小抑菌浓度(MIC)梯度的设置如下：

Cd(NO₃)₂为0，0.25，0.5，1，2，4，6，8，10，12mmol/L；

MnCl₂为0，1，2，4，6，8，10，12，14，16，18mmol/L；

Pb(NO₃)₂为0，1，2，4，8，12mmol/L；

K₂CrO₄为0，0.125，0.25，0.5，1，2mmol/L；

CuSO₄为0，0.25，0.5，1，2，4，6，8，10，12mmol/L；

Zn(NO₃)₂为0，1，2，4，6，8，10，12，14，16，18mmol/L；

CoCl₂为0，1，2，4，6，8，10，12mmol/L(Martin et al.2004)。

抗生素抗性测定与重金属最小抑菌浓度的测定方法一致，抗生素浓度分别为：Ampicillin(100mg/L)，Chloromycetin(50mg/L)，Kanamycin(50mg/L)，Spectinomycin(50mg/L)，Gentamicin(20mg/L)，Neomycin(200mg/L)，Streptomycin(5mg/L)。

测试结果如表1和表2所示：X13菌株在LB培养基中能够耐受14mmol/LMnCl₂；12mmol/L Zn(NO₃)₂；6mmol/L CoCl₂；6mmol/L CuSO₄；8mmol/L Cd(NO₃)₂；6mmol/LPb(NO₃)₂及1mmol/L K₂CrO₄。这说明该菌株对对Cd²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺和Cu²⁺具有较高的耐受性，具备用于重金属污染环境原位修复的潜力。

同时，X13菌株能够在含有Ampicillin(100mg/Kg)；Spectinomycin(50mg/Kg)；Kanamycin(50mg/Kg)；Gentamicin(20mg/Kg)；；Streptomycin(5mg/Kg)的LB培养基中获得良好的生长。表明X13菌株具有广泛的抗生素抗性。因此，申请人所提供的H368菌株具有多种重金属抗性和广泛的抗生素抗性，能够有效用于重金属-抗生素复合污染环境下的重金属原位修复。

表1Raoultellasp.X13对不同重金属离子的耐受性

表2Raoultellasp.X13对常用抗生素的抗性

注：“+”表示菌株能够耐受该抗生素，“-”表示菌株不能够耐受该抗生素。

实施例4：

Raoultellasp.X13对镉，铜，锌离子的吸附能力

进一步，申请人测试拉乌尔菌X13对镉，铜，锌的吸附能力。

按照实施2的方法活化X13菌株，然后以1％(v/v)接种比例接种到含有不同重金属离子浓度的LB培养基中，28℃，180rpm摇床中培养。60小时后，收集菌体(8000rpm 10mim)，去离子水重悬清洗三次，加入适当去离子水，作为活菌菌剂。加入适当去离子水在115℃灭菌20min，作为死菌剂(镜检结果，细胞未破裂)，最后分别对活/死菌剂定量，获得每毫升的菌体千重。

测定对镉，铜，锌的吸附能力方法如下：三角锥形瓶20ml体系中菌剂浓度1.0mg/L，初始Cd²⁺离子浓度1.0mM，pH为7，180rpm摇床振荡60小时，取样离心(8000rpm，8mim)，0.22um过滤后的溶液中Cd2+通过AAS测定，空白设置不加Cd²⁺，其他操作如上所述。每个处理设置三个平行处理。对于Cu²⁺，Zn²⁺吸附能力测定操作如上，初始浓度分别为1mM和2mM。结果如下：

实施例5：拉乌尔菌X13对重金属镉污染的土壤的原位修复

为了进一步检验拉乌尔菌X13在土壤条件下对重金属镉的去除能力，以及对植物生长的影响，申请人在室外大棚环境下测试了X13菌株对重金属镉污染土壤的原位修复能力。

模拟修复试验在室外大棚进行，采用大花盆作为容器。实验设置6个处理组，每个处理4个重复，每盆2.0kg风干土壤，实验具体设置如表3所示。

土壤中Cd²⁺的添加浓度为：0，0.5，1.5mg/Kg，分别标记为Cd0，Cd0.5，Cd1.5；加入适量的蒸馏水保持土壤含水量20％，放置1天，使加入的镉离子在土样中充分平衡；然后向不同镉处理的土壤中接入拉乌尔菌X13菌株，接种量为0和10⁸CFU/g风干土，分别用“N”和“A”表示不接种和接种微生物的处理。在不接种的土壤中加入等量去离子水以确保土壤含水量一致。每盆土壤种植3株小白菜，种植期为40天；整个种植期定期定量添加蒸馏水，以维持土壤湿润。

模拟修复结束后，分别获取花盆内小白菜全部地上部分和土壤中的根系，称量鲜重后，烘干，然后送分析测试中心进行镉离子浓度分析。

同时，将取花盆土壤风干，磨碎混匀，过2mm筛子，用于土壤中镉形态分析(结果如表3，图8)。

结果表明(图6和图7)，随土壤Cd污染水平增加，小白菜产量明显下降。在相同Cd污染水平时施加菌剂X13有明显增产效果。对于鲜重，相对于Cd0分别减产15.13％(Cd0.5)和24.5％(Cd1.5)，相同Cd污染水平施加菌剂X13分别增产20.96％(Cd0)，14.36％(Cd0.5)和19.38％(Cd01.5)。对于干重，相对于Cd0分别减产4.51％(Cd0.5)和8.32％(Cd1.5)，相同Cd污染水平施加菌剂X13分别增产5.93％(Cd0)，3.29％(Cd0.5)和3.87％(Cd01.5)。土壤中镉形态分析发现，施加菌剂后，土壤中各形态Cd的含量发生变化，其中水溶/交换态Cd明显下降，无机结合态和残渣态的Cd明显增加。说明菌剂X13处理后土壤中毒害的水溶/交换态Cd向无毒无机结合态转化。以上结果证明拉乌尔菌X13在土壤环境促进土壤中的水溶态镉离子向无机结合态镉离子转化，实现土壤中重金属镉的钝化，同时可以明显促进植株增产。

