CN117551557A - 一株耐低温多功能菌及其在土壤和水体污染修复中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体的说是涉及一株耐低温多功能菌及其在土壤和水体污染修复中的应用。耐低温多功能菌为篮状菌属的菌株TLT1，于2023年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：GCMCC No:40754。本发明菌剂可应用于稳定土壤环境中的锌，有助于丰富稳定重金属且兼具降解喹诺酮类抗生素降解菌的菌种数据库。本发明将纯化的菌株制成菌悬液，能够在低温环境下有效地稳定水体和土壤等不同环境介质中锌，兼具降解水体和土壤等不同环境介质中恩诺沙星。该方法相较于化学氧化等方法效率更高、价格低廉、且无二次污染，为锌‑恩诺沙星复合污染土壤和水体修复提供有效的生物‑非生物联合修复技术。
Description
技术领域
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体的说是涉及一株耐低温多功能菌(同时吸附重金属并降解抗生素)及其在土壤和水体污染修复中的应用。
背景技术
作为畜禽养殖大国，中国畜禽储量大，其产生的畜禽粪便逐渐积累。其中，北方地区冬季寒冷，畜禽粪便无法及时处理处置，粪便中残留的过量重金属和抗生素在土壤中不断积累，气温回暖后，土壤中的重金属和抗生素会通过雨水淋溶等方式进入深层土壤和地下水中。一旦将污染的水体和畜禽粪便施用于农田土壤上，易被农作物吸收，通过食物链传递，不仅可能破坏微生物群落结构，还会通过抑制蛋白质、细胞壁、叶酸的合成、影响DNA复制和转录等方式对人类健康造成威胁。目前，兽用重金属和抗生素主要以锌、恩诺沙星等为主。养猪场锌的使用剂量可高达2000mg/kg，恩诺沙星超过2.4mg/kg，亟需可同时实现土壤和水体中锌的稳定和恩诺沙星降解的材料。
现阶段重金属稳定化技术主要通过物理吸附和化学吸附为主；在场地应用方面主要通过土壤深耕、客土等方法；抗生素污染土壤修复方法主要通过植物修复、微生物修复、光电催化等方法。然而，客土、光电催化等方法专一性较强、成本高，植物修复等方法速度慢。因此，生物降解方法逐渐受到关注。微生物修复技术不仅效率高，成本低，还不会产生二次污染，对土壤为环境扰动小，是对含有重金属和抗生素复合污染场地水体和土壤修复的良好手段。由于微生物对温度十分敏感，专一性较强，一般仅能对单一的重金属或某一抗生素具有处理能力。因此，在不同温度均可发挥重金属稳定和抗生素降解的微生物将对北方地区土壤土壤和水体修复发挥重要作用。本发明提供了一株耐低温微生物，可在不同温度同时满足锌的稳定和恩诺沙星的去除，实现了该菌株的高效利用。
发明内容
为克服现有技术不足，本发明的首要目的在于提出一种耐低温多功能菌。
本发明的又一目的在于提供所述菌株在土壤修复中的应用。
本发明的又一目的在于提供所述菌株在水体修复中的应用。
为实现上述目的，通过下述技术方案实现的：
一种兼具喹诺酮类抗生素降解能力和重金属稳定化的耐低温菌株，菌剂含经驯化的篮状菌属的菌株TLT1；所述菌株为篮状属TLT1，于2023年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：GCMCC No:40754。
一种所述菌株的应用，所述菌株在土壤污染修复中的应用。
一种所述菌株的应用，所述菌株在水体污染修复中的应用。
所述菌株在同时稳定重金属和降解污染土壤中抗生素中的应用。
所述重金属为锌，所述抗生素为或恩诺沙星。
所述菌剂含有该菌株的培养液、培养液浓缩物或培养菌悬液。
所述篮状菌属TLT1的驯化为在含有锌离子和恩诺沙星的溶液中进行梯度驯化，最终获得可以耐受锌离子和可降解恩诺沙星的TLT1菌株。
所述菌剂培养液为将所述篮状菌属的菌株TLT1置于PDA液体培养基中培养至对数生长期，即获得培养液；培养液离心收集沉淀，收集沉淀干质量达4～6g/L。
