CN109666613A - 一种兼性自养具有硝酸盐还原亚铁氧化功能的根瘤菌及其应用 - Google Patents

一种兼性自养具有硝酸盐还原亚铁氧化功能的根瘤菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种兼性自养具有硝酸盐还原、亚铁氧化功能的根瘤菌及其应用。该菌株命名为：根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825，保藏编号为GDMCC NO：60529。本发明的根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825为具有硝酸盐还原、亚铁氧化功能的兼性自养菌，能通过硝酸盐还原、亚铁氧化作用与铁还原细菌构成铁循环，促使污染水体或沉积物中有机污染物的去除，为河道修复提供菌种和微生物制剂，同时，该根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825的研究将为其应用于河道修复和有机污染物的降解提供理论指导。

Description

一种兼性自养具有硝酸盐还原亚铁氧化功能的根瘤菌及其 应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种兼性自养具有硝酸盐还原、亚铁氧化功能的根瘤菌及其应用。
背景技术
沉积物是一个厌氧的环境，缺乏氧气等作为电子受体，是一个低氧化还原态的环境。受人类活动的影响，近几十年，大量污染物未经处理排放到环境中，其中部分污染物汇入到沉积物中。这些污染物将消耗原本仅有的电子受体如硝酸盐，硫酸盐和三价铁等，并产生氨氮，硫化物和亚铁等还原性产物。其中硫化物和亚铁形成的硫化亚铁是沉积物发黑发臭的主要原因。亚铁的存在为亚铁氧化菌的生存提供了物质条件，因此沉积物中存在着一定数量的亚铁氧化菌。亚铁氧化细菌介导的亚铁氧化作用是沉积物铁循环的重要组成部分，能为铁还原作用提供三价铁，三价铁的生成将促进铁还原过程并耦合有机污染物的降解，特别是难解决的有机污染物，如芳烃类化合物。铁还原作用在这些有机污染物的降解起到重要的驱动作用，因此，铁氧化和铁还原组成的铁循环是有机污染物降解的一个重要的驱动力。
Ciceribacter是根瘤菌科Rhizobiaceae中2013年发现的一个新属，已经报道的菌种有 Ciceribacter lividus、Ciceribacter thiooxidans和Ciceribacter azotifigens，与典型的根瘤菌属 Rhizobium等菌属类似，Ciceribacter能利用许多类型的碳源，一些菌种也可进行硝酸盐还原反应。不同的是，Ciceribacter还具有其他特有的功能，如硫氧化作用等。
发明内容
本发明的目的是提供一株兼性自养具有硝酸盐还原、亚铁氧化功能的根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825，以及一种包括所述根瘤菌(Ciceribacterferrooxidans) F8825的微生物菌剂，该菌株于2018年12月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：60529。
本发明的另外一个目的是提供所述的根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825以及相应的微生物菌剂在去除有机污染物中的应用，具体为在去除污染水体、污染沉积物或污染土壤中有机污染物中的应用。所述的根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825能通过硝酸盐还原、亚铁氧化作用，与铁还原功能细菌共同构成铁循环，促进污染水体、污染沉积物或污染土壤中有机污染物的去除。
研究发现，在某受电子垃圾污染的珠三角河道的富铁沉积物中，存在一定丰度的位于根瘤菌Ciceribacter属的细菌。本发明通过对广东顺德容桂某电子垃圾处理区河床底泥进行富集培养、分离和纯化得到菌株F8825，为根瘤菌Ciceribacter属的一个新种，命名为根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825。
本发明的根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825为具有硝酸盐还原、亚铁氧化功能的兼性自养菌，能通过硝酸盐还原、亚铁氧化作用与铁还原细菌构成铁循环，促使污染水体或沉积物中有机污染物的去除，为河道修复提供菌种和微生物制剂，同时，该根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825的研究将为其应用于河道修复和有机污染物的降解提供理论指导。
本发明的根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825，于2018年12月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：60529。
