CN110484475B - 一株好热黄无氧芽孢菌及其应用 - Google Patents

一株好热黄无氧芽孢菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株好热黄厌氧芽孢杆菌及其应用，所述菌株为好热黄无氧芽孢菌（Anoxybacillus flavithermus）Fzu200，于2018年12月24日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为：CGMCC No.17024，该菌株能在高温下对于重金属镍离子进行吸附并固定，能够用于高温工厂废水和高温矿山废水中重金属镍的回收。该方法相比较于传统重金属处理方法二次污染小，成本低，回收率高。

Description

一株好热黄无氧芽孢菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株好热黄无氧芽孢菌及其应用。
背景技术
随着社会经济的发展，人类社会对于金属的需求也急剧上升，由此产生的重金属（如汞（水银）、镍、镉、铅以及铬等）废弃物也越来越多。在重金属开采过程中产生的废渣、废水也是迫切需要解决的一个大问题。在矿山开采的过程中一些含重金属的矿物容易通过降水等方式进入水体与土壤，后在微生物等生物活动下释放出重金属离子进入环境。而一些小型工厂（金属冶炼厂和制造厂等）由于贪图经济利益，废水不加以处理，直接排入地表河流中，进而进入地下水，污染水源。党的十八届五中全会提出将绿色发展作为五大理念之一，贯穿在国民经济和社会发展中。强调了以重金属污染物为代表的有毒有害污染物的排放控制与环境介质含量达标是环境质量改善的重要组成部分。由于在自然环境中难以实现对重金属的自我净化和固定，重金属会随着大气、水体、土壤等介质进行转移，对人体健康和生态环境造成损害。
金属镍由于具有较好的延展性和铁磁性所以在电子、机械、材料、军用、航天等领域都有较广的用途。而镍在地球中的含量为第5位，据估计每年含镍矿石的开采量为5.6×108kg，大量的开采和运用使得金属镍进入环境的量逐年增加，据估计每年释放到环境中的金属镍约有3.8×108kg。在自然界中，镍有-1、+1、+2、+3 和+4 价五个价态，其中以+2价最为稳定。而镍污染主要是指由Ni(II)及镍的化合物所引起的污染。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，镍化合物被列为一类致癌物。长期接触高浓度镍离子及其化合物会引发皮炎、过敏等，并可能最终导致生殖毒性和呼吸道癌病发。我国规定地面水中镍离子的最高容许浓度不超过0.5 mg/L。然而矿石的不断开采以及污染物的排放，使得环境中的镍离子浓度远高于标准。镍污染的治理以及资源化的利用已经成为亟待解决的问题。
而目前运用比较多的处理重金属污染的方法是化学沉淀法（浓度高于100mg/L），通过添加某些化学物质，使溶液中的毒性金属离子与其发生化学反应，并转变为不溶或者难溶的化合物，并利用过滤或离心等方法使含毒性金属难溶化合物从水溶液中分离。此外对于低浓度的重金属污染处理常用的是吸附法（浓度低于100mg/L），利用吸附剂的活性基团（如羟基、羧基、氨基、巯基等）与金属离子形成离子键或共价键而将毒性金属离子吸附在吸附剂的表面，后用脱附剂将金属离子洗脱，从而实现将毒性金属离子从水体中去除的一种方法。
综上所述，目前处理重金属污染的主要是化学法与物理法，而这些方法无疑都存在一些共同的问题，如容易对环境造成二次污染，处理成本较高，提取率低。近年来，利用微生物吸附重金属或将其转化为低毒性形式的治理已经成为研究的热点之一。该方法具有处理成本低、基础建设投资少、效率高且不会对环境造成二次污染等优点。经过查阅相关的文献，发现近年来国内外学者对于利用微生物处理重金属的已有基础性的研究，对于微生物与重金属的相互作用的机理已经微生物成矿已经有了一部分的研究。但是对于一些极端微生物如高温菌用于处理含重金属废水的研究还比较少，而将其进行工程应用的更是少之又少。
发明内容
本发明的目的在于鉴于处理含重金属废水的传统方法容易对环境造成二次污染，且处理成本较高，提取率低的缺陷，而回收重金属又具有巨大的经济利用价值的问题，本发明提供一种好热黄无氧芽孢菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株好热黄无氧芽孢菌，于2018年12月24日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，菌种分类命名为：好热黄无氧芽孢菌（Anoxybacillus flavithermus）Fzu200，保藏号为：CGMCC No.17024，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
上述一种好热黄无氧芽孢杆菌应用于高温条件下对重金属镍离子的吸附。
一种好热黄无氧芽孢杆菌应用于高温条件下对重金属镍离子的吸附，具体包括以下步骤：