一种所述菌剂的使用方法，将所述菌剂施加至待处理污染土壤中，菌剂的干物质达4g/L时，按3～5wt％的接种量施加入待处理污染土壤中。与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明从含有重金属和抗生素污染的原位畜禽养殖土壤中筛选分离得到一株具有重金属耐性及恩诺沙星抗生素降解活性的菌株，该菌经分子鉴定为篮状菌属的TLT1菌。该菌具有降解恩诺沙星的功能，有利于丰富喹诺酮类抗生素降解菌的菌种资源库，恩诺沙星类抗生素污染的治理提供有效的生物降解方法。同时，该菌株可吸附高浓度锌离子，有利于丰富锌重金属稳定化的菌种资源库，为锌重金属污染土壤修复提供有效处理方法。该菌株的适应能力强，耐低温，安全有效、环保无害，可以实现在微生物适应的低温环境对恩诺沙星进行降解以及锌的稳定。
附图说明
图1为本发明实施例提供的TLT1菌株降解水体中恩诺沙星的LC-MS定量检测结果图。
图2为本发明实施例提供的3％接种量获得TLT1菌株在低温环境下(10℃)稳定土壤中锌及去除恩诺沙星结果图。
图3为本发明实施例提供的3％接种量获得TLT1菌株在常温环境下(20℃)稳定土壤中锌及去除恩诺沙星结果图。
图4为本发明实施例提供的3％接种量获得TLT1菌株在常温环境下(30℃)稳定土壤中锌及去除恩诺沙星结果图。
图5为本发明实施例提供的5％接种量获得TLT1菌株在低温环境下(10℃)稳定水体中锌及去除恩诺沙星结果图。
图6为本发明实施例提供的5％接种量获得TLT1菌株在常温环境下(20℃)稳定水体中锌及去除恩诺沙星结果图。
图7为本发明实施例5％接种量获得TLT1菌株在常温环境下(20℃)稳定土壤中锌及去除恩诺沙星结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明菌剂含经驯化获得单一菌株篮状菌TLT1，于2023年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为GCMCCNo：40754。所述篮状菌属的菌株TLT1的驯化为在含有锌离子和恩诺沙星的溶液中进行梯度驯化，最终获得可以耐受锌离子的TLT1稳定化菌株。本发明菌剂可稳定土壤环境中的锌，有助于丰富稳定重金属且兼具降解喹诺酮类抗生素降解菌的菌种数据库。本发明将纯化的菌株制成菌悬液，能够在低温环境下有效地稳定水体和土壤等不同环境介质中锌，兼具降解水体和土壤等不同环境介质中恩诺沙星。该方法相较于化学氧化等方法效率更高、价格低廉、且无二次污染，为锌-恩诺沙星复合污染土壤和水体修复提供有效的生物-非生物联合修复技术。
实施例1菌株的分离和鉴定：
本发明中篮状菌TLT1菌种由含有重金属-抗生素污染的畜禽养殖场地土壤中筛选、驯化得到，具体步骤如下：
A、用恩诺沙星和锌筛选畜禽养殖污染土壤中的耐抗生素菌种：
驯化过程为：采集被畜禽养殖场产生的动物粪便堆放的污染土壤样品，在了解土壤样品中的初始恩诺沙星浓度后，将样品在将其加入至含有恩诺沙星的无机盐培养基中进行梯度驯化，培养基中恩诺沙星的浓度逐步升高，依次浓度分别为50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1mg/L、2mg/L)；同时，无机盐培养液中锌的浓度控制为20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L，样品在每个浓度下在10℃、150r/min于摇床中避光培养7d，定期观察培养基中菌液状态，培养基中液体由透明变浑浊，且OD600高于1，则说明可耐受2mg/L恩诺沙星和300mg/L锌的微生物已经正常被活化，在此条件下可进行进一步的富集。此时恩诺沙星和锌的浓度已达到土壤/水体的污染浓度。
选择在上述梯度驯化恩诺沙星的浓度为2mg/L、锌浓度为300mg/L下筛得的耐受恩诺沙星和锌的混合菌转接到含有2mg/L恩诺沙星的固体无机盐培养基上，10℃避光培养，共转接6次；以使恩诺沙星降解菌占据生长优势。
将上述获得混合菌接种到含有2mg/L恩诺沙星的无机盐培养基中，10℃，150r/min避光培养，于0天和3天取样过0.22μm滤膜后上LC-MS测定其降解效果；经降解实验可知，3天后恩诺沙星的去除效率可达54.89％，锌的稳定化达76.2％。将所得混合菌接种至含有2mg/L的液体无机盐培养基中，培养至干物质量为4g/L，经无菌生理盐水重悬，最终获得耐受且可降解恩诺沙星的混合微生物菌悬液。
