CN113999838A - 一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂及其制备方法，所述修复剂包括海藻酸钙、生物炭和混合菌剂，所述海藻酸钙将生物炭与混合菌剂包埋于小球内，所述混合菌剂包括淀粉芽孢杆菌HN2、蜡样芽胞杆菌GS6、芽孢杆菌HN8和芽孢杆菌HN11，所述生物炭与混合菌剂的干重比为20‑80：1。本发明提出一种新的改性思路，生物炭不单单起到载体以及保护微生物的作用，微生物还可以利用生物炭中不溶性磷化合物，使其转化为PO₄ ^3‑从而与Pb反应生成沉淀。本发明可以降低传统微生物所需要环境条件的苛刻性，同时降低了生成成本，有利于玉米秸秆的高值化利用，具有广泛的工业化前景和市场价值。

Description

一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及土壤修复技术领域，具体涉及一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂及其制备方法。

背景技术

矿山开采、冶炼和加工过程已导致不少重金属如铅、汞、镉等进入大气、水、土壤，引起严重的环境污染。重金属具有富集性，很难在环境中降解，并且可能通过食物链产生浓缩，从而造成公害。镉、铅和砷是自然界中毒性较强的金属，镉和砷已确定为致癌物，铅为可能致癌物。2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示，全国土壤环境状况总体不容乐观，部分地区土壤污染较重，耕地土壤环境质量堪忧，工矿业废弃地土壤环境问题突出。从污染物超标情况看，无机型为主，其中镉、砷、铅、锌4种无机污染物点位超标率分别为7.0％、2.7％、1.5％、1.1％。因此，寻找一种有效的材料实现对铅、镉、砷三种重金属的高校去除是一项非常有必要的工作。

生物炭逐渐被认为是一种新型、绿色、经济、高效的环境功能材料，已引起研究者的广泛兴趣。生物炭不仅可以控制土壤中重金属的行为和生物利用度，还可以通过调节土壤的理化性质、添加氮、磷、钾等养分以及提高持水能力来改善土壤健康。此外，制备生物炭的原料种类繁多，成本相对低廉，适合大规模生产。但生物炭去除重金属的能力受原料和制备条件的影响较大，对严重污染土壤的修复能力有限，对污染物的吸附选择性不足，而且粉末状生物炭很难从反应体系中分离出来。由于生物炭表面的净负电荷占优势，生物炭对阴离子As的吸附能力有限。为了克服上述这些不利因素，通常需要一个额外的活化或改性过程，使其对污染物具有较高的去除效率。

现有的大部分生物炭负载微生物菌剂如分支杆菌、绿针假单胞菌、芽孢杆菌等可以提高对重金属的钝化效率或者石油污染的去除效率，绿色高效，制备方法简单方便，成本低廉；但同时，当前的改性生物材料大多数是应用于水中污染物的吸附或者土壤中单一重金属，对复合污染的土壤，尤其是三种及以上重金属复合污染的共同去除的研究较少，例如铅、镉、砷重金属复合污染土壤的修复。

因此，本申请亟待提供一种铅、镉、砷重金属复合污染土壤修复剂，采用生物炭负载相互协同作用的四株微生物菌剂，并能够有效地应用于复合重金属污染土壤的修复。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种可以同时高效去除土壤中阴离子和阳离子重金属，铅、镉、砷生物炭负载微生物材料的土壤修复剂，筛选具有特定效果的混合菌剂微生物，生物炭不单单起到载体以及保护微生物的作用，微生物还可以利用生物炭中不溶性磷化合物，使其转化为PO₄ ^3-从而与Pb反应生成沉淀。

本发明的第二个目的在于，提供上述生物炭负载微生物材料土壤修复剂的制备方法。

为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂，所述修复剂包括海藻酸钙、生物炭和混合菌剂，所述海藻酸钙将生物炭与混合菌剂包埋于小球内，所述混合菌剂包括淀粉芽孢杆菌HN2、蜡样芽胞杆菌GS6、芽孢杆菌HN8和芽孢杆菌HN11，所述生物炭与混合菌剂的干重比为20-80：1。

