CN114395508B - 一种具有重金属吸附和促生作用的蜡样芽孢杆菌菌株sem-15及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有重金属吸附作用的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株SEM‑15及其应用，属于功能微生物技术领域。具有重金属吸附作用的蜡样芽孢杆菌菌株SEM‑15，保藏编号为GDMCC No：61562。菌株SEM‑15可高效吸附土壤或水体中重金属铅，因此可用于制备重金属污染修复剂。同时菌株SEM‑15还能将无机磷转化为高浓度可溶性磷，提高土壤肥力，稳定分泌吲哚乙酸，促进作物生长，因此，本发明还提供了菌株SEM‑1在微生物菌肥中的应用。
Description
技术领域
本发明属于功能微生物技术领域，具体涉及一种具有重金属吸附和促生 作用的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株SEM-15及其应用。
背景技术
重金属污染不仅对耕地与农产品质量构成严重威胁，还直接损害了人民 群众的身体健康，影响基本的社会生活。建设土壤重金属污染治理试点示范 工程，加强修复技术体系研究和推广应用，防控和修复土壤重金属污染，提 高土壤环境质量，保障生态环境与食物安全，已成为国家重大现实需求。
目前，国内外治理土壤重金属污染的途径主要是将重金属从土壤中去 除、改变重金属在土壤中的价态和形态以及降低其在环境中的迁移以及生物 有效性。前者主要适用于重金属污染严重的土壤，后者主要适用于轻、中度 重金属污染的土壤。治理和修复方法有化学修复技术、物理修复技术、生物 修复技术、农业生态修复技术、联合修复技术等。
生物修复是利用生物技术治理污染土壤的一种新方法，利用生物削减净 化土壤中的重金属或降低重金属毒性。生物修复包括植物修复技术和微生物 吸附技术，目前已成为当前环境保护工程科学和技术研究的一个新热点。微 生物修复是利用微生物(细菌、藻类和酵母等)来减轻或消除重金属污染。 微生物修复的机理包括：①通过微生物作用，改变重金属在土壤中的化学 形态，使重金属固定或解毒，降低其在土壤环境中的移动性和生物可利用性；②通过微生物吸收、代谢达到对重金属的削减、净化与固定作用。与物理、 化学修复方法相比，应用环境生物修复技术处理污染物时，最终产物大都是 无害、稳定的物质，不破坏植物生长所需的土壤环境，可以使污染物完全从 环境中去除，处理时间短，并且投资少，不会产生二次污染，操作简单。
但是目前关于微生物菌株的筛选及其土壤环境对菌株修复作用的影响 还有待于进一步研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有重金属吸附和促生作用的蜡 样芽孢杆菌菌株SEM-15及其应用，作为重金属清除剂使用，吸附清除土壤 里的重金属Pb，达到土壤修复的目的。
本发明提供了一种具有重金属吸附作用的蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15， 保藏编号为GDMCC No：61562。
本发明提供了一种重金属污染修复剂，活性成分包括所述蜡样芽孢杆菌 菌株SEM-15。
本发明提供了所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15或所述重金属污染修复剂 在吸附重金属中的应用。
优选的，所述重金属包括铅(Pb)。
优选的，所述重金属的存在介质包括土壤或水体。
优选的，所述吸附的时间为6～50h。
本发明提供了所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15或所述重金属污染修复剂 在溶解无机磷和/或分泌吲哚乙酸中的应用。
优选的，所述溶解无机磷或分泌吲哚乙酸时，所述蜡样芽孢杆菌菌株 SEM-15的处理时间为不低于6d。
优选的，所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15的培养时间为10～14d。
本发明提供了所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15在微生物肥料中的应用。
本发明提供了一种蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15，保藏编号为GDMCC No： 61562。本发明通过形态观察和生理生化实验以及分子鉴定，菌株SEM-15 被鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。对重金属铅的吸附实验表明，菌 株SEM-15通过菌株表面活性物质或者其他方式对重金属Pb进行了吸附钝化，实现重金属铅的吸附。吸附效率实验结果表明，菌株SEM-15对重金属 铅的吸附率为85％以上，能够实现重金属的转移。