B、将上述驯化后获得混合微生物菌悬液用接种环分别接种于固体LB培养基、固体无机盐培养基以及固体马铃薯培养基上进行划线培养；上述三种培养基在使用时均保证含有2mg/L的恩诺沙星和300mg/L锌；在不同培养基下于10℃、避光培养，每隔七天对生长出来的微生物进行一次转接，重复六次，使得各培养基中菌株得以分离、纯化，最终获得单一菌株；
C、将分离纯化的每一单一菌株接种到含有2mg/L的恩诺沙星抗生素和300mg/L锌离子的培养基中进行恩诺沙星降解实验和锌离子吸附实验，考察单一菌株对PDA培养基中恩诺沙星的降解能力及锌的吸附能力，最终，选择单一菌株中对恩诺沙星降解效果最高的微生物TLT1。
所得纯化后单菌株为Talaromyces菌，命名为TLT1，于2023年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏编号为：GCMCC No:40754。
上述获得菌株经过DNA提取，PCR扩增，序列测序及序列比对，菌株TLT1的16s rDNA序列与篮状菌Talaromyces同源性达99.9％以上，亲缘关系最近，鉴定为篮状菌，简称为TLT1。其形貌见图1。
筛选用各培养基成分：
无机盐液体培养基(g/L)：((NH4)2SO4为1.2、KH2PO4为1.2、K2HPO4为1.2、NaCl为0.5、FeCl3 6H2O为0.1、CaCl2为0.05，无水葡萄糖为15，调pH＝7.0)，经水定容至1L。
基础培养基(g/L)：酵母粉为5，蛋白胨为10，NaCl为10；培养基使用前现在121℃下高温灭菌20min。
马铃薯培养基：200g切块的新鲜马铃薯与加热炉上煮沸20min后，滤去土豆块后向上清液加入20g葡萄糖，定容至1L。
无机盐固体培养基(g/L)：((NH4)2SO4为1.2、KH2PO4为1.2、K2HPO4为1.2、NaCl为0.5、FeCl3 6H2O为0.1、CaCl2为0.05，无水葡萄糖为15，调pH＝7.0)，20g琼脂粉加热煮沸。
LB培养基(g/L)：酵母粉为5，蛋白胨为10，NaCl为10；20g琼脂粉加热煮沸。
马铃薯固体培养基：200g切块的新鲜马铃薯与加热炉上煮沸20min后，滤去土豆块后向上清液加入20g葡萄糖，定容至1L。20g琼脂粉加热煮沸。培养基使用前在115℃(含葡萄糖)/121℃(不含葡萄糖)下高温灭菌30min。16s rDNA序列为：
CCCTTGTCTCCTATACACCTGTTGCTTTGGCGGGCCCACCGGGGCCACCTGGTCGCCGGGGGAC
GCACGTCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCGCGCTGTGAACCCTGATGAAGATGGGCTGTCTG
AGTACTATGAAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAAC
GCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA
CATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACG
GCTTGTGTGTTGGGTGTGGTCCCCCCGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCGTCTG
GTCCTCGAGCGTATGGAGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGCGGGGGTTGGTCACCACC
ACATTTTACCACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAACTTAAGCATATC实施例2
菌剂的制备：将上述获得单一菌株TLT1于无菌的无机盐液体培养基中进行活化，活化后按3wt％的接种量接种于液体PDA培养基中并置于10℃恒温培养箱培养至对数期，然后使用无菌生理盐水将菌种冲洗制成干物质量为4g/L的菌悬液即为菌剂。