作为一个优选方案，所述生物炭与混合菌剂的干重比为40：1。

作为一个优选方案，所述混合菌剂中各菌的体积比为HN8:HN11:GS6:HN2＝2:2:3:1，菌体浓度均为8×10⁸cfu/mL。

作为一个优选方案，所述小球的粒径为2-5mm。

作为一个优选方案，所述生物炭为玉米秸秆生物炭。

为了实现上述第二个目的，本发明提供了一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备生物炭载体：将生物质原材料在70-90℃下干燥36-60h，粉碎后过1-20目筛，然后在惰性气体保护下以500℃限氧条件下热解1-3h，最后冷却得到所述生物炭载体；

(2)制备混合菌剂：将淀粉芽孢杆菌HN2、蜡样芽胞杆菌GS6、芽孢杆菌HN8和芽孢杆菌HN11四株溶液分别接种于旋转恒温瓶培养基中，35-37℃下晃动，活化菌种，用0.85％的无菌生理盐水将其洗涤2-5次，再将四个细菌细胞悬液混合得混合菌剂；

(3)制备修复剂小球：将步骤(1)获得的生物炭载体与步骤(2)获得的混合菌剂以20-80：1的干重比混合，然后将混合物与相同体积的海藻酸钠溶液混合，随后用5毫升注射器将所得胶体溶液缓慢加入2％的CaCl₂溶液中，静置，用0.85％的无菌盐水清洗小球，使用真空冷冻干燥机冷冻，得生物炭负载混合菌剂修复剂。

本发明的生物炭负载微生物材料土壤修复剂，具有有效修复土壤中复合重金属污染的优势，生物炭作为载体可以有效防御外界环境毒害，在实际的重金属复合污染场地土壤修复过程中具有重大意义。所述生物炭负载微生物材料土壤修复剂主要包括生物炭负载四株功能菌株：解淀粉芽孢杆菌HN2(Genbank:OK563048)，蜡样芽胞杆菌(Genbank:OK563049)GS6，芽孢杆菌HN8(Genbank:OK563050)和芽孢杆菌HN11(Genbank:OK667798)。As(III)被砷氧化菌氧化成As(V)，通过砷和OHs之间的离子交换和键合形成化学络合物；细菌呼吸产生的CO₃ ^2-和解磷菌释放的PO₄ ^3-可以参与Pb的稳定沉降；此外，生物炭为混合细菌的生长提供了庇护和营养，因此为重金属离子的生物吸附提供了额外的功能位点，如胺基、羟基和羧酸基。改性后的材料修复土壤中铅、镉、砷的浸出毒性远低于原始材料，进而取得长期钝化效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明在材料制备过程中提出一种新的改性思路，生物炭不单单起到载体以及保护微生物的作用，微生物可以利用生物炭中不溶性磷化合物，使其转化为PO₄ ^3-从而与Pb反应生成沉淀。

(2)本发明所制备的生物炭负载微生物，对于阴离子金属砷和阳离子金属铅和镉具有同时去除的能力，弥补了实际土壤修复过程使用一种修复药剂难以得到同时高效去除的难题，实现了土壤中砷，铅和镉污染同时修复的目的。

附图说明

图1是生物炭负载为生物材料所含菌株之间的拮抗实验照片。

图2是微生物菌剂不同混合比例在复合污染中去除三种重金属的效果图。

图3为微生物附着在生物炭表面及孔径的扫描电镜图。

图4为生物炭负载微生物材料(BCB)在复合污染中去除三种重金属的效果图。

图5为生物炭微生物材料吸附后的XRD。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

本申请先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1.混合菌剂的定性筛选

(1)培养基的准备

LB固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，115℃灭菌20min。

LB液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，115℃灭菌20min。

NBRIP溶磷固体培养基：葡萄糖10g，磷酸钙5g，硫酸铵0.1g，氯化钾0.2g，七水氯化镁0.25g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.0，115℃高压灭菌30min。

NBRIP溶磷液体培养基：葡萄糖10g，磷酸钙5g，硫酸铵0.1g，氯化钾0.2g，七水氯化镁0.25g，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.0，115℃高压灭菌30min。

