CN109897797B - 硫酸盐还原菌株的培养方法、硫酸盐还原菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种硫酸盐还原菌株的培养方法，该硫酸盐还原菌株及应用。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:14043；保藏时间为：2017年4月17日。该菌株具有优异的降解特性，对有机砷污染物，尤其是二苯砷酸降解转化方面具有很广泛的应用，体系中的DPAA降解转化率可达41.8％，为二苯砷酸污染地区土壤及地下水的生物修复提供了新资源和思路，具有良好的应用前景。

Description

硫酸盐还原菌株的培养方法、硫酸盐还原菌株及应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种硫酸盐还原菌株的培养方法、硫酸盐还原菌株及应用。

背景技术

硫酸盐还原菌(Sulfate-Reducing Bacteria,SRB)，是在缺氧或无氧状态下，用乳酸或丙酮酸等有机物作为电子供体，用硫酸盐作为末端电子受体而繁殖的一群厌氧微生物，广泛存在于大田、水田、湖沼、河川底泥、海底泥等缺氧环境中。

近年来，战后掩埋的化学武器常常导致严重的环境污染事件，其中以砷污染最为普遍。二苯砷酸(DPAA)是含砷化学武器经一系列水解和氧化过程后生成的一种新型环境污染物。此外，工农业生产活动中大量使用的含砷除草剂、杀虫剂等是环境中苯砷酸类污染物的另一重要来源。研究发现该类污染物难以被生物降解，并可以通过各种途径进入环境中，尤其是靠近水源地、居民区及农田土壤中高浓度的砷污染，严重危害人体健康及生态安全。

因此，对有机砷类污染物的环境行为及对该类污染物的安全修复技术亟待研究开发，现如今针对有机砷类污染物还没有很好的生物治理方法，普遍治理效果不佳，治理效率低，限制了其进一步的扩展应用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明通过提供新的硫酸盐还原菌株及应用、该硫酸盐还原菌株的培养方法，以及可用于污染物降解来解决前述需求，尤其是对于有机砷污染物降解转化方面具有很好的治理作用，该方法绿色环保，成本低，耗时时间短，操作方便，通过采用这种生物治理的方法，该菌株具有优异的降解特性，为二苯砷酸污染地区土壤及地下水的生物修复提供了新资源和思路，应用前景非常广阔。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种分离的硫酸盐还原菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:14043；保藏时间为：2017年4月17日。

该菌株的菌落形态描述特征为：菌株经革兰氏染色显紫色，呈阳性，菌落的形状为梭状，黑色球状菌落，表面光滑、边缘整齐，轮廓清晰。

本申请提供的硫酸盐还原菌株(Clostridium thiosulfatireducens)，菌株名为SRB-2，分离自淹水状态下的DPAA污染土壤，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No:14043；保藏时间为：2017年4月17日，检测为存活菌株并保藏。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1的硫酸盐还原菌在在分离筛选培养基上的菌落特征；

图2为本发明实施例1的硫酸盐还原菌革兰氏染色照片及扫描电子显微镜下的菌体微观形貌特征；

图3为本发明实施例1的硫酸盐还原菌的系统发育树；

图4为本发明实施例2的硫酸盐还原菌与不接菌的情况下培养过程中SO₄ ^2-浓度的变化；

图5为本发明实施例2的硫酸盐还原菌对体系中DPAA的降解转化效率。

本申请提供的硫酸盐还原菌(Clostridium thiosulfatireducens)，菌株名为SRB-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No:14043；保藏时间为：2017年4月17日，检测为存活菌株并保藏。

具体实施方式

本发明涉及一种分离的硫酸盐还原菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No:14043；保藏时间为：2017年4月17日。

该菌株具有很强的降解效果，尤其是对于有机砷污染物二苯砷酸降解转化方面具有很好的治理作用，该方法绿色环保，成本低，耗时时间短，操作方便，通过采用这种生物治理的方法，该菌株具有优异的降解特性，体系中的DPAA降解转化率可达41.8％，为二苯砷酸污染地区土壤及地下水的生物修复提供了新资源和思路，应用前景非常广阔。

