CN118389361A - 一种钝化类重金属砷菌株As01及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物学技术领域，具体涉及一种钝化类重金属砷菌株As01及应用。一种钝化类重金属砷菌株As01，所述钝化类重金属砷菌株As01的分类学名为Bacillus altitudinis As01，于2023年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M20232081。本发明对耐砷菌株进行筛选，通过形态学观察和16S rRNA序列测序对耐砷菌株进行鉴定，获得可钝化类重金属砷的菌株Bacillus altitudinis As01，其具有较强耐砷能力，可为发展土壤类重金属污染微生物修复技术提供菌种资源。
Description
技术领域
本发明属于微生物学技术领域，具体涉及一种钝化类重金属砷菌株As01及应用。
背景技术
砷（As）是生物毒性极强的一种类重金属砷元素，被国际癌症研究机构（IARC）列为Ⅰ级致癌物。砷广泛存在于土壤和水体中，可通过食物链进入人体，大量累积砷于人体会有致畸、致癌和致突变风险。
对于砷污染土壤的修复方法有物理修复、化学修复和生物修复。其中，与物理和化学方法相比，生物去除法具有价格便宜，环境友好等优点，而受到人们的关注。研究表明生物修复能够有效的降低类重金属砷的生物有效性，减少作物的吸收，保障农产品安全。在生物修复中，可利用自然界中微生物（细菌、藻类和酵母等）的耐砷特性与砷吸收、氧化还原、甲基化、区隔化和外排等过程密切关系实现砷在微生物体内的转运转化，或者将类重金属砷转化为无毒性或低毒的形式，或者通过吸附作用，将其固定于生物细胞内，从而达到自然净化的结果。微生物种类多，生长快，代谢快，对环境适应性强，所以利用微生物技术治理环境中的砷污染是目前环境污染治理研究的热点。
发明人通过对土壤环境中的微生物进行研究，筛选出一株具有钝化类重金属砷功能的菌株，其具有较强耐砷能力，能吸附去除溶液中的砷，可为发展土壤类重金属砷污染微生物修复技术提供菌种资源。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种钝化类重金属砷菌株As01及应用。
本发明的第一个目的在于提供一种钝化类重金属砷菌株As01，其分类学名为Bacillus altitudinis As01，于2023年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M20232081。
本发明的第二个目的在于提供所述钝化类重金属砷菌株As01在钝化环境中类重金属砷中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明对耐砷菌株进行筛选，通过形态学观察和16S rRNA序列测序对耐砷菌株进行鉴定，获得可钝化类重金属砷的菌株Bacillus altitudinis As01，其具有较强耐砷能力，能吸附去除溶液中的砷，可为发展土壤类重金属污染微生物修复技术提供菌种资源。
保藏信息说明
钝化类重金属砷菌株As01，分类学名为Bacillus altitudinis As01，于2023年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCCNo：M20232081。
附图说明
图1为本发明耐砷菌株As01的形态特征；
图2为培养时间对本发明耐砷菌株As01吸附效果的影响；
图3为菌液投入量对本发明耐砷菌株As01吸附效果的影响；
图4为pH对本发明耐砷菌株As01吸附效果的影响。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：菌株筛选与鉴定
1. 土壤样品采集
2023年9月25日于广西全州县水稻田采集砷污染土壤。采用五点取样法取5-20cm的水稻田表层土壤于50mL无菌离心管中，干冰盒保存，用于筛选耐砷菌株。
2. 培养基
LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂15g/L。
LB肉汤培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH值7.0±0.1（25℃）
3. 菌株分离和纯化
称取10.0g新鲜土壤样品置于含有10颗左右无菌玻璃珠的250mL三角瓶中，加入90mL磷酸盐缓冲溶液（PBS），在28℃下200r/min条件下匀速振荡30min。静置沉淀15min后，弃去上清液，加入5mL PBS以悬浮沉淀。使用灭菌移液枪吸取1mL上述土壤悬浊液于10mL离心管中，加入9mL无菌水，得到10-1倍稀释液。随后吸取10-1倍稀释液1mL于装有9mL无菌水的试管中，依次操作分别获得10-2、10-3、10-4的稀释溶液。将稀释液各吸取0.1mL涂布于LB固体培养基上，倒置于28℃培养箱中培养1-3d，将单菌落在平板上划线转接3次以上进行菌种纯化并保存。