无机盐液体培养基：磷酸氢二钠0.6g，磷酸二氢钾0.2g，硝酸钠4g，氯化钙0.01g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.3g，酵母粉0.5g，pH＝7.2，115℃灭菌20min。其中氯化钙，硫酸镁单独灭菌；硫酸亚铁无菌滤头过滤。

无机盐固体培养基：磷酸氢二钠0.6g，磷酸二氢钾0.2g，硝酸钠4g，氯化钙0.01g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.3g，酵母粉0.5g，琼脂18g，pH＝7.2，115℃灭菌20min。其中氯化钙，硫酸镁单独灭菌；硫酸亚铁无菌滤头过滤。

(2)菌株的筛选

从中国甘肃省白银废弃的铅锌冶炼厂收集的土壤样品中分离出As(III)-氧化细菌。于250mL锥形瓶中配置100mL的LB培养基。121℃下灭菌20min后，再加入经0.22μm滤膜过滤的亚砷酸钠溶液使其终浓度分别为200mg/L,500mg/L,1000mg/L。分别于称量天平上称取1.0g土壤样品，用量筒量取99mL无菌水，置于250mL三角瓶内，用玻璃棒搅拌均匀，于37℃、200rpm条件下在震荡培养器上震荡30min。静置后取上清液，将上清液经过中速定量滤纸(60μm)，将细菌与土壤分离。取5mL甘肃土壤上清液于亚砷酸钠浓度为200mg/L的三个液体LB培养基中，富集培养48h待菌液出现浑浊，按10％体积比转入浓度更高的培养基中。取驯化后的土壤上清液，采用梯度稀释法稀释至10^-4、10^-5等若干个浓度梯度。在固体LB平板中均匀涂布100μL样品稀释液，置于37℃恒温培养箱中培养。挑取单菌落稀释划线纯化菌种。吸取500μL 50％的甘油以及500μL的菌液于1mL EP管置于4℃冰箱中低温保存。将分离纯化后的菌株在含NaAsO₂的平板培养基上划线培养待菌落长出(需3-4天)，用1.5mL 2％的AgNO₃溶液漫过培养平板静置两小时以上，如培养基中菌落边缘变褐色或褐红色，则可初步断定为砷氧化菌。

从中国湖南省衡阳市废弃铅锌冶炼厂收集的土壤样品中分离出溶磷菌。称取1g土样溶于99mL无菌水中，震荡30min后，取上清液按10倍稀释法稀释样品，每个浓度取0.1mL分别涂布到NBRIP固体培养基上，37℃下培养5d。观察生长情况，记录出现透明圈的菌落，再挑取有明显透明圈的菌落，选择其中具有最大清晰透明圈的菌株，进一步通过划线法纯化，直至得到纯菌株后，菌液加等量50％甘油置于4℃冰箱保存。

另一种菌株也分离自中国湖南省衡阳市的土壤。1g场地土壤溶于99Ml无菌水中转移到250mL三角瓶中，置于摇床中37℃，200r·min震荡30min，静置10min，得到土壤悬浊液。取0.2mL土壤悬浊液用无菌水进行逐级稀释直至至10^-4、10^-5等若干个浓度梯度。取100μL上述稀释液分别均匀涂布于含有As、Pb、Cd溶液的无机盐固体培养基中。将培养皿倒置30℃恒温培养1～2天，取不同类型的典型单菌落，经3次以上平板划线纯化后，菌液加等量50％甘油4℃保存于冰箱中中待用。

(3)菌株的鉴定

将筛选得到的目标功能菌株进行PCR扩增，16S rDNA的引物选择通用引物27F和1492R扩增细菌16S rDNA序列，产物在1500bp左右。

正向引物：27F 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物：1492R 5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3’(SEQ ID NO.2)。

50μL PCR反应体系。以稀释后的单菌落为模板，PCR反应体系如下：KOD OneMaster Mix 25μL，引物27F 1.5μL，引物1492R 1.5μL，DNA模板1μL，ddH2O 22μL，总体积50μL。

PCR反应条件如下：98℃10s；52℃5s；68℃20s；共30cycles。

反应完毕后，取3μL反应液对PCR扩增产物进行测序，测序结果与NCBI比对。据此确认并将其分别命名为解淀粉芽孢杆菌HN2(Genbank:OK563048)、蜡样芽胞杆菌GS6(Genbank:OK563049)、芽孢杆菌HN8(Genbank:OK563050)、芽孢杆菌HN11(Genbank:OK667798)。

