CN112553107B - 一株厌氧砷氧化、铁氧化脱氮新草螺菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境微生物技术领域，具体公开一株厌氧砷氧化、铁氧化脱氮新草螺菌及其应用，该菌株被命名为脱氮新草螺菌(Noviherbaspirillumdenitrificans)HC18，于2019年12月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M20191117。该菌株可以将砷污染环境的三价砷氧化为五价砷，二价铁氧化为不溶于水的铁氧化物沉淀，同时将砷吸附固定。本发明初步研究表明，本发明的菌株在治理水稻土重金属砷污染方面具有良好的应用前景。

Description

一株厌氧砷氧化、铁氧化脱氮新草螺菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株对As(III)和Fe(II)有厌氧氧化作用的脱氮新草螺菌HC18及其在修复砷污染土壤方面的应用。

背景技术

砷(As)被定义为一种有毒的类金属元素，由于我国南方地区的采矿活动，砷已成为一种重要的土壤污染物。在以水稻为主要作物和当地居民主要食物来源的地区，大米中无机砷的摄入是致癌的重要危险因素。砷的形态和归宿通常由环境中的微生物活动所决定。土壤孔隙水中砷的主要种类是三价砷[As(III)]和五价砷[As(V)]。在自然土壤中，Fe(III)(氢氧化物)氧化物在中性pH环境中强烈吸附As(III)和As(V)，当土壤被淹水时，铁还原菌参与了铁氧化物的还原，从而将砷释放到土壤溶液中，提高了砷生物有效性，所以水稻比其他作物更容易受到砷污染。

针对砷污染，国际国内发明了一些治理方法，目前用于砷污染治理的方法主要有传统的物理化学法和生物修复法，物理化学方法因为费用高，不利于大规模净化和推广。生物修复法是利用生物的代谢机制吸收、沉淀、降解或氧化还原有毒有害物，由于生物修复投资较少，可直接进行原位修复，且不会造成二次污染。因此生物修复法越来越受到各国研究者的重视。在淹水的稻田土壤中，降低砷的有效性的一个主要策略是促进Fe(II)和As(III)的厌氧氧化，形成的铁氧化物可以吸附As(V)从而降低砷的活性。本研究创新点在于分离筛选到一株来源于砷污染水稻土的砷氧化、铁氧化细菌同时可以在厌氧反硝化条件下氧化As(III)和 Fe(II)，形成的铁氧化物吸附As(V)从而降低砷的有效性。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能修复砷污染土壤降低砷毒害的脱氮新草螺菌HC18及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一株脱氮新草螺菌HC18，该菌株分类命名为脱氮新草螺菌(Noviherbaspirillumdenitrificans)HC18，于2019年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO：M20191117。本发明筛选的脱氮新草螺菌HC18为厌氧砷氧化、铁氧化细菌，该菌株可用于污染环境的生物修复。

上述的脱氮新草螺菌HC18在厌氧氧化二价铁和三价砷中的应用。

上述的脱氮新草螺菌HC18在修复砷污染土壤中的应用。优选的，所述的砷污染土壤为砷污染水稻土。

一种修复砷污染土壤的方法，使用由上述脱氮新草螺菌HC18菌株制备的菌剂来处理砷污染土壤。

一种用于修复砷污染土壤的菌剂，该菌剂是由上述脱氮新草螺菌HC18菌株进行培养制备得到的。

研究表明，本发明筛选的脱氮草螺菌HC18菌株可以厌氧氧化二价铁和三价砷，将砷污染环境的三价砷氧化为五价砷，二价铁氧化为不溶于水的铁氧化物沉淀，同时将砷吸附固定。本发明的菌株在治理水稻土重金属砷污染方面具有良好的应用前景。

本发明的积极效果：

本发明分离到一株厌氧砷氧化、铁氧化菌HC18，该菌株属于Noviherbaspirillum属，在厌氧反硝化条件下可同时氧化As(III)和Fe(II)。采用扫描电子显微镜结合能谱仪(SEM- EDX)、X射线光电子能谱仪(XPS)和X射线衍射分析技术(XRD)对亚铁氧化形成的Fe(III)氧化物进行了表征。XRD和XPS分析表明，生成的As(V)被微生物厌氧铁氧化形成的针铁矿吸附，表明在厌氧条件下厌氧砷氧化、铁氧化菌HC18可以有效地固定和去除砷，将在修复砷污染土壤方面发挥重要作用。