本发明请求保护上述保藏编号的硫酸盐还原菌株，以及在适度范围内发生突变，且仍然具有很强的硫酸盐还原能力的突变菌株。

在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，有必要将硫酸盐还原菌株扩大培养制成组合物(特别是微生物菌剂)的形式以扩大其应用范围。

本发明的组合物(优选地，在用作发酵剂培养物时)可为纯培养物或混合培养物。所以，本发明将纯培养物限定为这样一种培养物，其中全部或基本上全部培养物由本发明的同一硫酸盐还原菌菌株组成。在替代形式中，将混合培养物限定为这样一种培养物，其包含若干种微生物，具体地讲包含若干种细菌菌株，包括本发明的硫酸盐还原菌株

所述组合物用于工业，可制成液体、冷冻或干燥粉末形式；或以本行业常用的制剂形式来表述，如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、乳液或液剂。

任何载体都可使用，不论它们是固体或液体，只要它们是工业方面常常用的和生物学上惰性的即可。不限于任何特定的载体。

另外，本发明提供了硫酸盐还原菌株的培养方法，具体包括如下步骤：所述硫酸盐还原菌株在包含有Postgate B培养基的体系中培养；

优选地，培养的温度为25-35℃之间；

更优地，培养的温度为32℃。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述Postgate B培养基的组成为：K₂HPO₄·3H₂O 0.3-1g/L，NH₄Cl 0.5-1.5g/L，Na₂SO₄ 2-4g/L，CaCl₂·2H₂O 0.02-0.06g/L，MgCl₂·6H₂O 0.2-0.6g/L，乳酸钠2-4g/L，酵母提取物0.5-1.5g/L。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述Postgate B培养基的组成为：K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，NH₄Cl 1.0g/L，Na₂SO₄ 3g/L，CaCl₂·2H₂O 0.05g/L，MgCl₂·6H₂O 0.4g/L，乳酸钠3g/L，酵母提取物1g/L。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述Postgate B培养基中添加二苯砷酸。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述二苯砷酸添加到培养基中，浓度控制在2-10mg/L之间。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述硫酸盐还原菌株接种到所述Postgate B培养基培养，所述硫酸盐还原菌株的接种量体积百分比为2-10％，更优地接种量为5％。

最后，本发明还提供了上述硫酸盐还原菌株的分离纯化方法，具体包括如下步骤：

(1)所述硫酸盐还原菌(Clostridium sp.SRB-2)分离自淹水状态下的DPAA污染土壤；

(2)用改良的Postgate B培养基对土壤悬液进行富集培养。菌液富集培养2～3次。

(3)采用稀释涂布叠皿夹层培养法对菌株进行分离纯化，挑取夹层中生长迅速、轮廓清晰的球状菌落进行划线分离，多次重复，直至分离到纯化的硫酸盐还原菌株。

上述方法通过富集、分离纯化的方法从淹水状态下的DPAA污染土壤中最终得到目标菌种，后续对该菌种的菌落特征以及对其DPAA的降解效果进行了评定，具体可见下述实施例以及实验例的具体过程。

优选地，上述分离纯化方法中，其中富集培养的方法具体操作步骤为：取5mL混匀的土壤悬液转接至装有95mL改良Postgate B培养基的血清瓶中，用氮气交换上层空气后，用带聚四氟乙烯内垫的铝盖密封后放入恒温培养箱静置培养1～2周，至培养基变成墨汁黑色。用润湿的醋酸铅试纸检测有H₂S生成证明培养良好。用富集培养基对菌液富集培养2～3次。

富集培养基为改良Postgate B培养基，其组分为：其组分为：K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，NH₄Cl 1.0g，Na₂SO₄ 3.0g，CaCl₂·2H₂O 0.05g，MgCl₂·6H₂O 0.4g，乳酸钠3.0g，酵母提取物1.0g。将上述试剂溶解在1000mL去离子水中，调节pH 7.0，121℃高压灭菌20min。冷却后加入经过滤除菌的抗坏血酸0.1g和FeSO₄·7H₂O 0.1g。