本发明提供了所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15或含菌株SEM-15的重金 属污染修复剂在溶解无机磷和/或分泌吲哚乙酸中的应用。所述蜡样芽孢杆菌 菌株SEM-15将无机磷溶解转化为可溶性磷，提高土壤中可溶性磷含量，提 高土壤肥力；同时所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15还具有稳定分泌吲哚乙酸 (IAA)的能力，促使种植作物快速生长。可见，蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15 具有提高土壤肥力、促进作物生长的性能，为制备微生物肥料奠定基础。
附图说明
图1为菌株SEM-15菌落形态图；
图2为菌株SEM-15革兰氏染色结果；
图3为菌株SEM-15吸附重金属铅前后细胞表面结构电镜图；
图4为不同发酵时间菌株SEM-15发酵液中可溶性磷含量结果；
图5为不同发酵时间菌株SEM-15发酵液中的吲哚乙酸(IAA)含量结 果；
图6为不同菌株发酵过程中对磷酸钙的溶解能力，其中不同字母代表在 0.05水平上差异显著；
图7为不同菌株发酵过程中IAA的分泌水平比较结果，柱状图中每组由 左至右分别表示2d、4d、6d、8d处理结果。
生物材料保藏信息
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株，于2021年7月1日保藏于广东 省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码为510075，保藏编号为GDMCC No：61562， 菌株编号为SEM-15。
具体实施方式
本发明提供了一种具有重金属吸附作用的蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15， 保藏编号为GDMCC No：61562。
在本发明中，所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15是从蚕沙、塘泥混合发酵 的样品中分离筛选得到。经牛肉浸膏琼脂培养基培养后，进行形态鉴定： SEM-15菌株的菌落乳白色，圆形，不透明。革兰氏染色处理后，SEM-15 菌株为革兰氏阳性菌株，菌体短杆状。采用16srDNA分子鉴定，SEM-15菌 株的16s序列与Bacillus cereus同源性达99％。综合上述鉴定结果表明， SEM-15菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
在本发明中，以含50mg/LPb2+的培养基为测试样品，随着菌株作用时间 的延长，菌株SEM-15对重金属铅的去除效率也显著上升，并在后期达到一 个相对稳定的水平，作用12h后吸附率为90％以上。同时电镜观察结果表明， 正常SEM-15菌株表面光滑菌株，而重金属铅处理后，菌株表面呈颗粒状， 表明菌株SEM-15通过表面活性物质或者其他方式对重金属Pb进行了吸附 钝化，使Pb从污染体系中转移至菌体表明，实现污染体系中重金属Pb彻底去除。
基于菌株SEM-15吸附重金属的特性，本发明提供了一种重金属污染修 复剂，活性成分包括所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15。
在本发明中，所述修复剂还优选包括辅料。本发明对所述辅料的种类没 有特殊限制，采用本领域所熟知的修复剂辅料即可。所述蜡样芽孢杆菌菌株 SEM-15的浓度为108～ 10CFU/L，更优选为109CFU/L。
本发明对所述重金属污染修复剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域 所熟知的重金属污染修复剂的制备方案即可，例如将扩大培养的蜡样芽孢杆 菌菌株SEM-15菌液与辅料混合得到。
所述重金属污染修复剂适用于土壤或水体的重金属污染的修复中。所述 重金属优选为二价重金属，例如铅、镉、镍及铬等。在本发明实施例中，以 铅为例，说明菌株SEM-15对重金属的吸附性能，但不能理解为对本发明保 护范围的限制。
基于菌株SEM-15吸附重金属的特性，本发明提供了所述蜡样芽孢杆菌 菌株SEM-15或所述重金属污染修复剂在吸附重金属中的应用。
在本发明中，所述重金属包括铅。所述重金属的存在基质优选包括土壤 或水体。菌株SEM-15按照1％的接种量至基质中，所述吸附的时间优选为 6～50h，更优选为12～48h，最优选为24h。当体系中铅浓度为150mg/L时， 菌株SEM-15处理12h吸附率达到89％以上。随着铅浓度的提高，菌株 SEM-15的吸附率略有下降，在铅浓度200mg/L时，菌株SEM-15的吸附率 为78.7％，但较其他筛选的芽孢杆菌或不同菌株的蜡样芽孢杆菌相比仍然有 极显著差异。