（1）菌种培养：按3wt%的接种量将好热黄无氧芽孢菌种子液接种至LB培养基中，60°C活化24小时，备用；
（2）重金属Ni2+母液的准备：用超纯水配制浓度为1000mg/L重金属镍离子Ni2+母液，用1mol/L的盐酸调节pH为6，121°C高温灭菌20min备用；
（3）重金属Ni2+的吸附：将经过活化的菌液离心去除培养基，再用灭菌生理盐水清洗3次，后加入重金属Ni2+母液，稀释到镍离子Ni2+浓度为50-200mg/L，菌体浓度为OD600=0.5，在60℃条件下，经过72小时后，吸附达到平衡；
（4）形成的产物进行物相分析。
上述，步骤（1）中好热黄无氧芽孢菌种子液的制备为：分离得到的好热无氧芽孢杆菌单菌落,用无菌牙签挑至LB培养基中60°C静置培养24小时，将菌液与50%甘油1:1混合至无菌离心管中，制成种子液，-20°C保藏。
上述步骤（4）中，吸附达到平衡后，采用溶菌酶和胰蛋白酶（溶菌酶和蛋白酶的浓度各为5ug/mL）45°C处理1h，去除菌体和蛋白等有机物，后对好热黄无氧芽孢菌与镍作用的物相进行分析。
进一步的，好热黄无氧芽孢菌在72小时内吸附50-200mg/L的Ni2+，吸附效率为30%-75%。
一株好热黄无氧芽孢菌应用于高温工厂废水和高温矿山废水中重金属镍离子的吸附回收。
本发明的工作原理如下：通过模拟含镍重金属废水研究好热黄无氧芽孢菌对10-200mg/L Ni2+的吸附作用，再根据研究结果，为利用好热黄无氧芽孢杆菌处理工业废水提供理论依据，进而实现工程应用。
本发明的优点在于：
本发明提供了一株能够应用于废水中重金属吸附的新的微生物菌种好热黄无氧芽孢杆菌。该菌株能有效吸附废水中重金属，实现对重金属离子的回收，该方法相比于传统重金属回收方法不仅二次污染小，而且成本低，回收率高。
附图说明
图1为好热黄无氧芽孢菌菌落形态。
图2为为好热黄无氧芽孢菌生长曲线。
图3为好热黄无氧芽孢菌的系统发育树。
图4为好热黄无氧芽孢菌扫描电镜照片。
图5为好热黄无氧芽孢菌在不同温度条件下的OD值。
图6为好热黄无氧芽孢菌在不同pH条件下的OD值。
图7为好热黄无氧芽孢菌对镍离子的耐受性。
图8为好热黄无氧芽孢菌与镍离子反应后的物相分析。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1：好热黄无氧芽孢菌分离、培养及生长
准备无菌水30mL(将去离子水置于高温灭菌锅中 121°C灭菌21min），将采集的温泉水土混合样（采样地点为福建省福州市连江县贵安村、采样时间为2018年3月24日）倒入无菌水中，后摇晃混合取上清液于LB液体培养基中（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L），置于60°C培养，待液体培养基浑浊后，取100uL悬浊液（稀释不同浓度梯度）涂于LB固体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L ，琼脂粉20g/L）中，置于60°C培养，待固体培养基中长出单菌落，挑取单菌落进行划线分离，获得好热黄无氧芽孢菌纯培养物，测定纯好热黄无氧芽孢菌培养物的的生长曲线，并对好热黄无氧芽孢菌纯培养物进行鉴定。
好热黄无氧芽孢菌的生长曲线的测定为：按3wt%的接种量将好热黄无氧芽孢菌种子液接种至LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L pH=7）中，60°C条件下静置培养，测定菌体浓度。
好热黄无氧芽孢菌种子液的制备方法为：分离得到的好热无氧芽孢杆菌单菌落，用无菌牙签挑至LB培养基中60°C静置培养24小时，将菌液与50%甘油1:1混合至无菌离心管中，制成种子液，-20°C保藏。
分离所得好热黄无氧芽孢菌纯培养物的菌落形态见图1，图1结果表明：该菌菌落呈圆形、黄色、表明光滑。分离所得好热黄无氧芽孢菌纯培养物的生长曲线见图2，图2结果表明：该菌在150小时后生长达到平稳期，在250小时以后生长达到衰亡期。
实施例2：好热黄无氧芽孢菌的鉴定及形态观察
实验细菌基因组DNA提取试剂盒提取实施例1分离获得好热黄无氧芽孢菌的基因组，采用细菌16S rRNA基因的通用引物27F：5’-AGAGMTGATCATGGCTCAG -3’和1492R：5’-GGGYTACCTTGTTACGACTT-3’，以好热黄无氧芽孢菌的基因组DNA为模板PCR扩增该菌株的16SrRNA基因。PCR反应条件为：95°C 5min；95°C 30s，55°C 30s，72°C 90s，循环30次；72°C10min。PCR产物经过1％琼脂糖电泳后切胶回收，进行序列测定。测序所得该好热黄无氧芽孢菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
