CN112322548B - 一种超级耐砷的脱硫螺旋菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种严格厌氧的、螺旋状、直径为0.1μm～0.2μm、长度为2μm～7μm、可单独存在或以成对状排列、具有双极鞭毛、能移动、革兰氏染色阴性的超级耐砷的脱硫螺旋菌，所述脱硫螺旋菌生长温度为16℃～37℃，生长pH值范围为6～10，生长盐度范围为在0.5％～4％的NaCl溶液。其可以在厌氧无机盐培养基中利用碳源进行呼吸生长，以丙酮酸、丙酮酸盐或乙酸钠为电子供体，以砷酸盐或硒酸盐为电子受体，在厌氧无机盐培养基中利用碳源进行呼吸生长，将超高浓度五价砷酸根还原为三价的亚砷酸盐；在硫化物作用下能将五价砷转化为硫化砷沉淀；呼吸还原有毒的硒酸盐并将其转化为无毒的单质硒沉淀。

Description

一种超级耐砷的脱硫螺旋菌及应用

技术领域

本发明属于菌株分离筛选技术领域，具体涉及一种超级耐砷的脱硫螺旋菌及应用。

背景技术

砷是一种类金属元素，常见的砷化合物有吡霜(As₂O₃)、雄黄(AsS)、雌黄 (As₂S₃)和毒砂(FeAsS)等。众所周知，砷是一种毒物，并且在地壳、土壤、海水、河水及大气等环境中广泛存在。砷污染主要由人为因素导致，特别是金属矿藏的开采和冶炼、含砷产品生产和使用以及煤的燃烧等。目前砷污染已成为全球性问题，特别是地下水砷污染比较严重的美国、德国、印度、孟加拉国、中国、墨西哥等，其中南亚和东南亚的一些国家地下水砷污染形势尤为严峻。在孟加拉国和西孟加拉邦以及印度，大约有6亿到10亿人口在饮用砷含量超过世界卫生标准(10μg/L)的水。通过对尼泊尔、印度、孟加拉国、柬埔寨和越南等五个国家的井水调查发现一半以上的井水中砷的含量都超过世界卫生组织标准。

我国也是砷污染最为严重的国家之一，据2013年《Science》关于中国地下水砷污染风险的文章报道，我国受砷污染严重的区域包括新疆、内蒙古、山西等地区，此外辽宁西部、部分江淮地区、江汉平原和四川中部等区域也存在风险。事实上，除了水污染，砷也已经成为一种普遍的土壤污染物。污染土壤中砷的积累也有可能渗透到地下水和地表水中，而通过摄食、呼吸和皮肤接触的方式直接接触砷能够危害到动物和人类健康。中国《土壤环境质量标准》GB 15618-1995规定水田和旱地中砷的一级标准为15mg/kg。我国土壤环境的砷污染问题比较严重，其中土地受砷、镉、铅等重金属污染的面积达2×10⁷公顷。

综上所述，砷污染问题日益严峻，由砷污染引起的地方性砷中毒事件不断出现，严重威胁着人们的健康和生命安全，因此，对砷污染的环境治理刻不容缓。

环境中的砷主要以五价的砷酸盐和三价的亚砷酸盐两种无机砷形态存在，其中三价砷的毒性和环境迁移性更强。最近的研究发现，微生物对环境中砷的迁移转化起到主导作用。在厌氧条件下，五价砷被微生物还原转化为三价砷之后，可以与硫化物形成黄色沉淀从而将砷从水相环境转移到固相中将其固化。因此，五价砷被微生物还原的过程也可以应用到水中砷的去除。研究发现，此过程只有在微生物参与下才能发生。当反应体系中没有添加微生物时，水中原有的三价砷与硫化物无法形成黄色沉淀。

发明内容

本发明针对上述缺陷，提供一种严格厌氧的，可以在厌氧无机盐培养基中利用碳源进行呼吸生长，将超高浓度五价砷酸根还原为三价的亚砷酸盐，或者在硫化物作用下能将五价砷转化为硫化砷沉淀；呼吸还原有毒的硒酸盐并将其转化为无毒的单质硒沉淀的超级耐砷的脱硫螺旋菌。