基于蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15具有转化难溶解磷至可溶性磷以及稳定 分泌吲哚乙酸的特性，本发明提供了所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15或所述 重金属污染修复剂在溶解无机磷和/或分泌吲哚乙酸中的应用。
在本发明中，所述溶解无机磷或分泌吲哚乙酸时，所述蜡样芽孢杆菌菌 株SEM-15的处理时间优选为不低于6d，更优选为8～14d，进一步优选为 10～13d，最优选为12d。在发明实施例中，所述溶解无机磷或分泌吲哚乙酸 时，蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15的培养基为NA培养基。
在本发明实施例中，所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15培养4天以后发酵 液中可溶性磷含量维持在90mg/L以上，在培养12d时吲哚乙酸的分泌量以 及溶解释放的可溶性磷的量达到最大，吲哚乙酸的分泌量为41.83mg/L，可 溶解磷的浓度达到105.68mg/L。可见，蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15具有增加 可溶性磷含量，提高修复土壤肥力，产生吲哚乙酸的特性，具有促进植物生 长的作用。因此，本发明提供了所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15在微生物肥料中的应用。
本发明对所述微生物肥料的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知 的微生物肥料即可。所述微生物肥料的施用方法也没有特殊限制，采用本领 域所熟知的微生物肥料的施用方法即可。
在本发明中，所述SEM-15菌株对多种重金属污染的环境具有较高的生 存耐受性，实验表明，对SEM-15菌株对铅最高达1000mg/kg，对镉的最高达20mg/kg，对镍和铬最高达为200mg/kg。可见，所述SEM-15菌株对重金 属污染的环境具有极强的适应性，也对多种金属污染的基质的修复提供了可 能。
下面结合实施例对本发明提供的一种具有重金属吸附和促生作用的蜡 样芽孢杆菌菌株SEM-15及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为 对本发明保护范围的限定。
实施例1
蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15的分离及鉴定方法
(1)样品稀释：从蚕沙、塘泥混合发酵处理的土壤中取样，称取5g溶 解到装有45ml无菌水的三角瓶中，150rpm振荡器振荡成均匀的10-1稀释 液，然后用1ml移液枪吸取该稀释液1ml至装有9ml无菌水的试管中，充 分摇匀，即制成10-2的样品稀释液，并依次稀释至10-6。
(2)培养基准备：
NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml，pH值7.0；121℃灭菌20min，于45℃倾倒至无菌的培养皿。
铅耐受培养基：NA培养基灭菌后，添加无菌过滤的终浓度为 150～600mg/L的Pb，于45℃倾倒至无菌的培养皿。
(3)菌种分离、纯化与筛选：分别吸取不同稀释倍数的稀释液0.1ml， 均匀涂布于冷却好的NA培养基(含重金属Pb2+浓度150mg/L)，放置30℃培 养箱中倒置培养5天，观察并挑选长势良好的菌落在NA培养基上划线纯化 培养，得到一株对重金属Pb2+有较好耐受性的单菌落，命名为SEM-15菌株。
(4)菌株的鉴定
A.形态鉴定：SEM-15菌株的菌落乳白色，圆形，不透明(见图1)。
B.革兰氏染色：牛肉浸膏液体培养基，30℃摇床中培养14h后取样革兰 氏染色。SEM-15菌为革兰氏阳性菌株，菌体短杆状(见图2)。
C.16s rDNA比对分析：以菌株悬液为模板，16srDNA通用引物 27F/1492R，PCR反应体系为50μL，反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s，56℃30s，72℃2min，循环30次；72℃延伸10min。PCR产物纯化 后送样测序。测得序列在NCBI进行BLAST比对分析。
(5)菌株SEM-15鉴定结论
根据菌株形态及16s rDNA比对分析结果，本发明SEM-15菌与蜡样芽 孢杆菌(Bacillus cereus)的16s序列同源性达到100％。