利用上述获得降解菌剂对低温土壤环境中(10℃)恩诺沙星和锌离子处理试验：
供试土壤取自辽宁省沈阳市某畜禽养殖场地的污染土壤，其质地为沙壤土，pH为7.35，恩诺沙星及锌的有效态的含量分别为428μg/kg和228mg/kg，过2mm筛；取100g土壤向其中接种3wt％上述菌剂，在室外(8-10℃)培养一个月。恩诺沙星和锌污染土壤修复试验设置两种处理：
处理1:对照处理：对照处理1原始土壤(不加菌)0天；对照处理2原始土壤(不加菌)静置30天；
处理2:菌剂处理(菌剂接种量占土壤的3％(w:w))。
每种处理设定三次平行，分别于0天，30天取土壤样品对恩诺沙星和有效态锌的残留量进行分析。整个实验过程中保证土壤含水量为16～22％。实验结果表明：TLT1菌株可耐受恩诺沙星和锌，且对土恩诺沙星具有一定的降解效果，可降低锌的有效态。菌悬液在30天对恩诺沙星的降解效果及锌有效态的影响较0天分别下降了36.8％和68.5％。结果见图2。
实施例3
利用上述获得降解菌剂对常温土壤环境中(20℃)恩诺沙星和锌离子处理试验：
供试土壤取自辽宁省沈阳市某畜禽养殖场地的污染土壤，其质地为沙壤土，pH为7.35，恩诺沙星及锌的有效态的含量分别为428μg/kg和228mg/kg，过2mm筛；取100g土壤向其中接种3％微生物菌剂，在常温室内(20℃)培养一个月。恩诺沙星和锌污染土壤修复试验设置两种处理：
处理1:对照处理：对照处理1原始土壤(不加菌)0天；对照处理2原始土壤(不加菌)静置30天；
处理2:菌剂处理(实施例2记载菌剂)(菌剂接种量占土壤的3％(w:w))。每种处理设定三次平行，分别于0天，30天取土壤样品对恩诺沙星残留量和有效态锌进行分析。整个实验过程中保证土壤含水量为20％。实验结果表明：整个实验过程中保证土壤含水量为16～22％。实验结果表明：TLT1菌株可耐受恩诺沙星和锌，且对土恩诺沙星具有一定的降解效果，可降低锌的有效态。菌悬液在30天对恩诺沙星的降解效果及锌有效态的影响较0天分别下降了44.5％和65.8％。结果见图3。
实施例4
利用上述获得降解菌剂对常温土壤环境中(30℃)恩诺沙星和锌离子处理试验：
供试土壤取自辽宁省沈阳市某畜禽养殖场地的污染土壤，其质地为沙壤土，pH为7.35，恩诺沙星及锌的有效态的含量分别为428μg/kg和228mg/kg，过2mm筛；取100g土壤向其中接种3％微生物菌剂，在常温室内(20℃)培养一个月。恩诺沙星和锌污染土壤修复试验设置两种处理：
处理1:对照处理：对照处理1原始土壤(不加菌)0天；对照处理2原始土壤(不加菌)静置30天；
处理2:菌剂处理(实施例2记载菌剂)(菌剂接种量占土壤的3％(w:w))。每种处理设定三次平行，分别于0天，30天取土壤样品恩诺沙星残留量和有效态锌进行分析。整个实验过程中保证土壤含水量为20％。实验结果表明：整个实验过程中保证土壤含水量为16～22％。实验结果表明：TLT1菌株可耐受恩诺沙星和锌，且对土恩诺沙星具有一定的降解效果，可降低锌的有效态。菌悬液在30天对恩诺沙星的降解效果及锌有效态的影响较0天分别下降了49.7％和62.4％。结果见图4。
实施例5:
菌剂的制备：将上述获得单一菌株TLT1于无菌的无机盐液体培养基中进行活化，活化后按5wt％的接种量接种于液体PDA培养基中并置于10℃恒温培养箱培养至对数期，然后使用无菌生理盐水将菌种冲洗制成干物质量为4g/L的菌悬液即为菌剂。
利用上述获得降解菌剂对低温水体环境中(10℃)恩诺沙星降解和锌稳定化实验：
供试水体为实验室内模拟污染水体，pH为6.8，恩诺沙星含量为1000μg/kg，总锌含量为300mg/L；取100mL复合污染水体向其中接种5wt％微生物菌剂，置于10℃恒温环境下培养三天。污染水体修复设置两种处理：处理1:对照处理：对照处理1原始污染水体(不加菌)0天；对照处理2原始污染水体(不加菌)静置3天；
处理2:菌剂处理(菌剂接种量占土壤5％(w:w))。
每种处理设定三次平行，分别于0天，3天取水体样品对恩诺沙星的残留量和总锌含量进行测定。结果见图5，实验结果表明：TLT1菌株可耐受恩诺沙星，且对恩诺沙星具有一定的降解能力，对锌具有良好的吸附能力。菌悬液在3天对恩诺沙星的降解效果达到43.8％，对锌的有稳定可达75.2％。