(4)菌株的拮抗性实验

过夜活化实验例1中保存的菌株，将解淀粉芽孢杆菌HN2、蜡样芽胞杆菌GS6、芽孢杆菌HN8、芽孢杆菌HN11活化后接种到装有50mL的LB液体培养基的三角瓶中，置于37℃，200r·min摇床培养12h制得对应培养液。于无菌操作间两两相交划线于3个LB固体培养基中，把上述培养皿放置到37℃的培养箱内，每隔12h观察菌株生长情况并记录结点是否出现抑菌圈。

实验结果表明：功能菌株解淀粉芽孢杆菌HN2、蜡样芽胞杆菌GS6、芽孢杆菌HN8、芽孢杆菌HN11两两之间均不存在相互抑制的现象，如图1所示。

实施例2.生物炭负载微生物材料土壤修复剂的制备

制备方案一

步骤一:将生物质原材料玉米秸秆洗净，70℃干燥60h，粉碎后过10目筛。处理后的玉米秸秆原材料放入管式炉，在氮气保护下隔绝氧气，设置升温程序15℃/min升温至500℃，限氧条件500℃下热解3h，最后冷却得到生物炭。

步骤二:将上述所得生物炭研磨，过60目筛，备用。

步骤三:将将四株菌株溶液分别接种于旋转恒温瓶培养基中，在35℃下晃动24小时，活化菌种。接着用0.85％的无菌生理盐水将其洗涤2次，每次15分钟。再将四个细菌细胞悬液混合在一起。

步骤四:将生物炭与细菌悬浮液以20:1的干重比混合2小时，然后将混合物与海藻酸钠溶液以生物炭细菌混合液相同体积混合。之后，用5毫升注射器将细菌和生物炭混合物的胶体溶液缓慢加入2％的CaCl₂溶液中。在4℃下放置10小时后，用0.85％的无菌盐水清洗含有生物炭和细菌的小球，使用真空冷冻干燥机冷冻2h，得生物炭负载微生物修复剂。

制备方案二

步骤一:将生物质原材料玉米秸秆洗净，80℃干燥48h，粉碎后过10目筛。处理后的玉米秸秆原材料放入管式炉，在氮气保护下隔绝氧气，设置升温程序15℃/min升温至500℃，限氧条件500℃下热解2h，最后冷却得到生物炭。

步骤二:将上述所得生物炭研磨，过60目筛，备用。

步骤三:将将四株菌株溶液分别接种于旋转恒温瓶培养基中，在37℃下晃动24小时，活化菌种。接着用0.85％的无菌生理盐水将其洗涤3次，每次15分钟。再将四个细菌细胞悬液混合在一起。

步骤四:将生物炭与细菌悬浮液以40:1的干重比混合2小时，然后将混合物与海藻酸钠溶液以生物炭细菌混合液相同体积混合。之后，用5毫升注射器将细菌和生物炭混合物的胶体溶液缓慢加入2％的CaCl₂溶液中。在4℃下放置12小时后，用0.85％的无菌盐水清洗含有生物炭和细菌的小球，使用真空冷冻干燥机冷冻2h，得生物炭负载微生物修复剂。

制备方案三

步骤一:将生物质原材料玉米秸秆洗净，90℃干燥36h，粉碎后过10目筛。处理后的玉米秸秆原材料放入管式炉，在氮气保护下隔绝氧气，设置升温程序15℃/min升温至500℃，限氧条件500℃下热解1h，最后冷却得到生物炭。

步骤二:将上述所得生物炭研磨，过60目筛，备用。

步骤三:将四株菌株溶液分别接种于旋转恒温瓶培养基中，在36℃下晃动24小时，活化菌种。接着用0.85％的无菌生理盐水将其洗涤5次，每次15分钟。再将四个细菌细胞悬液混合在一起。

