CN107090422B - 一种含可溶性二硫化钼的微生物菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含可溶性二硫化钼的微生物菌剂及其应用，所述可溶性二硫化钼材料由二硫化钼与壳聚糖复合制备而得；所述菌剂由巨大芽孢杆菌XJ06‑26（Bacillus megaterium，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC NO：60094）发酵制得，并且在发酵过程中添加0.03‑0.08ppm可溶性二硫化钼材料；所述保护剂采用脱脂奶粉、甘油、海藻糖中的任意一种或几种的组合。本发明的微生物菌剂有较高的存活率，可以有效耐受并吸附重金属铅，显著降低可交换态铅含量，所述菌剂可用于重金属污染土壤的治理修复。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域或者环境治理技术领域，涉及一种微生物菌剂的制备及应用该微生物菌剂进行土壤重金属的脱除。
背景技术
随着染料、电镀等工业的发展，以及人们对金属矿藏的不合理开采，越来越多的重金属进入水体。重金属具有致突变、致癌、致畸作用。重金属很难被生物体降解，且能通过食物链传递并富集，可经多种途径进入人体，严重危害人体健康。
常见的土壤重金属污染治理方法主要包括物理法、化学法和生物法。物理法和化学法见效相对较快，但成本偏高，容易产生二次污染。生物法主要是利用植物和微生物对重金属的吸附和钝化作用。其中微生物治理重金属污染，具有成本低、高效率、对环境破坏小、无二次污染、适合于大面积修复等优点，应用潜力巨大。
将微生物制备成微生物菌剂并用作土壤修复剂，在土壤重金属污染治理已初见成效。然而微生物的生存和繁殖对环境有一定要求，在实际应用过程中死亡率高，极大限制了微生物在土壤污染治理中的应用，因此急需开发一种新型的高存活率土壤治理菌剂。
发明内容
本发明的技术目的在于提供一种含可溶性二硫化钼材料的新型微生物菌剂，能显著耐受并吸附重金属的细菌，可用于重金属污染的土壤的治理。
具体的，本发明的技术方案如下：
一种含可溶性二硫化钼的微生物菌剂，所述微生物菌剂包含巨大芽孢杆菌XJ06-26和可溶性二硫化钼材料；所述巨大芽孢杆菌XJ06-26保藏编号为GDMCC NO：60094，所述可溶性二硫化钼材料由二硫化钼与壳聚糖复合而成。
本发明的方法，所述微生物菌剂具体制备方式为：将巨大芽孢杆菌XJ06-26菌种扩培后，接种至发酵罐中，菌种达到对数生长期时，向发酵液中添加可溶性二硫化钼材料，继续培养后收集发酵液；发酵液离心后收集菌体，并加入保护剂，随后冷冻干燥得到冻干菌粉；根据冻干菌粉实际活菌数，以腐殖酸和膨润土的混合物为载体，配制成所述微生物菌剂。其中，所述保护剂为脱脂奶粉、甘油、海藻糖中任一种或几种的组合。
本发明的方法，所述可溶性二硫化钼材料添加量为0.03-0.08ppm；优选0.08ppm。添加0.03-0.08ppm可溶性二硫化钼材料能使存活率提高5.9％-8.9％，提高微生物菌剂对重金属铅的耐受性和吸附性。
进一步的，所述可溶性二硫化钼材料具体制备方法为：二硫化钼加上壳聚糖在研钵中研磨，后加入BMIPF6离子溶液于研钵中继续研磨；收集研磨的混合物，然后分别用丙酮，DMF，乙酸清洗后得到。采用这一制备方法容易大规模制备可溶性二硫化钼，同时所得材料中包含大颗粒二硫化钼，更有利于吸附重金属离子。
本发明所述的微生物菌剂在常温下存放半年后，检测其活菌数和存活率，同时发现添加可溶性二硫化钼材料能提高微生物菌剂的耐铅性能、铅吸附能力。
本发明的另一目的在于提供所述微生物菌剂在重金属污染土壤治理中的应用。
本发明中提供了一种具体的应用方法：将菌剂接种到重金属铅污染土壤样品中，置于25℃恒温培养箱中培养待测。相比于未接种土样、接种不含可溶性二硫化钼材料的菌剂土样，接种含可溶性二硫化钼材料的菌剂土样中的可交换态铅含量显著降低。
本发明的作用机理可能在于：经壳聚糖修饰后的可溶性二硫化钼材料，具有高比表面积、高吸附性，促进巨大芽孢杆菌的孢子形成和健壮，使得菌剂存活率和复活速度提高；同时二硫化钼对重金属离子有一定吸附能力，减缓重金属离子对微生物的影响，最终增强微生物菌剂对环境耐受力的活力，更好发挥治理土壤重金属污染的作用。
本发明的有益效果在于：
以壳聚糖修饰二硫化钼，制得可溶性二硫化钼材料，该材料在水溶液中有良好分散性，将该材料加入前期筛选得到的一株耐重金属的巨大芽孢杆菌XJ06发酵液中制得微生物菌剂。添加0.03-0.08ppm可溶性二硫化钼材料能使存活率提高5.9％-8.9％，提高微生物菌剂对重金属铅的耐受性和吸附性，显著增强对土壤中有害价态。
附图说明