本发明提供如下技术方案：一种超级耐砷的脱硫螺旋菌，所述脱硫螺旋菌被命名为的脱硫螺旋菌(Desulfurispirillum sp.A2)，于2018年2月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018076，保藏单位地址：中国武汉。

进一步地，所述脱硫螺旋菌包含16S核糖体RNA，该核糖体RNA至少包含部分核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

进一步地，所述脱硫螺旋菌分离自污染水体沉积物，为严格厌氧菌，具有超强的砷耐受性，能够在高达1000mmol/L的砷酸盐浓度下生长，以丙酮酸盐或乙酸盐为电子供体，以砷酸盐或硒酸盐为电子受体，在厌氧无机盐培养基中利用碳源进行呼吸生长，将1000mM浓度五价砷酸根还原为三价的亚砷酸盐；在硫化物作用下能将五价砷转化为硫化砷沉淀；呼吸还原有毒的硒酸盐并将其转化为无毒的单质硒沉淀。

进一步地，所述脱硫螺旋菌利用丙酮酸盐或乙酸盐作为电子供体呼吸还原硝酸盐、砷酸盐、硒酸盐和亚硒酸盐中的一种或多种。

进一步地，直径为0.1μm～0.2μm，长度为2μm～7μm，可单独存在或以成对状排列，菌体具有双极鞭毛，能移动，革兰氏染色阴性。

进一步地，所述脱硫螺旋菌生长温度为16℃～37℃，生长pH值范围为 6～10，生长盐度范围为在0.5％～4％的NaCl溶液。

进一步地，所述脱硫螺旋菌生长最适生长温度为28℃，最适生长pH值为8，最适生长盐度为2％的NaCl。

本发明还提供上述超级耐砷的脱硫螺旋菌的筛选方法，包括以下步骤：

1)从黄石大冶湖流域周边污染河道采集沉积物作样品，取2g沉积物样品悬浮于10ml的无氧生理盐水中，插入长针头，氮气吹扫10min，使所述沉积物与稀释水混匀成泥浆，用注射器取1ml～2ml泥浆注射接种到预先装好含砷培养基的血清瓶中；

2)接种后置于30℃下暗光培养7天，然后采用注射器转移2ml培养液到新的50ml含砷培养基中，培养5天后，再次转移至另一新的50ml含砷培养基继续培养5天，用空白培养基稀释细菌细胞作稀释分离，获得纯培养的所述超级耐砷的脱硫螺旋菌。

进一步地，所述含砷培养基的组成为1000ml的去离子水，2.50g的 NaHCO₃、0.25g的NH₄Cl、0.60g的NaH₂PO₄·H₂O、0.10g的KCl、0.84g的 CH₃COONa、3.12g的Na₂HAsO₄·7H₂O、10.0ml的维生素溶液，10.0ml的微量元素溶液，其中所述CH₃COONa作为电子供体，所述Na₂HAsO₄·7H₂O作为电子受体；本发明所采用的维生素溶液为从北京酷来搏科技有限公司购买的Wolfe's Vitamin Solution，所采用的微量元素溶液为从北京酷来搏科技有限公司购买的Wolfe's Mineral Solution。

进一步地，所述含砷培养基的制作严格按照厌氧操作方法进行。

本发明的有益效果为：

本发明的脱硫螺旋菌(Desulfurispirillum sp.A2)分离自黄石市大冶湖流域水体沉积物样品，该菌株能耐受超高浓度的砷，可耐受并呼吸极高浓度五价砷并将其还原为三价砷，在砷污染修复上具有广阔的工业应用前景和理论研究价值。