系统发育树的构建及分析：将好热黄无氧芽孢菌菌株的16S rRNA 基因序列在网站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中与模式菌株的16S rRNA基因序列进行同源性比较。通过软件ClustalX将菌株的16S rRNA序列与亲缘关系较近Anoxybacillus属的菌株进行多重序列比对，并使用MEGA 5.0软件构建邻接法系统进化树见图3。从图3可以得好热黄无氧芽孢菌属于芽孢杆菌属，且与厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus mongoliensis)具有较高的同源性（同源性达到97.63%）。
菌株形态观察：将培养好的菌液离心，洗涤后收集菌体，然后加入2.5vol%戊二醛固定液【用0.2mol/L磷酸缓冲液（pH=6.8）配制】，使缓冲液浸没样品，放4°C冰箱中进行固定。然后用磷酸缓冲液冲洗样品，将冲洗好的样品依次置于浓度为30vol%、40 vol %、50vol %、60 vol %、70 vol %、80 vol %、90 vol %、100 vol %的乙醇进行脱水，脱水时间为10min，脱水完毕后，将准备好的样品置于真空干燥箱中常温干燥24h，干燥好后的样品通过扫描电镜进行观察。好热黄无氧芽孢菌扫描电镜照片见图4，从图4看出：好热黄无氧芽孢菌为棒状，长度大约在3-6um，宽度大约在1um。
实施例3：好热黄无氧芽孢菌生长的最适温度及pH
将好热黄无氧芽孢菌接种至LB培养基中，60℃，培养至OD600=0.1获得种子液，种子液按3wt%接种量接种于不同pH(pH=4、5、6、7、8、9、10）的LB培养基中，后置于不同温度条件下静置培养（T=55、60、65、70、75°C），在培养12小时后观察好热黄无氧芽孢菌的生长情况好热黄无氧芽孢菌在不同温度和pH条件下的OD值分别见图5、6。从图5可知好热黄无氧芽孢菌的存活pH为5-9，在中性偏酸性条件（6-7）下生长的最好。从图6可知，好热黄无氧芽孢菌可耐受的最高温度为65°C，在60°C条件下生长最好。
实施例4：好热黄无氧芽孢菌对不同镍离子浓度的耐受性
将好热黄无氧芽孢菌种子液按3wt%接种量接种于准备的30mL的LB培养基中（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH=6），后加入含镍离子的溶液，使培养基中镍离子的最终浓度为25、50、100、200、300mg/L，后置于生化反应器中，60°C条件下静置培养。好热黄无氧芽孢菌对镍离子的耐受性见图7，从图7可知：好热黄无氧芽孢菌对100mg/L浓度以下的镍离子有着较好的耐受性。
实施例5：好热黄无氧芽孢菌对镍的吸附能力
将好热黄无氧芽孢菌种子液按3%接种量接种于准备的30mL的LB培养基中（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH=6）置于生化反应器中（60°C，静置培养），24小时后，8000g离心收集菌体，用生理盐水洗涤3次，后接入Ni2+母液（1000mg/L），稀释使Ni2+的终浓度分别为50、100、200mg/L，使菌体浓度为OD600=0.5，60°C下培养72小时后，测定溶液中的Ni2+浓度。结果如表1所示。结果表明好热黄无氧芽孢菌在60°C条件下，对50、100mg/L的Ni2+有着较好的吸附，而在200mg/L条件下，基本不吸附。
表1 好热黄无氧芽孢菌对镍的吸附能力
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例6：好热黄无氧芽孢菌与镍反应后产物物相分析
将好热黄无氧芽孢菌种子液按3%接种量接种于准备的30mL的LB培养基中（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH=6）置于生化反应器中（60°C，静置培养），24小时后，8000g离心收集菌体，用生理盐水洗涤3次，后接入Ni2+母液（1000mg/L），稀释使Ni2+的终浓度分别为100mg/L，使菌体浓度为OD600=0.5，60°C下培养1、5、7、30天后，采用溶菌酶和胰蛋白酶（溶菌酶和蛋白酶的浓度各为5ug/mL）45°C处理反应产物1h，去除菌体和蛋白等有机物，后对好热黄无氧芽孢菌与镍作用的物相进行分析。图8为好热黄无氧芽孢菌与金属镍离子反应后的XRD图谱。从图8可知好热黄无氧芽孢菌与金属镍离子反应后，产物的物相为无定型的，说明金属镍离子只是单纯的吸附在好热黄无氧芽孢菌表面，并没有形成矿物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一株好热黄无氧芽孢菌及其应用
<130> 3
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<213> 27F
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<213> SEQ ID NO.1
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cggacgaatc aaaagcttgc ttttgattcg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg 60