图1壳聚糖修饰前后的二硫化钼在水相中分散性比较(左：修饰前；右：修饰后)；
图2壳聚糖修饰后的可溶性二硫化钼材料的扫描电镜观察；
图3壳聚糖修饰后的可溶性二硫化钼材料的拉曼光谱；
图4壳聚糖(CS)、未修饰二硫化钼(MoS2)、壳聚糖修饰后二硫化钼(CS-MoS2)红外吸收光谱。
具体实施方式
实施例1：本实施例说明本发明使用到的可溶性二硫化钼材料的制备方法
将250mg二硫化钼加上100mg壳聚糖在研钵中研磨10分钟；再加入0.5mL BMIPF6离子溶液于研钵中，研磨50分钟；收集研磨的混合物，然后分别用丙酮，DMF，0.5％乙酸清洗以去掉离子溶液和多余的壳聚糖，循环清洗3次后，收集沉淀并悬浮于无菌水中，储存于4℃冰箱。
上述制备方法涉及的具体步骤可参考相关文献(Zhang et al.,(2015)Aone-stepapproach to the large-scale synthesis of functionalized MoS2nanosheets byionic liquid assisted grinding.Nanoscale 7:10210-10217)，本发明的制备方法基于本发明菌剂制备的需求作了进一步改进，文献中采用的方法可以获得小颗粒二硫化钼，但产率较低。本发明需要可溶性二硫化钼的量较大，因此在本发明中，省略后续的离心步骤。本发明改进后的方法容易大规模制备可溶性二硫化钼，同时所得材料中包含大颗粒二硫化钼，更有利于吸附重金属离子。
与未处理的二硫化钼相比，经壳聚糖修饰的二硫化钼在水相中具有更好的分散性(图1)，扫描电镜观察结果显示所制备的可溶性二硫化钼材料为层状结构(图2)，拉曼结果显示该可溶性二硫化钼材料为约包含10层二硫化钼(图3)，红外吸收光谱结果显示修饰后的可溶性二硫化钼材料含有壳聚糖与二硫化钼的特征吸收峰，表明该材料为壳聚糖与二硫化钼的复合物(图4)。
实施例2：微生物菌剂的制备
在前期工作中，我们筛选诱变得到该巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)XJ06-26，于2016年10月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCC NO：60094(该部分内容已在申请号为201610986212.0的专利中详细阐述)。
巨大芽孢杆菌XJ06-26菌种扩培后，接种至发酵罐中，在8-10h菌种达到对数生长期时，向发酵液中添加0.03-0.08ppm可溶性二硫化钼材料，继续培养21h后收集发酵液。发酵pH值为6-7.5，温度33-38℃，搅拌速度150rpm。在-6℃-4℃下，将发酵液5500rpm离心后收集菌体，并加入保护剂(保护剂由10％脱脂奶粉、5％甘油及2％海藻糖组成，三者体积比为1:1:0.1)，随后冷冻干燥得到含水率约为1％的冻干菌粉。根据菌剂实际活菌数，以腐殖酸和膨润土(两者重量比1.5:1)的混合物为载体，配制成活菌数为5.2亿/g的菌剂。
实施例3：可溶性二硫化钼材料对微生物菌剂存活率的影响
按照前述微生物菌剂的制备方法，在对照组中不添加可溶性二硫化钼材料，在实验组1中添加未经壳聚糖修饰的可溶性二硫化钼材料0.08ppm，实验组2中添加经现有文献方法制备的壳聚糖修饰的可溶性二硫化钼材料0.08ppm，在实验组3、实验组4、实验组5中分别在发酵过程中添加经本发明方法制备的0.03ppm可溶性二硫化钼材料、0.05ppm可溶性二硫化钼材料、0.08ppm可溶性二硫化钼材料。将不同实验组制得的微生物菌剂常温下存放半年，分别检测其活菌数和存活率，并与对照组比较。其结果如表1所示：
表1可溶性二硫化钼材料对微生物菌剂存活率的影响
如表1所示，对照组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4、实验组5的存活率分别是85.1％、87％、86.7％、91％、92％、94％，由此可见采用本发明方法制备的可溶性二硫化钼，更能保持菌种存活率。与对照组相比，添加0.03-0.08ppm可溶性二硫化钼材料能使存活率提高5.9％-8.9％。
实施例4：可溶性二硫化钼材料对微生物菌剂耐重金属性能的影响
将实施例3中实验组3-5制备的不同含量可溶性二硫化钼材料的微生物菌剂(活菌总数均为5亿)加入50mL含不同浓度铅(5、10、20、30、40、50、60mg/L)的发酵培养基中，摇瓶摇床培养(25℃，225rpm)一周。随后将发酵培养基中的巨大芽孢杆菌涂布于分离培养基平板上，25℃培养6-7天。结果显示，对照组菌剂在暴露于含铅浓度高于30mg/L的发酵培养基中一周后，平板上无菌落生长；而实验组3、实验组4、实验组5在暴露于含铅浓度高于40mg/L的发酵培养基中一周后，平板上无菌落生长，可见可溶性二硫化钼材料能提高微生物菌剂对重金属铅的耐受性。