附图说明

在下文中将基于实施例并参考附图来对本发明进行更详细的描述。其中：

图1为本发明实施例1提供的脱硫螺旋菌A2的细胞形态相差显微镜图；

图2为本发明实施例3提供的菌株A2对超高浓度砷的呼吸还原砷含量图；

图3为本发明实施例4提供的菌株A2还原砷生成硫化砷沉淀示意图；

图4为本米发明实施例5提供的菌株A2还原硒生成单质硒沉淀示意图。

具体实施例方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：菌株的筛选

从黄石大冶湖流域周边污染河道采集沉积物作样品。取2克沉积物样品悬浮于10毫升的无氧生理盐水中，插入长针头，氮气吹泡，让沉积物与稀释水混匀成泥浆，直接用注射器取1ml～2ml泥浆注射接种到预先装好含砷培养基的血清瓶中。含砷培养基的组成为：去离子水1000毫升，2.50g的 NaHCO₃，0.25g的NH₄Cl，0.60g的NaH₂PO₄·H₂O，0.10g的KCl，0.84g的 CH₃COONa，3.12g的Na₂HAsO₄·7H₂O，10.0ml的维生素溶液，10.0ml微量元素溶液，其中乙酸钠和砷酸氢二钠分别作为电子供体和电子受体。培养的制作严格按照厌氧操作进行，接种后置于30℃下暗光培养。一周后，用注射器转移2ml培养液到新的50ml含砷培养基中，培养5天后，再次转移培养液到新培养基中，培养5天后，作稀释分离，获取纯培养。该菌株被命名为A2，采用16S rRNA基因序列系统发育分析表明该菌属于产金菌门中的脱硫螺旋菌属(Desulfurispirillum)，命名为Desulfurispirillum sp.A2，已于2018年2月保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号为CCTCC M 2018076。其细胞形态相差显微镜图如图1所示，其形态特征如下：菌体为螺旋状，直径为0.1～0.2微米，长度为2～7微米，可单独存在或以成对状排列，菌体具有双极鞭毛，能移动，革兰氏染色阴性。

本发明的A2菌株既可以以砷酸盐为电子受体，以乙酸盐为电子供体的厌氧无机盐培养基中生长。也可以在以丙酮酸盐为唯一电子供体和硝酸盐为电子受体的厌氧培养基中生长。菌株在pH6－10均能良好地生长，生长温度16-37℃，严格厌氧。

实施例2：与相关菌株的16S rRNA的相似性验证实验

本发明实施例1提供的脱硫螺旋菌包含16S核糖体RNA，该核糖体RNA 至少包含部分核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

通过检索GenBank，本发明的菌株A2与其中相关菌株的16S rRNA基因的相似性如表2所示。

表2菌株A2与相关菌株的16S rRNA的相似性

表2显示，本发明A2新菌株的16S rRNA基因在GenBank中无完全相同的菌株，说明本菌株是首次被分离。证明该菌属于脱硫螺旋菌属进化分枝。

实施例3：菌株A2对1000mM超高浓度砷的呼吸还原实验

先培养上述实施例1中含砷培养基中菌株A2，以10％接种量转接到高浓度砷培养基(100mM砷酸氢二钠和20mM乙酸钠)中，置于30℃下暗光培养三天后，再按10％接种量加入到20ml超高浓度砷培养基中，其中含 1000mM砷酸氢二钠和50mM乙酸钠，置于30℃下暗光静置培养，同时设置未接种的空白培养基作为对照。每间隔12小时取样，采用高效液相色谱法测定样品中砷形态，色谱参数及条件为：检测波长193nm，1/15mol/L pH＝5 的磷酸盐缓冲液，柱温30℃，色谱柱为IC-Park^TM Anion HC阴离子柱。检测结果如图2所示，接种后经过约20h适应期，五价砷开始被还原为三价砷，最终共有约65mM的砷还原，未接种的空白对照中未检测到砷的还原。砷还原停止的主要原因是还原得到的三价砷毒性大，随着三价砷浓度逐渐增大，最终菌株A2细胞代谢受到抑制。用不含砷的空白培养基对该体系进行2倍稀释后，A2的生长和砷还原可以得到恢复。

实施例4：菌株A2还原转化砷酸盐为硫化砷沉淀以除去水体中砷污染

按照实施例1表述的培养和接种方法，从20ml的以含砷培养基中获得生长对数晚期的A2培养液，采用注射法以10％接种量转接到新的含砷培养基中，其中砷酸氢二钠为10mM，并加入2mM半胱氨酸或1mM硫化钠作为硫离子源，置于30℃下暗光静置培养，两天后，厌氧管的培养液中开始出现黄色硫化砷沉淀，如图3所示。硫化砷沉淀可以通过过滤或离心从液相中分离除去，从而利用菌株A2还原砷的能力结合硫化物沉淀三价砷除去水体中砷污染。

