CN113201475B - 一种可富集重金属的放线菌及其应用 - Google Patents

一种可富集重金属的放线菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种可富集重金属的放线菌及其应用，其中，该菌株于2021年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.21594。所述放线菌对镍和镉具有较佳的耐受性，这为研究在镍和镉环境中利用Agromyces sp.CS‑16来富集重金属镍和镉打下基础，从而丰富了利用微生物来修复重金属污染的微生物菌库，提高了微生物对重金属的富集能力并最终为实现利用微生物来修复水体、土壤重金属污染提供技术支持。

Description

一种可富集重金属的放线菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物应用领域，尤其涉及一种可富集重金属的放线菌及其应用。
背景技术
随着城市化和工业化的快速发展，对重金属资源的开发和利用与日俱增，由此引发的重金属污染问题日趋严重。重金属污染的主要来源是采矿业、污水灌溉和重金属超标制品的大量使用等人为活动所致。重金属污染的来源比较广，在环境中残留的时间较长、污染后不容易被发现、且容易通过食物链富集，最终危害到人类的身体健康。
处理重金属污染的传统方法多为物理化学方法，如化学沉淀法、离子交换法、反渗透法、活性炭吸附法和植物动物修复法等，它们各有优点，但不同程度地存在着操作复杂、成本高、能耗大、容易产生二次污染的问题。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可富集重金属的放线菌及其应用，旨在解决现有处理重金属污染的方法不同程度地存在着操作复杂、成本高、能耗大、容易产生二次污染的问题。
本发明的技术方案如下：
一种可富集重金属的放线菌，其中，该菌株于2021年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.21594。
所述可富集重金属的放线菌，其中，所述重金属包括镉和镍。
所述可富集重金属的放线菌，其中，所述放线菌在含重金属Ni2+和Cd2+的液体培养基中生长，对Ni2+和Cd2+耐受性分别为160mg/L和15mg/L。
所述可富集重金属的放线菌，其中，所述放线菌在含25mg/L的Ni2+溶液中培养时，对Ni2+的去除率达到75.94％，富集量为49.50mg/g。
所述可富集重金属的放线菌，其中，所述放线菌在含10mg/L的Cd2+溶液中培养时，对Cd2+的去除率达到100.00％，富集量为28.82mg/g。
一种可富集重金属的放线菌的应用，其中，将所述放线菌用于富集镉和镍。
有益效果：本发明从深圳福田红树林自然保护区筛选出属于Agromyces属的一种可富集重金属的放线菌，该菌株名为Agromyces sp.CS-16，该菌株于2021年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.21594。通过实验验证，所述放线菌对镍和镉具有较佳的耐受性，这为研究在镍和镉环境中利用Agromycessp.CS-16来富集重金属镍和镉打下基础，从而丰富了利用微生物来修复重金属污染的微生物菌库，提高了微生物对重金属的富集能力并最终为实现利用微生物来修复水体、土壤重金属污染提供技术支持。所述Agromyces sp.CS-16在短时间内发酵能够得到大量的微生物生物量，且成本低，操作简单，其具有较高的修复潜力，能有效用于重金属污染治理。
附图说明
图1为本发明提供的可富集重金属的放线菌Agromyces sp.CS-16的正面平板菌落照片。
图2为Agromyces sp.CS-16在重金属Ni2+环境中起始Ni2+浓度和去除率的关系图。
图3为Agromyces sp.CS-16在重金属Ni2+环境中起始Ni2+浓度和吸附量的关系图。
图4为Agromyces sp.CS-16在重金属Cd2+环境中起始Cd2+浓度和去除率的关系图。