4. 耐砷菌株的筛选
将纯化后的菌株按10-2和10-3菌液稀释液分别涂布在As（V）含量最终浓度为0mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、350mg/L和400mg/L的LB固体培养基上，待菌落长出后，观察其生长情况。
筛选出一株具有较高耐砷能力的菌株，将其命名为As01。菌株As01的耐砷能力见下表1。
注：+表示生长；-表示不生长
5. 耐砷菌株As01形态观察
将耐砷菌株As01接种到LB固体培养基上，37℃下培养，菌落形态见图1。
由图1可知，耐砷菌株As01菌落呈白色，表面粗糙，不透明，边缘不整齐。
6. 菌株16S rRNA鉴定
运用16S Sanger法对耐砷菌株As01进行测序：以提取的基因组DNA为模板，选择细菌通用引物27F和1492R，进行16S rRNA基因扩增。其中，引物序列如表2；PCR反应体系如表3；
PCR程序为：95℃，5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 90s，循环25次；72℃，10min。
将纯化后的PCR产物进行16S rRNA测序，测序结果见SEQ ID No.3。通过引物扩增出的16S rRNA基因序列，与NCBI数据库对比后，获得相似序列的物种信息并构建进化树构建，借助同源比对的方法辅助判断物种信息，确定As01为Bacillus altitudinis，将其命名为Bacillus altitudinis As01。
实施例2：菌株As01去除砷试验
1. 菌液制备
将菌株As01接种于LB肉汤培养基中，28℃ 180r/min摇床中培养至生长对数期（约12h），在4℃下离心10min，沉淀用灭菌去离子水清洗、重悬并离心3次，最后将细菌重悬于0.9%氯化钠（无菌生理盐水）溶液中备用，重悬后，使其OD600=1。
2. 培养时间对吸附效果的影响
配置As（V）含量最终浓度为9.01mg/L的LB肉汤培养基50mL，灭菌后加入2.5%的菌液，在生化培养箱中28℃培养24h、48h、72h、96h、120h，每个处理重复3次。培养结束后，12000 r/min离心5min，取上清液经0.45μm滤膜过滤后用ICP-OES测定重金属溶液浓度。结果见图2。
由图2可知，在24-120h内，耐砷菌株As01对溶液中砷的去除效率为59.56-80.89%；其中，当培养时间为24h时，耐砷菌株As01对砷的去除效果最好。
3. 菌液用量对吸附效果的影响
配置As（V）含量最终浓度为9.01mg/L的LB肉汤培养基50mL，灭菌后将菌液以2.5%、5%、10%、15%和20%的接种量接种于50mL LB肉汤培养基中。在生化培养箱中28℃培养24h，然后12000r/min离心5min，取上清液经0.45μm滤膜过滤后用ICP-OES测定类重金属砷溶液浓度。结果见图3。
由图3可知，菌液投入量在2.5-15%时，耐砷菌株As01对溶液中砷的去除效率为60.62-63.95%其中，当菌液投入量为15.0%时，耐砷菌株As01对砷的去除效果最好。
4. pH值对吸附效果的影响
配置As（V）含量最终浓度为9.01mg/L的LB肉汤培养基50mL，用0.1mol/L NaOH溶液和0.1mol/L HCl溶液分别调节pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0（±0.1），即得6种不同pH值的As（V）溶液，每个处理3个重复。灭菌后加入2.5%的菌液，在生化培养箱中28℃培养24h，然后12000r/min离心5min，取上清液经0.45μm滤膜过滤后用ICP-OES测定重金属溶液浓度。结果见图4。
由图4可知，在pH为3.0-8.0内，耐砷菌株As01对溶液中砷的去除效率为52.22-57.79%；其中，当pH=6时，耐砷菌株As01对砷的去除效果最好。
去除效率=（初始溶液砷浓度-处理后的溶液砷溶度）/初始溶液砷浓度×100%
综上所述，本发明的耐砷菌株As01具有较强耐砷能力，可以为发展土壤类重金属砷污染微生物修复技术提供菌种资源。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (2)
1.一种钝化类重金属砷菌株As01，其特征在于，所述钝化类重金属砷菌株As01的分类学名为Bacillus altitudinis As01，于2023年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M20232081。
2.权利要求1所述钝化类重金属砷菌株As01在钝化环境中类重金属砷中的应用。
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