鉴定SEM-15为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，已于2021年7月7日 保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No： 61562。保藏地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码 为510075。
实施例2
蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15不同培养时间对重金属铅的吸附效率变化
将采用NB液体培养基接种SEM-15单菌落室温培养，得到活化的 SEM-15菌株按1％的接种量接种至NB培养基，同时培养基中添加终浓度 50mg/L的Pb2+，30℃摇床培养，分别在培养的6h，12h，24h和48h取培 养液，4000rpm离心5min，取上清，未接种菌株的培养基作为对照与与混 合培养液分别设三个重复，采用原子吸收光谱法检测上清液中可溶性铅的含量。
结果见表1和图3。随着作用时间的延长，本发明菌株SEM-15对重金 属铅的去除效率也显著上升，并在后期达到一个相对稳定的水平。
表1不同时间下菌株SEM-15处理后可溶性铅的变化情况
实施例3
蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15吸附重金属铅的细胞表面结构的变化
将活化的SEM-15菌株按照1％的接种量接种至NB培养基，同时培养 基中添加终浓度50mg/L的Pb2+，30℃摇床培养12h，取培养液，4000rpm 离心5min，取上清后用原子吸收光谱法检测其中可溶性铅的含量；沉淀的 菌体利用2.5％的戊二醛固定液固定过夜，分别经过0.1M的磷酸缓冲液重 新3次，每次10分钟；经30％，50％，70％，80％，90％，100％乙醇梯度脱水，叔丁醇置换2次，置换后将样品进行冷冻干燥处理，干燥后的样品 进行离子溅射仪喷镀后，扫描电子显微镜观察、拍照。
结果见图4。结果表明，未经铅处理的SEM-15菌株表面光滑菌株，菌 体长杆状，而重金属铅处理后，菌株表面呈颗粒状，主要通过菌株表面活性 物质或者其他方式对重金属Pb进行了吸附钝化。
实施例4
蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15溶解无机磷的水平变化
将活化后的SEM-15菌株按照1％的接种量接种至磷酸钙为唯一磷源的 发酵培养基(葡萄糖10.0g、Ca3(PO4)25.0g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.2g、 KCl 0.2g、MgSO4·7H2O.1g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、酵 母粉0.5g、蒸馏水定容至1000mL，pH6.8)，在不同发酵时间，采用钼锑 抗比色法测定发酵上清液中的有效磷含量。
结果如图5所示。在发酵4天以后发酵液中可溶性磷含量维持在90mg/L 以上，最高可达105.68mg/L。说明本发明的菌株具有稳定的溶解释放无机磷 中磷的能力。
实施例5
蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15分泌吲哚乙酸(IAA)的规律
将活化后的菌株SEM-15以1％的接种量接种于含色氨酸(100mg/L)的 NA培养基中，37℃、180r/min振荡培养48h后8000r/min离心10min。取 上述离心后的上清液2mL，采用比色法测定上清液中IAA含量，以含色氨酸的无菌NA培养基为对照，测定菌株反应液在535nm下的吸光值 (OD535nm)。
菌株SEM-15在不同时间产生IAA的量见下图6。从第3d到第12d产 生IAA的量不断增加，在第12d时达到了41.83mg/L。其后两天开始缓慢 下降，可能是由于其生成量逐渐低于分解量。
实施例6
蜡样芽孢杆菌SEM-15的重金属耐受性检测
将菌株SEM-15分别在含有不同浓度的重金属Pb(0、100、200、400、 800和1000mg/kg)、Cd(0、20、50和100mg/kg)、Ni(0、20、50、100 和200mg/kg)和Cr(0、20、50、100和200mg/kg)的NA培养基平板上 划线培养，以菌株正常生长为筛选标准，判断菌株SEM-15对不同重金属污 染的耐受极限浓度。
结果发现：SEM-15对检测的重金属最高耐受浓度分别为铅1000mg/kg， 镉20mg/kg，镍和铬200mg/kg。
对比例1
蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15与其他芽孢杆菌菌株相比对不同浓度重金 属铅的吸附效率