图5为Agromyces sp.CS-16在重金属Cd2+环境中起始Cd2+浓度和吸附量的关系图。
具体实施方式
本发明提供一种可富集重金属的放线菌及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
微生物修复法是一种很有潜力的重金属污染治理方法，利用土壤中的某些微生物对重金属具有吸收、沉淀、氧化和还原等作用，从而降低污染环境中重金属的毒性，它不仅修复快，而且对周围环境影响较小，不会产生二次污染，利用生长细胞进行生物富集是微生物修复法中重要的一种技术。生长中的细胞具有自给自足的能力，在物理吸附后能继续代谢和吸收金属，分散在细胞内的金属进入空泡等细胞，再与细胞内的蛋白质螯合，这些过程通常是不可逆的。
一般来说，土壤中的微生物容易受到金属污染物的影响，导致微生物种群密度下降甚至灭绝。然而，微生物具有很强的环境特异性，根据环境的不同可表现出不同的形态结构和功能，从生物进化的角度来看，适者生存，微生物能够在重金属污染的环境中生存并形成一定的耐受性，逐渐成为土壤中的优势种群，甚至能利用重金属完成一定的生理活动。
红树林是陆地向海洋过渡的生态系统，有着丰富的生物资源。由于其特殊的地理位置，长期遭受海水的侵蚀和海浪的侵袭，红树植物发达的根系在减缓潮水冲刷效应的同时，能够促进颗粒物的沉积。作为海岸带的天然屏障，汇集了人类生产活动的大量污染物，重金属就是其中的重要污染物之一。在重金属环境中存在着大量的微生物。微生物对环境的变化是高度敏感的，不适应重金属环境的微生物种群密度下降甚至灭绝，但有部分的微生物对重金属的毒性具有一定的抵抗能力，能够耐受重金属污染的环境而存活下来并形成一定的耐受性，并逐渐发展成为土壤中的优势种群，因此是培养具有耐受重金属生长微生物的良好环境。
基于此，本发明提供了一种从深圳福田红树林自然保护区筛选出的属于Agromyces属的一种可富集重金属的放线菌，该菌株名为Agromyces sp.CS-16，该菌株于2021年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.21594。
具体来讲，在深圳福田红树林自然保护区潮滩处(经度144°00′，纬度22°31′，大地高-3.9792cm)进行样品的采集，快速放于无菌袋中，置于冰上，运回实验室于4℃冰箱保存。
利用传统平板培养法对菌株进行筛选：首先将样品与无菌水混合摇匀，并进行梯度稀释，取稀释液100μL涂布到含有50mg/L Ni2+和5mg/L Cd2+的LA固体培养基上，加入玻璃珠在超净工作台中呈十字形摇晃，以使稀释液均匀的铺在培养基上，每天观察菌落的生长状况，将颜色、形态不同的菌落分离出来接种到新鲜的培养基中进行纯化培养，得到如图1所示的菌落图，如图所示，在培养基上观察到菌落为黄色，圆形，菌落表明光滑，中间有凸起，菌落质地均一。
采用天根试剂盒对菌株进行DNA的提取，基于16S rRNA序列分析对微生物进行鉴定，采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)进行扩增。PCR反应在20μL体积中进行，其中含有1μL模板DNA、正反向引物各0.5μL，10μL的Taq-DNA聚合酶和8μL的ddH2O；PCR反应程序为：95℃预变性5min，随后进行32个循环，包括95℃变性30s；59℃退火30s；72℃延伸2min，再在72℃下延伸5min，最后于4℃保存。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，使用ABI 3730xl自动DNA测序仪进行序列的分析，结果被提交到NCBI核苷酸数据库中，与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较确定到种属，最终确定所提取的菌株归于Agromyces属，该菌株名为Agromycessp.CS-16。
进一步地，将Agromyces sp.CS-16在LA固体培养基上进行活化，然后挑取单菌落于LB液体培养基中在35℃，200rpm，35℃的摇床中进行种子液的摇培，待种子液生长到对数期时，以0.05％的接种量加入提前配制好的含梯度Ni2+和Cd2+的LB液体培养基中，相同条件下摇培10d，通过观察菌液是否变浑浊，或通过酶标仪测量595nm条件下的吸光度值是否发生变化予以辅助判断，若某浓度下的菌液变浑浊，则说明该菌能够耐受此浓度重金属的环境而生存。