实施例5：菌株A2还原转化硒酸盐为固态单质硒沉淀以除去水体中硒

含硒培养基组成：去离子水1000毫升，2.50g NaHCO₃，0.25g NH₄Cl， 0.60gNaH₂PO₄·H₂O，0.10g KCl，0.84g CH₃COONa，10.0ml维生素溶液， 10.0ml微量元素溶液，加入1.89g硒酸钠或1.73g亚硒酸钠作为电子受体。按照实施例1表述的培养和接种方法，从20ml的以含砷培养基中获得生长对数晚期的A2培养液，采用注射法以10％接种量转接到新的含硒培养基中。置于30℃下暗光静置培养一天后，如图4所示，接种A2并含有硒酸钠或亚硒酸钠的厌氧管培养液中开始出现红色单质硒沉淀，而未接种A2的含硒酸钠的对照中始终保持无色透明。单质硒沉淀可以通过过滤或离心从液相中分离除去，从而利用菌株A2还原硒酸盐或亚硒酸盐生成五毒单质硒沉淀的能力除去水体中有毒硒酸盐的污染。

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

序列表

<110> 湖北理工学院

<120> 一种超级耐砷的脱硫螺旋菌及应用

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1393

<212> DNA

<213> 脱硫螺旋菌(Desulfurispirillum sp. A2)

<400> 1

tcgaggctcc tatccgaaga ttcggtcacc cgcttctggc aaaaccgact ttcgtggtgt 60

gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc agtatgctga cctgcgatta 120

ctagcgattc cgacttcatg cagtcgagtt gcagactgca atccgaacta agacaaggtt 180

tttgaggttg gctcactctc gcgaggtcgc atcccgttgt ccttgccatt gtagcacgtg 240

tgtagccctg gtcataaggg ccatgatgac ttgacgtcgt ccccaccttc ctccggatta 300

ctccggctgt cccactagag tgcccaactg aatgatggca actaatggca ggggttgcgc 360

tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacagccg atgcagcacc 420

tgtcaccgga tgtccccgaa gggaaatata catctctgaa tacggcatcg ggatgtcaag 480

accaggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540

cccccgtcaa ttcgtgtgag tttcagcctt gcgaccgtac tccccaggcg ggatgcttat 600

tgcgttagct ccgacactga caggaagatt cccgccaaca tctagcatcc atcgtttacg 660

gcgtggacta ccagggtatc taatccttgt ttgctcccca cgctttcgtg cctcagcgtc 720

agttactgcc cagaaagctg ccttcgcttt tgatgttcca ccctatatct acgaatttca 780

cctctacaca gggcattccg ctttccccta cagtactcaa gtcttccagt ttccgcacca 840

atttcagcgt taagcactga acttacaatg cagacttaaa aaaccgccta cgcacccttt 900

acgcccaatg attccggaca acgctagctc catccgtatt accgcggctg ctggcacggg 960

atttagccgg agcttattgt atgggctacc gtcagggcac gggcagttac tcccgtaccg 1020

gttcttcacc atctaaagga ctttacgacc cgaaagcctt cgtcatccac gcggcgttga 1080

tgcgtcagac ttacgtccat tgcgcaatat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg 1140

gccgtgtctc agtcccagtg tggccgttca ccctctcagg ccggctaatg atcttcgcct 1200

tggtgggccg ttaccccacc aacaagctaa tcatgcgcgg gctcatcctt cggcggaacc 1260

cgaaagctcc gtttgctcaa aagagattat ccggtattag catccgtttc cagatgttat 1320

cccgggccaa agggcagatt acccacgtgt tactcacccg tgcgccagtg gccccgaaag 1380

gcccctgact gca 1393

Claims (5)

1.一种超级耐砷的脱硫螺旋菌，其特征在于，所述脱硫螺旋菌被命名为脱硫螺旋菌(Desulfurispirillum sp.)A2，于2018年2月保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO ： M2018076。

2.权利要求1所述的脱硫螺旋菌的应用，其特征在于，所述应用是将五价砷还原转化为三价砷。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用具体是在厌氧无机盐培养基中利用碳源进行呼吸生长，将1000mM超高浓度五价砷酸根还原为三价的亚砷酸盐。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用具体是在硫化物作用下将五价砷转化为硫化砷沉淀。

5.权利要求1所述的脱硫螺旋菌的应用，其特征在于，所述应用是呼吸还原有毒的硒酸盐并将其转化为无毒的单质硒沉淀。

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