表3：施加拉乌尔菌X13对于土壤中Cd形态分布的影响

实施例6：

拉乌尔菌X13合成H₂S和CdS的能力

为了进一步测定拉乌尔菌X13产硫化氢及在镉离子存在情况下可以形成硫化镉，申请人测定了X13产硫化氢和硫化镉能力。

按照实施例2的方法活化X13菌株，然后以1％(v/v)接种比例接种到含有半胱氨酸的牛肉膏蛋白的培养基中，将灭菌醋酸铅纸条悬挂在试管上方，注意纸条底部不要接触到培养基，28℃，180rpm摇床中培养3d，发现纸条变黑，说明产硫化氢。

按照实施例2的方法活化X13菌株，12h后收集菌体(8000rpm 10mim)，无菌去离子水清洗三遍，加入适当的灭菌去离子水重悬，测定OD600，作为接种液。按照接种后培养液OD600值为0.5接种，不同处理按下表操作，28℃，180rpm摇床中培养6h，发现处理4试管有黄色沉淀，其他处理没有黄色沉淀，说明只有拉乌尔菌X13在存在半胱氨酸和镉离子同时存在情况下可以形成硫化镉。

实施例7：

拉乌尔菌X13溶无机磷的能力测定

为了进一步测定拉乌尔菌X13具有溶无机磷的能力，申请人测定了X13在磷酸三钙作为唯一磷源液体培养基中磷含量。

按照实施2的方法制备接种液，按照接种后培养液OD600值为0.1接种到无机磷培养基中，28℃，180rpm摇床中培养，每过12h(最初12小时每过6小时取样)取样，离心(8000rpm，8mim)，0.22μm过滤后钼酸铵分光光度法测定溶液中总磷含量。空白设置不接种X13，其他操作如上所述。每个处理设置三个平行处理。结果表明X13具有溶无机磷能力，溶磷能力最高可达16mg/L(图3)。

实施例8：

拉乌尔菌X13在添加半胱氨酸情况下对镉的去除能力测定

为了进一步测定拉乌尔菌X13在添加半胱氨酸情况下对镉的去除能力

按照实施5的方法制备接种液，按照接种后培养液OD600值为0.5接种到不同半胱氨酸的浓度的含1mM镉离子的M9培养基中，28℃，180rpm摇床中培养12h，取样离心(8000rpm，8mim)，0.22μm过滤后的溶液中Cd²⁺通过AAS测定，空白设置不接种X13，其他操作如上所述。每个处理设置三个平行处理。结果如图4所示，结果表明菌株X13在不同半胱氨酸(0.25mM-4mM)条件下对初始镉含量为1mM的去除效率达84.7％-99.5％，说明菌株X13在添加半胱氨酸可以高效去除镉。

实施例9：

拉乌尔菌X13合成促进植物生长的吲哚乙酸(IAA)的测定

为了测定拉乌尔菌X13可以合成促进植物生长的吲哚乙酸(IAA)

按照实施2的方法制备接种液，然后以1％(v/v)的接种量接种到LB中，在黑暗中，28℃，180rpm下培养。在不同时间点取样1.5mL细胞悬浮液转移到2ml管中并以8,000rpm离心10分钟，然后，将1mL上清液与1mL Salkowski试剂(37.50ml HClO₄，1.88mL 0.5M FeCl₃·6H ₂O和60.62mL去离子水)混合。在混合物在黑暗中放置30分钟后，测定530nm处的吸光度。终浓度由校正曲线计算。未接种的LB培养基为对照，所有实验一式三份进行。结果如图5所示，结果表明菌株X13可以合成促进植物生长的吲哚乙酸(IAA)，IAA合成和X13生长曲线成正相关，IAA合成浓度在稳定期达到平稳，约为6.5mg/L。

Claims (9)

1.一种分离的拉乌尔菌，所述的拉乌尔菌为拉乌尔菌（Raoultellasp.）X13，保藏编号为：CCTCC NO：M2016662。

2.权利要求1所述的拉乌尔菌在制备重金属污染原位修复制剂中的应用。

3.权利要求1所述的拉乌尔菌在制备重金属离子吸附剂中的应用。

4.权利要求1所述的拉乌尔菌在制备植物生长促进剂中的应用。

5.权利要求1所述的拉乌尔菌在制备吲哚乙酸合成促进剂中的应用。

6.权利要求1所述的拉乌尔菌在制备无机磷溶解剂中的应用。

7.根据权利要求2或3所述的应用，所述的重金属包括镉离子，铜离子或锌离子。

8.一种重金属污染原位修复制剂，包括乌尔菌X13和半胱氨酸。

9.权利要求8所述的制剂在制备重金属污染原位修复制剂中的应用。