附图说明

图1为菌株HC18基于16S rRNA基因同源序列的系统发育树。

图2为菌株在厌氧反硝化条件下对As(III)的氧化以及培养液中硝酸盐和亚硝酸盐的变化；

其中(a)菌株在厌氧反硝化条件下对As(III)的氧化；(b)培养液中硝酸盐和亚硝酸盐的变化。

图3为菌株在厌氧反硝化条件下对Fe(II)的氧化以及菌株反硝化能力的检测；

其中，(a)菌株在厌氧反硝化条件下对Fe(II)的氧化；(b)菌株反硝化能力的检测。

图4为菌株HC18生物成铁氧化物的X射线衍射(XRD)图谱和扫描电镜(SEM)照片。

图5为菌株HC18生物成铁氧化物的EDS-mapping图谱。

图6为菌株HC18氧化生成的铁氧化物的XPS拟合图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：从砷污染水稻土中分离筛选厌氧砷氧化菌HC18

(1)样品采集

土壤样品采自广西省河池市的砷污染的稻田土，采集深度是水稻土表层以下约10-20厘米。

(2)厌氧砷氧化菌的富集培养

富集培养采用PIPES缓冲培养基(g.L^-1)：磷酸二氢钾0.1，氯化钠0.3，二水合氯化钙 0.1，六水合氯化镁0.413，哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)9.071，氢氧化钠1.8，去离子水1000 mL，将配置好的培养基置于电炉上煮沸，利用分液器将50mL培养基分装至100mL血清瓶内，用N₂/CO₂(80:20，v/v)交换血清瓶顶空气体并保持血清瓶内厌氧环境，用橡胶塞及铝盖密封并灭菌，灭菌后的培养基冷却待用。用注射器外源补加碳源(10mM乳酸钠)、电子受体(10mM硝酸钠)、1mL维生素复合液，和1mL微量元素至血清瓶。称取10g新鲜土壤放入含有玻璃珠90mL的无氧无菌水中，震荡摇匀，以1:10的比例将土壤悬液接入培养基中，避光静置，30℃厌氧培养7天，富集4代。

所述维生素复合液(L^-1)：生物素2.00mg，叶酸2.00mg，盐酸吡哆醇10.00mg，核黄素5.00mg，硫胺素5.00mg，烟酸5.00mg，泛酸5.00mg，VB12 0.10mg，对氨基苯甲酸 5.00mg，硫辛酸5.00mg。

所述微量元素SL-10(L^-1)：HCl(25％)10.00mL，FeCl₂·4H₂O 1.50g，ZnCl₂ 70.00mg，MnCl₂·4H₂O 100.00mg，H₃BO₃ 6.00mg，CoCl₂·6H₂O 190.00mg，CuCl₂·2H₂O 2.00mg，NiCl₂·6H₂O 24.00mg，Na₂MoO₄·2H₂O 36.00mg。

(3)亨盖特滚管筛选

菌株的筛选采用的是亨盖特厌氧滚管技术。首先将富集液从10^-1到10^-9稀释，其次将厌氧琼脂试管培养基置于60℃水浴中融化，用1mL无菌注射器分别吸取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7四个稀释梯度的稀释液各0.1mL打入融化了的厌氧琼脂试管中，然后将厌氧试管水平放置在冰浴中均匀滚动30s，直至试管内壁上凝固形成一薄层，置于30℃培养箱中遮光培养10天。在厌氧手套箱中挑取单菌落并接种至厌氧PEPIS缓冲培养基中，加入10mM的乳酸钠为碳源，10mM的硝酸盐为电子受体，置于30℃恒温箱中遮光培养。厌氧管上选取长势好的单菌落，接种于液体培养基中，同时向厌氧管中加入50μM As(III)，放在30℃恒温箱中培养。

实施例2：砷氧化菌HC18的分类鉴定

提取菌株HC18的基因组DNA作为模板，进行16S rDNA基因的扩增。采用16S rDNA的通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R(5’-TACCTTGTTACGACTT-3’) 进行PCR扩增。将菌株HC18的16S rRNA基因序列在GenBank中及EzTaxon server 2.1数据库进行Blast比对。应用MEGA 6.0软件作系统发育树(图1)，发现其与 Noviherbaspirillumdenitrificans TSA40亲缘关系最近，相似性到达99％，因此我们将菌株 HC18鉴定为1株草螺菌。

实施例3：菌株HC18的厌氧砷氧化特性研究

将HC18厌氧种子液以5％的接种量接入厌氧PIPES缓冲培养基中，以10mM的乳酸钠为碳源，10mM的硝酸盐为电子受体，同时向培养基中加入10μM As(III)，放置于30℃恒温箱中避光培养培养96小时。实验设置接菌和不接菌两个处理，每个处理设置三个平行。间隔12小时取样，分别测定培养液中As(III)、As(V)，硝酸盐和亚硝酸盐的浓度。结果表明，在厌氧反硝化条件下，菌株可以在96h之内氧化10μM As(III)，在24-72h之间砷氧化速率最快，同时HC18可以将约8mM的NO₃ ^-还原为NO₂ ^-，从36h开始，NO₂ ^-含量开始积累，然后在108h后下降。在未接种菌株HC18对照中没有发生As(III)氧化(图2)。