硫酸盐还原菌(Clostridium sp.SRB-2)的分离方法：常规的稀释涂布叠皿夹层培养法。

具体分离方法为：将分离鉴定培养基及玻璃培养皿进行高温灭菌，待温度降至50℃左右时将培养基倒入培养皿中，倒入培养基的量为培养皿高度的1/4为宜，待培养基冷却凝固后分别吸取不同稀释倍数的富集培养液(稀释度分别为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5)200μL均匀涂布在平板上，等待其基本渗入培养基后在其上方倒入同种固体培养基，其厚度约为2～3mm，然后迅速将培养皿的内皿底水平嵌入上层培养基中，并保证没有气泡，去掉内外培养皿侧壁间过多的培养基，用灭菌的液体石蜡液封，使培养皿夹层处于厌氧状态，置于厌氧袋中32℃条件下培养。

分离纯化的培养基为：蛋白胨10.0g，Na₂SO₃ 0.5g，NaCl 5.0g，CH₃COOPb 0.5g，琼脂15.0g，溶解于1000mL去离子水中，调节pH 7.0，121℃高压灭菌20min。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

硫酸盐还原菌株的分离纯化方法具体包括如下步骤：

该实施例获得的菌株SRB-2是从DPAA污染的淹水土壤中富集培养，分离筛选出的。

富集培养的方法：取5mL混匀的土壤悬液转接至装有95mL改良Postgate B培养基的血清瓶中，用氮气交换上层空气后，用带聚四氟乙烯内垫的铝盖密封后放入恒温培养箱静置培养1～2周，至培养基变成墨汁黑色。用润湿的醋酸铅试纸检测有H2S生成证明培养良好。用富集培养基对菌液富集培养2～3次。

富集培养的培养基为改良Postgate B培养基，其组分为：其组分为：K₂HPO₄·3H₂O0.5g，NH₄Cl 1.0g，Na₂SO₄ 3.0g，CaCl₂·2H₂O 0.05g，MgCl₂·6H₂O 0.4g，乳酸钠3.0g，酵母提取物1.0g。将上述试剂溶解在1000mL去离子水中，调节pH 7.0，121℃高压灭菌20min。冷却后加入经过滤除菌的抗坏血酸0.1g和FeSO₄·7H₂O 0.1g。

采用稀释涂布叠皿夹层培养法对菌株进行分离纯化，其方法为：将分离鉴定培养基及玻璃培养皿进行高温灭菌，待温度降至50℃左右时将培养基倒入培养皿中，倒入培养基的量为培养皿高度的1/4为宜，待培养基冷却凝固后分别吸取不同稀释倍数的富集培养液(稀释度分别为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5)200μL均匀涂布在平板上，等待其基本渗入培养基后在其上方倒入同种固体培养基，其厚度约为2～3mm，然后迅速将培养皿的内皿底水平嵌入上层培养基中，并保证没有气泡，去掉内外培养皿侧壁间过多的培养基，用灭菌的液体石蜡液封，使培养皿夹层处于厌氧状态，置于厌氧袋中32℃条件下培养。

分离鉴定培养基组分为：蛋白胨10.0g，Na₂SO₃ 0.5g，NaCl 5.0g，CH₃COOPb 0.5g，琼脂15.0g，溶解于1000mL去离子水中，调节pH 7.0，121℃高压灭菌20min。

通过上述的分离与筛选工作，获得一株生长速度快，还原硫酸盐能力强的菌株SRB-2。

1)该实施例的硫酸盐还原菌的菌落特征：

硫酸盐还原菌在分离鉴定培养基上的菌落形态为黑色球状菌落，具体见附图1，稀释度不同，菌落的密度也不同。挑取轮廓清晰、生长迅速的单菌落，对菌落进行多次划线分离，经过多次培养，得到纯化的SRB菌株。