步骤四:将生物炭与细菌悬浮液以80:1的干重比混合2小时，然后将混合物与海藻酸钠溶液以生物炭细菌混合液相同体积混合。之后，用5毫升注射器将细菌和生物炭混合物的胶体溶液缓慢加入2％的CaCl₂溶液中。在4℃下放置12小时后，用0.85％的无菌盐水清洗含有生物炭和细菌的小球，使用真空冷冻干燥机冷冻2h，得生物炭负载微生物修复剂。

请参阅图3，为生物炭与细菌悬浮液以40：1的干重比后的材料电镜图。图3中放大5K下观察到生物炭孔径以及表面有芽孢杆菌的存在，说明芽孢杆菌成功负载在生物炭上，创造了更多的吸附位点，更加利于对三种重金属的吸附。

实施例3.不同比例混合菌群对土壤中重金属去除性能测定

过夜活化实施例1中保存的菌株，将解淀粉芽孢杆菌HN2、蜡样芽胞杆菌GS6、芽孢杆菌HN8、芽孢杆菌HN11活化后接种到装有50mL的LB液体培养基的三角瓶中，置于37℃，200r·min摇床培养12h制得对应培养液。用0.85％无菌生理盐水洗涤细胞，悬浮于同一培养液中，细菌浓度约为8×10⁸cfu/mL。设计了一个混合菌群构建比例实验，如表1所示。

表1.微生物菌剂不同混合比例

测定不同比例混合菌群对铅、镉、砷三种重金属复合污染土壤中重金属铅(Pb)、重金属镉(Cd)和重金属(As)的去除性能测定，方法如下：

步骤一：实验中，准确称取2.00g的铅、镉、砷复合染毒土壤，转移至50mL离心管中，转移时避免沾壁，加入1mL菌液于离心管中，另准备一个不加材料的土样作为对照。

步骤二：在旋涡混合器上充分混合，加入10mL去离子水，再次混合均匀，置于恒温振荡箱中反应2h，温度设置为37℃，转速200rpm。

步骤三：提取结束后，以4000rpm转速离心5min，上清液过0.45μm滤膜，用原子荧光分光光度法对Pb浓度进行测定，计算重金属Pb的去除率；用原子荧光分光光度法对Cd浓度进行测定，计算重金属Cd的去除率；用原子荧光分光光度法对As浓度进行测定，计算重金属As的去除率。

本实施例中重金属去除率以不加材料的土样中的重金属含量为基础计算。

图2为单独微生物菌落及其不同混合比例对复合污染土壤中三种重金属的去除效果图。从图2中可以看出，综合三种金属吸附量最适的比例为MB5，即HN8:HN11:GS6:HN2＝2:2:3:1，简称M。

实施例4.生物炭负载微生物材料土壤修复剂的应用试验

采用实施例2制备方案二得到的生物炭负载微生物材料土壤修复剂(BCB)，混合菌剂优选HN8:HN11:GS6:HN2＝2:2:3:1，对铅、镉、砷三种重金属复合污染土壤中重金属铅(Pb)、重金属镉(Cd)和重金属(As)的去除性能测定，方法如下：

步骤一：实验中，准确称取2.00g的铅、镉、砷复合染毒土壤，转移至50mL离心管中，转移时避免沾壁，加入0.06g改性材料于离心管中，另准备一个未改性的生物炭材料,单独微生物材料和不加材料的土样作为对照。

步骤二：在旋涡混合器上充分混合，加入10mL去离子水，再次混合均匀，置于恒温振荡箱中反应2h，温度设置为37℃，转速200rpm。

步骤三：提取结束后，以4000rpm转速离心5min，上清液过0.45μm滤膜，用原子荧光分光光度法对Pb浓度进行测定，计算重金属Pb的去除率；用原子荧光分光光度法对Cd浓度进行测定，计算重金属Cd的去除率；用原子荧光分光光度法对As浓度进行测定，计算重金属As的去除率。

本实施例中重金属去除率以不加材料的土样中的重金属含量为基础计算。

对比例1

将未改性玉米秸秆生物炭作为对比例1。

图4为原始生物炭(BC)，微生物菌剂(M)和生物炭负载微生物材料(BCB)对复合污染土壤中三种重金属的去除效果图。从图4中可以看出，本申请的生物炭负载微生物材料在对复合污染土壤中铅、镉、砷的去除率分别为60.34％、64.74％和36.63％。