实施例5：可溶性二硫化钼材料对微生物菌剂重金属铅吸附的影响
将实施例3中实验组3-5制备的不同含量可溶性二硫化钼材料的微生物菌剂(活菌总数均为5亿)加入50mL含铅(0.3mg/L)的生理盐水溶液中，摇瓶摇床培养(25℃，225rpm)一周后，取上清测定吸附前后溶液中铅离子浓度的变化。结果显示如下表2所示：
表2可溶性二硫化钼材料对微生物菌剂重金属铅吸附的影响
| 组别 | 铅离子浓度 |
| 对照组 | 0.21 |
| 实验组3 | 0.18 |
| 实验组4 | 0.145 |
| 实验组5 | 0.1 |
如表2所示，对照组、实验组3、实验组4、实验组5中的铅离子浓度分别为0.21mg/L、0.18mg/L、0.145mg/L、0.1mg/L，可见可溶性二硫化钼材料的添加有助于微生物菌剂对重金属铅的吸附。
实施例6：可溶性二硫化钼材料对微生物菌剂转变土壤中铅价态性能的影响
向风干过筛的土壤中加入硝酸铅溶液，喷施去离子水保持其含水量为田间土壤持水量的70％，在室温下保持两个月后，风干过2mm筛，制成铅污染浓度为10mg/kg的土壤样品。随后将实施例3中实验组3-5制备的不同含量可溶性二硫化钼材料的微生物菌剂(活菌总数均为5亿)分别加入50g所制得的铅污染土壤样品中，置于25℃恒温培养箱中分别培养待测。以同样方法制备的相同铅污染浓度的土壤样品为对照组，进行同样的检测。
30天后取上述几种土样测定其不同形态铅的含量。检测方法参考文献“张汉萍等.土壤中铅的含量及其化学形态分析，理化检验-化学分册，2006,42(9):705-708”中公布的方法。上述几种土样中可交换态铅、碳酸盐结合态铅、铁锰氧化态铅、有机质结合态铅的含量如表3所示；
表3可溶性二硫化钼材料对微生物菌剂转变土壤中铅价态性能的影响
从表3可以看出，接种含可溶性二硫化钼材料微生物菌剂经30天的菌种繁殖作用后，土壤中可交换态铅含量显著降低，与未接种土样及接种不含可溶性二硫化钼材料微生物菌剂土样相比，接种含0.3ppm可溶性二硫化钼材料微生物菌剂土样中可交换态铅分别降低51％和43.5％，同时接种含0.8ppm可溶性二硫化钼材料微生物菌剂土样中可交换态铅分别降低55％和47.7％，此外接种含可溶性二硫化钼材料微生物菌剂土样中碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机质结合态等非活性形态的铅含量均显著上升，说明接种含可溶性二硫化钼材料微生物菌剂能有效降低土壤中可交换态等有效态铅的含量。
Claims (7)
1.一种含可溶性二硫化钼的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含巨大芽孢杆菌XJ06-26和可溶性二硫化钼材料；所述巨大芽孢杆菌XJ06-26保藏编号为GDMCC NO：60094，所述可溶性二硫化钼材料由二硫化钼与壳聚糖复合而成；
其制备方法为：
二硫化钼加上壳聚糖在研钵中研磨，后加入BMIPF6离子溶液于研钵中继续研磨；收集研磨的混合物，然后分别用丙酮，DMF，乙酸清洗后得到可溶性二硫化钼材料；
巨大芽孢杆菌XJ06-26菌种扩培后，接种至发酵罐中，菌种达到对数生长期时，向发酵液中添加0.03-0.08ppm可溶性二硫化钼材料，继续培养后收集发酵液；
发酵液离心后收集菌体，并加入保护剂，随后冷冻干燥得到冻干菌粉；
根据冻干菌粉实际活菌数，以腐殖酸和膨润土的混合物为载体，配制成所述微生物菌剂。
2.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，所述可溶性二硫化钼材料添加量为0.08ppm。
3.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，所述保护剂为脱脂奶粉、甘油、海藻糖中任一种或几种的组合。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述保护剂为10％脱脂奶粉、5％甘油及2％海藻糖的混合物，三者体积比为1:1:0.1。
5.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，腐殖酸和膨润土混合物载体中，腐殖酸和膨润土重量比为1.5:1。
6.权利要求1-5任一项所述微生物菌剂在重金属污染土壤治理中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将菌剂接种到重金属污染土壤样品中，置于25℃恒温培养箱中培养。
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