2)对该实施例菌株的生理特征及分子生物学进行鉴定：

对培养至对数期的菌体进行革兰氏染色。

选取对数期菌体用2.5％戊二醛固定，再用乙醇梯度脱水，用叔丁醇置换。将处理好的样品冷冻干燥，固定喷金后在扫描电子显微镜(Hitachi S-4800 FE-SEM，日立)下观察其微观形貌特征。

用试剂盒提取菌株的DNA，采用细菌通用引物27F、1492R作为扩增引物进行PCR扩增。

16S rRNA序列引物27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，1492R：5'-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3'。

PCR扩增体系(50μL)：模板DNA 5μL，Mix(2×)25μL，引物27F 2μL，引物1492R 2μL，ddH2O 16μL。扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性1min；58℃退火1min；72℃延伸2min，循环30次；最后72℃延伸10min，4℃保存。对扩增产物进行电泳检测，委托英潍捷基(北京)生物公司测序。将所得的序列与NCBI数据库中已有的序列进行BLAST分析，并选取同源性相近的菌株，采用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

光学显微镜下，菌株经革兰氏染色显紫色，呈阳性(图2左)。扫描电镜下，SRB-2形状为梭状，大小为0.4～0.6μm×2.0～5.0μm(图2右)。序列比对结果显示，SRB-2与Clostridium sulfidigenes(NR 044161.1)的相似性为99％，且在进化距离上相对较近，如附图3所示，结合菌株的生理生化特征，将SRB-2鉴定为梭菌属Clostridium sp.SRB-2。

实施例2

硫酸盐还原菌株的培养方法以及具体效果评价按照如下步骤进行：

1)配制Postgate B培养基：K₂HPO_4·3H₂O 0.3g/L，NH₄Cl 1.5g/L，Na₂SO₄ 2g/L，CaCl₂·2H₂O 0.06g/L，MgCl₂·6H₂O 0.2g/L，乳酸钠4g/L，酵母提取物0.5g/L，溶剂为水，调节pH 7.0。

2)将上述Postgate B培养基添加二苯砷酸(DPAA)，添加后的浓度为2mg/L，并同时添加针铁矿(添加铁矿物是为了模拟真实条件下土壤中的DPAA容易吸附在土壤中的铁矿物上)，并按照5％的接种量接种培养至对数期的Clostridium sp.SRB-2菌液，并设置不接菌的对照CK(无SRB-2菌的空白培养基)，用高纯氮气置换上层空气后，用聚四氟乙烯内垫外加铝盖密封后置于振荡培养箱中，25℃、180r/min条件下避光培养；

3)液相中DPAA测定用高效液相色谱-质谱联用仪(TSQ Quantum Access MAX，美国Thermo公司)测定，其工作的色谱条件：

色谱柱：Sunfire C18柱，3.5μm，2.1mm×150mm；保护柱：Sunfire C18柱，3.5μm，2.1mm×10mm；柱温：30℃；进样量：25μL；样品盘温度，4℃；流动相A：0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流动相B：0.1％(v/v)甲酸-甲醇溶液；梯度洗脱程序：0-1.5min，1％B；1.5-4min，1-25％B；4-11min，25％B；11-15min，25-70％B；15-22min，70％B；22-37min，1％B；流动相流速：150μL/min。

经过2周的培养，接菌体系中硫酸盐还原菌以SO₄ ^2-作为末端电子受体，体系中SO₄ ^2-的还原，氧化还原电位迅速降低。培养3d，SO₄ ^2-浓度明显降低，具体结果见图4。有机酸被消耗，生成了高反应活性的硫化物，消耗了体系中的H⁺，体系的pH升高。同时，与不接菌的对照相比，体系中DPAA的含量随培养时间的增长不断降低，培养14d时DPAA的降解转化率可达41.8％，具体降解率参见图5。