实施例4：菌株HC18的厌氧铁氧化功能研究

将种子液按5％体积比接种到厌氧PIPES缓冲培养基，以10mM的乳酸钠为碳源和电子供体，10mM的硝酸盐为电子受体，向培养基中加入2.5mMFe(II)。间隔2天取样，分别测定Fe(II)与硝酸盐、亚硝酸盐的含量。实验设置接菌和不接菌两个处理，每个处理设置三个平行。培养至第10天进行破坏性取样，将培养液取出，5000rpm离心5min后弃上清，用去离子水反复清洗3次，将沉淀冷冻干燥后送至苏州德优博测公司进行XRD、SEM和EDS 分析表征。采用X射线衍射仪(SmartLab)进行分析，X射线衍射仪测试条件为：光源采用 Cu-Kα靶射线辐射，管电压40kV，管电流30mV，扫描区间10°～80°/(2θ)，υ＝10° min^-1；样品谱图通过与标准XRD图谱(JCPDS)比对来确定铁氧化物晶相。采用 FEI Quanta 400FEG型扫描电镜对样品形貌进行分析，加速电压为20kv。采用Edaxappllo xl 型号X射线光谱仪(EDS)进行半定量分析，采集时间为90s。结果表明，菌株HC18在厌氧反硝化条件下完全氧化2.5mM Fe(II)，4mM硝酸盐被还原。第2天时，培养基中0.6mM亚硝酸盐累积，并且亚硝酸盐浓度一直保持稳定不变(图3)。另外，在培养期间可以观察到血清瓶里面生成红色的沉淀物。在不接种菌株的对照组里，Fe(II)没有氧化，液体保持澄清状态(图3a)。

为了研究生成的红色沉淀物的成分，本研究测试了X射线衍射图谱，图中结果显示，在图谱上有6个明显的衍射峰，峰略有宽化，但是仍然比较清晰，说明晶型比较完整，分别对应的d间距分别为4.18、2.69、2.49、2.253、2.19和

与标准图谱比对，表明菌株HC18氧化Fe(II)形成的铁氧化物主要由针铁矿组成(图4a)。用扫描电镜-能谱仪(SEM-EDS)对沉淀的形貌和成分进行了分析，可以发现矿物颗粒多呈现不规则的针状形态包裹在菌体的表面，推测Fe(II)氧化过程是发生在胞外，吸附在菌体的表面(图4b)。EDS-mapping分析结果表明，矿物主要是由Fe、O、P三种元素组成，所占原子百分比为44.64％、 51.66％、3.70％(图5)。

实施例5：菌株HC18对砷的固定作用

将种子液按5％体积比接种到厌氧PIPES缓冲培养基，分别以10mM乳酸钠和10mM的硝酸盐为碳源和电子受体，向培养基中按照Fe(II):As(III)(mg:mg)＝50:1加入2.5mMFe(II)和35μM As(III)。间隔两天取样，分别测定上清液中Fe(II)、As(III)、As(V)与硝酸盐、亚硝酸盐的含量。实验总共设置加菌和不加菌两个处理，每个处理设置三个平行。培养至第10天时，破坏性取样瓶盖，取出所有液体，5000rpm离心5min后弃上清，用去离子水反复清洗3次，将沉淀冷冻干燥后送至苏州德优博测公司进行XPS分析表征。采用X射线光电子能谱仪(Thermo ESCALAB 250X.)对铁氧化物所含元素价态进行分析，激发光源为 Al K(1486.8eV)，通过能量为100eV。数据分析通过XPS PEAK进行拟合。

用磷酸萃取铁氧化物结果表明，Fe(III)矿物沉淀的As(V)占45％总含量(表1)。进行 XPS测量以研究各种结合元素的化学状态和表面成分。Fe 2p3/2和Fe 2p1/2区域分别在724.6ev和710.8ev出现两个峰值，卫星峰分别出现在732.8ev和718.9ev，O 1s光谱在529.6ev处与Fe-O和531.1ev处与Fe-OH拟合，这归因于Fe(III)存在于α-FeOOH。在1326.0eV和1327.0eV下，As 2p峰与As(III)峰拟合。这些结果表明，As(III)和Fe(II)分别被HC18菌株氧化为As(V)和Fe(III)(图6)。

表1.菌株HC18生成的铁氧化物吸附的砷的浓度

Claims (5)

1.一株脱氮新草螺菌HC18，该菌株分类命名为脱氮新草螺菌（Noviherbaspirillum denitrificans），于2019年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO: M 20191117。

2.权利要求1所述的脱氮新草螺菌HC18在体外厌氧氧化二价铁和三价砷中的应用。

3.权利要求1所述的脱氮新草螺菌HC18在修复砷污染土壤中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的砷污染土壤为砷污染水稻土。

5.一种修复砷污染土壤的方法，其特征在于，使用由权利要求1所述菌株制备的菌剂来处理砷污染土壤，该菌剂含有权利要求1所述的菌株。

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