将SEM-15菌株及其他本实验筛选(经形态和16srDNA鉴定)的菌株 Pb2(巨大芽孢杆菌)、Pb4(阿氏芽孢杆菌)、Pb5(蜡样芽孢杆菌)、Pb6(蜡 样芽孢杆菌)、Pb7(短小芽孢杆菌)、Pb8(解蛋白芽孢杆菌)、Pb9(地衣芽 孢杆菌)分别按1％浓度接种于NB培养基，同时培养基中分别添加终浓度 25、50、100、150、200mg/L的Pb2+，30℃摇床培养，12h取培养液，4000rpm 离心5min，取上清，对照跟混合培养液分别设三个重复，采用原子吸收光 谱法检测上清液中可溶性铅的含量。
结果如表2中所示，本发明菌株SEM-15对重金属铅的吸附效率最高达 93.1％，随着铅浓度的提高，吸附率逐渐降低，在200mg/L的铅浓度时，菌株 SEM-15的吸附效率为78.7％，但仍然显著高于其他2株对照蜡样芽孢杆菌 菌株。
表2不同起始铅浓度下菌株对Pb2+的吸附效率
对比例2
不同菌株发酵过程中溶解无机磷的能力比较
将SEM-15菌株及其他用于本实验的菌株Pb2(巨大芽孢杆菌)、Pb4(阿 氏芽孢杆菌)、Pb5(蜡样芽孢杆菌)、Pb6(蜡样芽孢杆菌)、Pb7(短小芽孢 杆菌)、Pb8(解蛋白芽孢杆菌)、Pb9(地衣芽孢杆菌)及溶磷对照菌株(巨 大芽孢杆菌GW-1-0201-1305-04，购自广州微元生物科技有限公司，CK)活 化，1％接种磷酸钙为唯一磷源的发酵培养基，在发酵第4天取样，采用钼 锑抗比色法测定发酵上清液中的有效磷含量。
结果如下图7所示，本发明的菌株发酵第四天的发酵液中可溶性磷浓度 达98.4mg/L，表明其释放磷酸钙中磷的能力显著高于对照菌株及其他筛选的 到的菌株。
对比例3
不同菌株发酵过程中IAA的分泌水平比较
将菌株SEM-15及其他用于本实验的菌株Pb2(巨大芽孢杆菌)、Pb4(阿 氏芽孢杆菌)、Pb5(蜡样芽孢杆菌)、Pb6(蜡样芽孢杆菌)、Pb7(短小芽孢 杆菌)、Pb8(解蛋白芽孢杆菌)、Pb9(地衣芽孢杆菌)以1％接种于含色氨 酸(100mg/L)的NA培养基中，37℃、180r/min振荡培养，分别在培养的2、 4、6和8天取发酵液，在8000r/min下离心10min。取上述离心后的上清液 2mL，采用比色法测定上清液中IAA含量，以含色氨酸的无菌NA培养基 为对照，测定菌株反应液在535nm下的吸光值(OD535nm)。
不同菌株发酵上清液中IAA的浓度检测分析结果可知，本发明 的菌株在相同时间发酵上清液中的IAA浓度显著高于其他菌株(P＜ 0.05)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株SEM-15，其特征在于，保藏编号为GDMCCNo：61562。
2.一种重金属污染修复剂，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15，所述重金属为铅，所述蜡样芽孢杆菌菌株 SEM-15的浓度为108～10CFU/L。
3.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15或权利要求2所述重金属污染修复剂在吸附重金属中的应用，所述重金属为铅。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述重金属的存在介质为土壤或水体。
5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述吸附的时间为6～50h。
6.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15或权利要求2所述重金属污染修复剂在溶解无机磷中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，在应用于溶解无机磷时，所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15的处理时间不低于6d。
8.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15或权利要求2所述重金属污染修复剂在分泌吲哚乙酸中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，在应用于分泌吲哚乙酸时，所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15的培养时间为10～14d。
10.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15或权利要求2所述重金属污染修复剂在溶解无机磷和分泌吲哚乙酸中的应用。
11.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌菌株SEM-15在制备微生物肥料中的应用。
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