作为举例，将Agromyces sp.CS-16在LA固体培养基上进行活化，然后挑取单菌落于LB液体培养基中在35℃，200rpm，35℃的摇床中进行种子液的摇培，待种子液生长到对数期时，以0.05％的接种量加入提前配制好的Ni2+浓度分别为200mg/L、160mg/L、120mg/L、80mg/L、40mg/L和10mg/L的LB液体培养基中，相同条件下摇培10d，通过观察发现在160mg/L、120mg/L、80mg/L、40mg/L和10mg/Ld的LB液体培养基培养的菌液变浑浊，在200mg/L的LB液体培养基培养的菌液未变浑浊，说明该放线菌能够在低于160mg/L的Ni2+浓度环境下生存。
作为举例，Agromyces sp.CS-16在LA固体培养基上进行活化，然后挑取单菌落于LB液体培养基中在35℃，200rpm，35℃的摇床中进行种子液的摇培，待种子液生长到对数期时，以0.05％的接种量加入提前配制好的Cd2+浓度分别为20mg/L、15mg/L、12mg/L、8mg/L、4mg/L和2mg/L的LB液体培养基中，相同条件下摇培10d，通过观察发现在15mg/L、12mg/L、8mg/L、4mg/L和2mg/L的LB液体培养基培养的菌液变浑浊，在20mg/L的LB液体培养基培养的菌液未变浑浊，说明该放线菌能够在低于15mg/L的Cd2+浓度环境下生存。
在一些实施方式中，通过实验验证所述Agromyces sp.CS-16对金属镍和镉具有富集作用：首先，将Agromyces sp.CS-16在LA固体培养基上进行活化，然后挑取单菌落于LB液体培养基中在35℃，200rpm，35℃的摇床中进行种子液的摇培，待种子液生长到对数期时，以5％的接种量转移到250mL新鲜的LB液体培养基中，并在相同条件下培养约48～60h，然后将菌液于8000rpm下离心10min收集菌体，并用高纯水清洗两次，以除去残留的培养基。将菌体分别加入到提前配制好的新鲜含重金属离子的溶液中，溶液体系为20mL，Ni2+浓度分别为25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L和120mg/L，Cd2+浓度分别为10mg/L、25mg/L、40mg/L、55mg/L和70mg/L。在200rpm，35℃的摇床中摇培2h，然后通过离心收集上清液，使用电感耦合等离子体光谱发射仪(ICP-OES，OPTIMA7000，Perkin Elmer)测定上清液中金属离子的浓度。以不加菌体的空白溶液做对照，每组实验设置三个重复。金属离子的去除率(R)和生物富集量(Q)由下式计算
R＝(1-Ct/C0)×100％
Q＝(C0-Ct)×V/M
公式中，R为Agromyces sp.CS-16对金属离子的去除率(％)，Q为Agromycessp.CS-16对金属离子的生物富集量(mg/g)，Ct为Agromyces sp.CS-16富集金属离子后溶液的终浓度(mg/L)，C0为Agromyces sp.CS-16富集金属离子前溶液的浓度(mg/L)，V为溶液的体积(L)，M为Agromyces sp.CS-16干菌体质量(g)；最后结果用平均值±标准差表示。
在一些实施方式中，通过实验验证所述Agromyces sp.CS-16对金属镍具有富集作用：首先，将Agromyces sp.CS-16在LA固体培养基上进行活化，然后挑取单菌落于LB液体培养基中在35℃，200rpm，35℃的摇床中进行种子液的摇培，待种子液生长到对数期时，以5％的接种量转移到250mL新鲜的LB液体培养基中，并在相同条件下培养约48～60h，然后将菌液于8000rpm下离心10min收集菌体，并用高纯水清洗两次，以除去残留的培养基。将菌体分别加入到提前配制好的新鲜含重金属离子的溶液中，溶液体系为20mL，Ni2+浓度分别为10mg/L、25mg/L、40mg/L、55mg/L和70mg/L。在200rpm，35℃的摇床中摇培2h，然后通过离心收集上清液，使用电感耦合等离子体光谱发射仪(ICP-OES，OPTIMA7000，Perkin Elmer)测定上清液中金属离子的浓度。以不加菌体的空白溶液做对照，每组实验设置三个重复。测得结果如图2和图3所示，从图中可以看出，所述放线菌在含25mg/L的Ni2+溶液中培养时，对Ni2 +的去除率最高，达到75.94％，富集量为49.50mg/g。