实施例6:
利用TLT1菌剂对常温环境下(20℃)恩诺沙星-锌复合污染水体的修复实验：
供试水体为实验室内模拟污染水体，pH为6.8，恩诺沙星含量为1000μg/kg，总锌含量为300mg/L；取100mL复合污染水体向其中接种5wt％微生物菌剂，置于20℃恒温环境下培养三天。污染水体修复设置两种处理：处理1:对照处理：对照处理1原始污染水体(不加菌)0天；对照处理2原始污染水体(不加菌)静置3天；
处理2:菌剂处理(菌剂接种量占土壤5％(w:w))。
每种处理设定三次平行，分别于0天，3天取水体样品对恩诺沙星的残留量和总锌含量进行测定。结果见图6，实验结果表明：TLT1菌株可耐受恩诺沙星，且对恩诺沙星具有一定的降解能力，对锌具有良好的吸附能力。菌悬液在3天对恩诺沙星的降解效果达到54.3％，对锌的稳定化能力达58.8％。
实施例7
利用上述获得降解菌剂对常温土壤环境中(20℃)恩诺沙星和锌离子修复试验：
供试土壤取自辽宁省沈阳市某畜禽养殖场地的污染土壤，其质地为沙壤土，pH为7.35，恩诺沙星及锌的有效态的含量分别为428μg/kg和228mg/kg，过2mm筛；取100g土壤向其中接种5％微生物菌剂，在常温室内(20℃)培养一个月。恩诺沙星和锌污染土壤修复试验设置两种处理：
处理1:对照处理：对照处理1原始土壤(不加菌)0天；对照处理2原始土壤(不加菌)静置30天；
处理2:菌剂处理(实施例2记载菌剂)(菌剂接种量占土壤的5％(w:w))。每种处理设定三次平行，分别于0天，30天取土壤样品对恩诺沙星和有效态锌的残留量进行分析。整个实验过程中保证土壤含水量为20％。结果见图7。实验结果表明：整个实验过程中保证土壤含水量为16～22％。实验结果表明：TLT1菌株可耐受恩诺沙星和锌，且对土恩诺沙星具有一定的降解效果，可降低锌的有效态。菌悬液在30天对恩诺沙星的降解效果及锌有效态的影响较0天分别下降了66.5％和77.1％。
综上所述，本发明提供的菌悬液具有较好的抗生素耐药性和降解潜能。本发明筛选的游离单菌可在半天内迅速生长至对数期，繁殖速度快，适应能力强，可同步实现对恩诺沙星的降解及重金属的稳定化，生物降解产物毒性小，速度快，不会造成二次污染，价格低廉，值得推广。
Claims (10)
1.一株耐低温多功能菌，其特征在于：耐低温多功能菌为篮状菌属的菌株TLT1，于2023年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：GCMCC No:40754。
2.一种权利要求1所述的耐低温多功能菌的应用，其特征在于：所述菌株在降解污染环境中抗生素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述菌株在低温下降解污染土壤或水体中抗生素中的应用；其中，抗生素为恩诺沙星。
4.一种权利要求1所述的耐低温多功能菌的应用，其特征在于：所述菌株在稳定环境中重金属的应用。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述菌株在低温下稳定土壤或水体中重金属的应用；其中，重金属为锌。
6.一种耐低温多功能菌剂，其特征在于：菌剂含权利要求1所述菌株。
7.根据权利要求6所述的耐低温多功能菌剂，其特征在于：所述菌剂为含权利要求1所述菌株的培养物或培养菌悬液。
8.根据权利要求7所述的耐低温多功能菌剂，其特征在于：所述菌剂培养液为将所述篮状菌菌株BSLT1置于10～15℃PDA液体培养基中培养至对数生长期，即获得培养液；培养液离心收集沉淀干质量达4～6g/L再经重悬获得培养菌悬液。
9.一种权利要求1所述的耐低温多功能菌剂的应用，其特征在于：所述菌株在降解污染环境中抗生素中的应用；
或；所述菌株在稳定环境中重金属的应用。
10.一种利用权利要求6所述菌剂的使用方法，其特征在于：将所述菌剂施加至待处理污染土壤或水体中，菌剂的干质量为4g/L时，按3～5wt％的接种量施加入待处理污染土壤中。
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