实施例3

硫酸盐还原菌株的培养方法按照如下步骤进行：

1)配制Postgate B培养基：K₂HPO₄·3H₂O 1g/L，NH₄Cl 0.5g/L，Na₂SO₄ 4g/L，CaCl₂·2H₂O 0.02g/L，MgCl₂·6H₂O 0.6g/L，乳酸钠2g/L，酵母提取物1.5g/L，溶剂为水，调节pH 7.0。

2)将上述Postgate B培养基添加二苯砷酸(DPAA)，添加后的浓度为10mg/L，并同时添加针铁矿(添加铁矿物是为了模拟真实条件下土壤中的DPAA容易吸附在土壤中的铁矿物上)，并按照2％的接种量(10％的接种量也可)接种培养至对数期的Clostridiumsp.SRB-2菌液，并设置不接菌的对照(无SRB-2菌的空白培养基)，用高纯氮气置换上层空气后，用聚四氟乙烯内垫外加铝盖密封后置于振荡培养箱中，35℃、180r/min条件下避光培养。

后续通过对培养体系中SO₄ ^2-浓度及对DPAA的降解率进行测试后，SO₄ ^2-浓度降低及DPAA降解率与实施例2的效果趋势相似。

参考文献：

[1]周黎明,鲁胜利,周建梅,卢彩虹，刘波.日本遗弃化学武器污染土壤中砷的形态分析方法研究[J].分析实验室,2008,27:84-88.

[2]朱濛,涂晨,胡学锋,章海波,李连祯,李远,骆永明.Fenton法和类Fenton法降解土壤中的二苯砷酸[J].环境化学,2015,34(06):1078-1085.

[3]张福存,王雨山,石奉华,武毅.日本在华遗弃化学武器埋藏地调查及其污染处置方法研究[J].地球与环境,2011,39(04):567-570.

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (12)

1.一种硫酸盐还原菌株，其特征在于，所述硫酸盐还原菌株的拉丁文名称为Clostridiumthiosulfatireducens，菌株名为SRB-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC No:14043；保藏时间为：2017年4月17日。

2.权利要求1所述的硫酸盐还原菌株在污染土壤的生物修复方面的应用。

3.权利要求1所述的硫酸盐还原菌株在污染地下水的生物修复方面的应用。

4.权利要求1所述的硫酸盐还原菌株在有机砷污染物降解转化方面的应用。

5.权利要求1所述的硫酸盐还原菌株的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：所述硫酸盐还原菌株在包含有Postgate B培养基的体系中培养；

所述培养的温度为25-35℃之间。

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述培养的温度为32℃。

7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述Postgate B培养基的组成为：K₂HPO₄·3H₂O0.3-1g/L，NH₄Cl 0.5-1.5g/L，Na₂SO₄ 2-4g/L，CaCl₂·2H₂O 0.02-0.06g/L，MgCl₂·6H₂O 0.2-0.6g/L，乳酸钠2-4g/L，酵母提取物0.5-1.5g/L，调节pH 7.0。

8.根据权利要求5-7任一项所述的培养方法，其特征在于，所述Postgate B培养基的组成为：K₂HPO₄·3H₂O0.5g/L，NH₄Cl 1.0g/L，Na₂SO₄ 3g/L，CaCl₂·2H₂O 0.05g/L，MgCl₂·6H₂O0.4g/L，乳酸钠3g/L，酵母提取物1g/L，调节pH 7.0。

9.根据权利要求5-7任一项所述的培养方法，其特征在于，所述Postgate B培养基中添加二苯砷酸。

10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述二苯砷酸添加后的浓度控制在2-10mg/L之间。

11.根据权利要求5-7任一项所述的培养方法，其特征在于，所述硫酸盐还原菌株接种到所述Postgate B培养基培养，所述硫酸盐还原菌株的接种量体积百分比为2-10％。

12.根据权利要求11所述的培养方法，其特征在于，所述硫酸盐还原菌株的接种量体积百分比为5％。

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