caacctgccc tgtagacggg gataacaccg agaaatcggt gctaataccg gataacacga 120
aatgtcgcat gacgtttcgt tgaaagacgg cgcaagctgt cgctacagga tgggcccgcg 180
gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga 240
gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 300
agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag cgaagaaggc 360
cttcgggtcg taaagctctg ttgttaggga agaacaagta gcgtagtaac tggcgttact 420
ttgacggtac ctaacgagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 480
aggtggcaag cgttgtccgg aattattttc ccccttcggg gggacagggt gacaggtggt 540
gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 600
cctcgacctt agttgccagc gagtcaagtc gggcactcta aggtgactgc cggctaaaag 660
tcggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 720
tgctacaatg ggcggtacaa agggttgcga acccgcgagg gggagccaat cccaaaaagc 780
cgctctcagt tcggattgca ggctgcaact cgcctgcatg aagccggaat cgctagtaat 840
cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 900
cacgagagtt tgcaacaccc gaagtcggtg aggtaaccct tac 943

Claims (7)

1.一株好热黄无氧芽孢菌，其特征在于：所述好热黄无氧芽孢菌（Anoxybacillus flavithermus） Fzu200，于2018年12月24日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为：CGMCC No.17024。
2.如权利要求1所述的一株好热黄无氧芽孢菌应用于55-65℃条件下对重金属镍离子的吸附。
3.根据权利要求2所述的一株好热黄无氧芽孢菌应用于55-65℃条件下对重金属镍离子的吸附，其特征在于，包括以下具体步骤：
（1）菌种的培养：按3wt%的接种量将好热黄无氧芽孢菌种子液接种至LB培养基中，60°C活化24小时，备用；
（2）重金属镍离子母液的准备：用超纯水配制浓度为1000mg/L含重金属镍离子母液，用1mol/L的盐酸调节pH为6，121°C高温灭菌21min备用；
（3）重金属离子的吸附：将步骤（1）活化的菌液离心去除培养基，再用灭菌的生理盐水清洗3次，后加入步骤（2）制备的含镍离子的母液，稀释到镍离子浓度为50-100mg/L，菌体浓度为OD600=0.5，在60°C条件下培养72小时后，吸附达到平衡；
（4）形成的产物进行物相分析。
4.根据权利要求3所述的一株好热黄无氧芽孢菌应用于55-65℃条件下对重金属镍离子的吸附，其特征在于：所述步骤（1）中好热黄无氧芽孢菌种子液的制备为：分离得到的好热无氧芽孢杆菌单菌落，用无菌牙签挑至LB培养基中60°C静置培养24小时，将菌液与50%甘油1:1混合至无菌离心管中，制成种子液，-20°C保藏。
5.根据权利要求3所述的一株好热黄无氧芽孢菌应用于55-65℃条件下对重金属镍离子的吸附，其特征在于：所述步骤（4）中采用浓度为各为5ug/mL溶菌酶和胰蛋白酶45°C处理1h，去除菌体和蛋白有机物，后对好热黄无氧芽孢菌与镍作用的物相进行分析。
6.根据权利要求1所述的一株好热黄无氧芽孢菌，其特征在于：所述的好热黄无氧芽孢杆菌在72小时内吸附浓度为50-100mg/L的Ni2+，吸附效率为30%-75%。
7.根据权利要求1所述的一株好热黄无氧芽孢菌应用于55-65℃工厂废水和矿山废水中重金属镍离子的吸附回收。
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CN109679861B (zh) * 2018-12-06 2020-06-12 浙江工业大学 一株高耐受镍菌株Bacillus sp.Z1A及其应用

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