实验结果证明，使用本申请的生物炭负载微生物材料，不仅可以有效地保护微生物免受外界的有毒物质的损伤，还可以实现不同重金属复合污染水平土壤中重金属复合的高效去除，达到土壤修复目的。同时发现复合污染土壤经生物炭负载微生物材料修复后，chao1和Shannon指数显著升高，细菌群落的多样性得到恢复。BCB处理组的Alpha多样性指数大于BC处理组，证明生物炭负载微生物材料能有效恢复土壤酶活。本法可解决实际土壤修复工程中面临的复合重金属难以去除的技术问题。

实施例5.生物炭与微生物之间的协同作用

将反应后的生物炭与微生物材料从复合污染土壤中收集出来，使用真空冷冻干燥机冷冻2h，得到吸附铅镉砷后的生物炭负载微生物菌剂。X射线衍射(XRD，RIGKU 18KW/D/max2550VB/PC，日本)用于观察吸附前后2θ范围内的矿物相组成。

图5为生物炭负载微生物BCB吸附前后的XRD变化图。

从图5可以看出微生物与生物炭之间存在相互作用，吸附后的生物炭上出现了铅磷化合物Pb₅(PO₄)₃OH，说明微生物释放磷酸酶，有效利用了生物炭上的不溶性磷化合物，使生物炭释放出磷酸根离子，从而磷酸根离子与铅离子发生共沉淀，降低了铅的生物可利用性。并且阴阳离子络合也有助于去除砷和镉离子，例如PbAs₂O₆和Cd₃(AsO₄)₂的形成。

综上，本申请通过生物炭负载微生物材料，有效地降低Pb、Cd、As的生物利用率。此外，生物炭负载微生物材料能显著提高污染土壤的酶活性。与单独处理生物炭相比，生物炭负载微生物材料接种剂对重金属的稳定性和改善土壤环境质量的效果都优于单独处理生物，支持了生物炭的经济效益。功能微生物与生物炭复合修复技术是一种有前途的绿色、可持续的污染土壤修复技术。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂及其制备方法

<130> /

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (6)

1.一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂，其特征在于，所述修复剂包括海藻酸钙、生物炭和混合菌剂，所述海藻酸钙将生物炭与混合菌剂包埋于小球内，所述混合菌剂包括淀粉芽孢杆菌HN2、蜡样芽胞杆菌GS6、芽孢杆菌HN8和芽孢杆菌HN11，所述生物炭与混合菌剂的干重比为20-80：1。

2.根据权利要求1所述的一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂，其特征在于，所述生物炭与混合菌剂的干重比为40：1。

3.根据权利要求1所述的一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂，其特征在于，所述混合菌剂中各菌的体积比为HN8:HN11:GS6:HN2＝2:2:3:1，菌体浓度均为8×10⁸cfu/mL。

4.根据权利要求1所述的一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂，其特征在于，所述小球的粒径为2-5mm。

5.根据权利要求1所述的一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂，其特征在于，所述生物炭为玉米秸秆生物炭。

6.权利要求1所述一种生物炭负载微生物材料土壤修复剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备生物炭载体：将生物质原材料在70-90℃下干燥36-60h，粉碎后过1-20目筛，然后在惰性气体保护下以500℃限氧条件下热解1-3h，最后冷却得到所述生物炭载体；

(2)制备混合菌剂：将淀粉芽孢杆菌HN2、蜡样芽胞杆菌GS6、芽孢杆菌HN8和芽孢杆菌HN11四株溶液分别接种于旋转恒温瓶培养基中，35-37℃下晃动，活化菌种，用0.85％的无菌生理盐水将其洗涤2-5次，再将四个细菌细胞悬液混合得混合菌剂；

(3)制备修复剂小球：将步骤(1)获得的生物炭载体与步骤(2)获得的混合菌剂以20-80：1的干重比混合，然后将混合物与相同体积的海藻酸钠溶液混合，随后用5毫升注射器将所得胶体溶液缓慢加入2％的CaCl₂溶液中，静置，用0.85％的无菌盐水清洗小球，使用真空冷冻干燥机冷冻，得生物炭负载混合菌剂修复剂。

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