在一些实施方式中，通过实验验证所述Agromyces sp.CS-16对金属镉具有富集作用：首先，将Agromyces sp.CS-16在LA固体培养基上进行活化，然后挑取单菌落于LB液体培养基中在35℃，200rpm，35℃的摇床中进行种子液的摇培，待种子液生长到对数期时，以5％的接种量转移到250mL新鲜的LB液体培养基中，并在相同条件下培养约48～60h，然后将菌液于8000rpm下离心10min收集菌体，并用高纯水清洗两次，以除去残留的培养基。将菌体分别加入到提前配制好的新鲜含重金属离子的溶液中，溶液体系为20mL，Cd2+浓度分别为10mg/L、25mg/L、40mg/L、55mg/L和70mg/L。在200rpm，35℃的摇床中摇培2h，然后通过离心收集上清液，使用电感耦合等离子体光谱发射仪(ICP-OES，OPTIMA7000，Perkin Elmer)测定上清液中金属离子的浓度。以不加菌体的空白溶液做对照，每组实验设置三个重复。测得结果如图4和图5所示，从图中可以看出，所述放线菌在含10mg/L的Cd2+溶液中培养时，对Cd2 +的去除率最高，达到100.00％，富集量为28.82mg/g。
通过实验验证，本发明提供的所述可富集重金属的放线菌对镍和镉具有较佳的耐受性，这为研究在镍和锌环境中利用Agromyces sp.CS-16来富集重金属镍和镉打下基础，从而丰富了利用微生物来修复重金属污染的微生物菌库，提高了微生物对重金属的富集能力并最终为实现利用微生物来修复水体、土壤重金属污染提供技术支持。所述Agromycessp.CS-16在短时间内发酵能够得到大量的微生物生物量，且成本低，操作简单，其具有较高的修复潜力，能有效用于重金属污染治理。
基于所述重金属耐受性酵母菌的特性，本发明还提供一种可富集重金属的放线菌的应用，将所述放线菌用于富集镍和镉，从而实现利用微生物来修复水体、土壤重金属污染。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种可富集重金属的放线菌，其特征在于，所述放线菌属于壤霉菌属(Agromyces)，名为Agromyces sp.CS-16，该菌株于2021年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.21594。
2.根据权利要求1所述可富集重金属的放线菌，其特征在于，所述重金属包括镉和镍。
3.根据权利要求2所述可富集重金属的放线菌，其特征在于，所述放线菌在含重金属Ni2 +和Cd2+的液体培养基中生长，对Ni2+和Cd2+耐受性分别为160mg/L和15mg/L。
4.根据权利要求2所述可富集重金属的放线菌，其特征在于，所述放线菌在含25mg/L的Ni2+溶液中培养时，对Ni2+的去除率达到75.94％，富集量为49.50mg/g。
5.根据权利要求2所述可富集重金属的放线菌，其特征在于，所述放线菌在含10mg/L的Cd2+溶液中培养时，对Cd2+的去除率达到100.00％，富集量为28.82mg/g。
6.一种如权利要求1-5任一所述可富集重金属的放线菌的应用，其特征在于，将所述放线菌用于富集镉和镍。
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Chen Screening of nitrogen removal bacteria and its application in aquaculture wastewater treatment

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