附图说明
图1是根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825的透射电镜图，其中图A为培养基 DSMZ-Medium 98中菌体形态特征图，图B为硝酸盐还原、亚铁氧化条件下菌株形态图。
图2是根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825的多位点序列分析构建的系统发育树。
图3是根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825在硝酸盐还原、亚铁氧化条件下的硝酸盐和亚铁变化图。图A为硝酸盐随时间的变化曲线，图B为亚铁随时间的变化曲线。两个图中均显示了4个处理组，分别为无菌对照组(CK)、参考菌株Ciceribacter lividusMSSRFBL1组 (MSSRFBL1)、参考菌株Ciceribacter thiooxidans F43b组(F43b)以及本发明菌株Ciceribacter ferrooxidans F8825组(F8825)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，以下实施例用于说明本发明，但不是用来限制本发明的范围，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。若无特别说明，实施例中所述方法均为常规方法，所用试剂均为常规试剂或按常规方式配制的试剂。
实施例1根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825的富集和分离
菌株F8825分离于广东顺德容桂某电子垃圾处理区河道沉积物中，该沉积物含有大量的硫化亚铁，因此沉积物呈现黑色泥质。将沉积物进行100目过筛后，取10g接种到含100 ml富集培养基的120ml顶空瓶中厌氧富集一个月。富集培养基的配方为：NH4Cl 0.5g，MgCl2·6H2O 0.5g，KH2PO4 2g，Na2S2O3·5H2O 2g，KNO3 2g，NaHCO3 1g，FeSO4·7H2O 0.1 g，去离子水1000ml，pH自然；制备方法为：将培养基中的各组分按配方量混合，灭菌。一个月后，将培养物离心收集沉淀，并转接到新鲜的富集培养基中再次富集一个月。再重复富集一遍后，取1ml混匀的富集物用固体富集培养基进行梯度稀释涂布，涂布好的平板放置厌氧二氧化碳培养箱培养1周后发现一些单菌落，所述的固体富集培养基配方为： NH4Cl 0.5g，MgCl2·6H2O 0.5g，KH2PO4 2g，Na2S2O3·5H2O 2g，KNO3 2g，NaHCO3 1g， FeSO4·7H2O 0.1g，琼脂15g，去离子水1000ml，pH自然。对这些菌落进行多次划线转接纯化。经过菌落PCR对这些菌落进行16S rRNA基因的扩增和进一步测序鉴定，发现其中的菌株F8825是位于Ciceribacter的物种，其序列与近缘菌的相似度较低。
实施例2根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825的鉴定
分别对菌株F8825进行了形态学、生理生化特征和分子分类学的鉴定。
利用根瘤菌通用培养基DSMZ-Medium 98的固体培养基对菌株F8825进行好氧培养。培养24小时后，菌株F8825的菌落大小在5～10mm范围，呈圆形，突起，表面光滑，边缘整齐，菌落形成两层结构，内部为乳白色，外部由半透明的多糖物质包裹。革兰氏染色为阴性，通过透射电镜观察发现(图1A)，菌体1.0～2.0μm长，0.6～0.8μm宽，有单一鞭毛。在固体富集培养基厌氧培养和DSMZ-Medium 98固体培养基好氧培养都能生长，说明菌株F8825既能好氧生长也能厌氧生长，既能进行自养二氧化碳固定，也能利用有机物异养生长。生长温度范围为20～42℃，最适合生长温度为37℃；生长pH范围为6.0～9.0，最适生长pH为7.5；耐盐度为3.5％。利用Biology Gen III Microplate进行碳源利用鉴定，菌株F8825能利用多种碳源，包括糖类、氨基酸、有机酸和醇类等，如乙酸盐、葡萄糖和甘露醇等。表1列举了菌株F8825与Ciceribacter thiooxidans F43b(菌株F43b)和Ciceribacter lividus MSSRFBL1(菌株MSSRFBL1)在生理生化上的差异，说明它们是不同的物种。
表1生理生化数据
提取菌株F8825的基因组进行分子分类学鉴定。基因组的提取采用CTAB法，在细菌裂解时加入RNA酶，以获得不含RNA的基因组。采用16S rRNA基因通用引物27F和1492R(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-TACGACTTAACCCCAATCGC -3’)进行PCR扩增。PCR体系为：10×PCR buffer 2.5μl，10.0mmol/L dNTP 2.0μl，10.0pmol/μl 27F引物1.0μl，10.0pmol/μl 1492R引物1.0μl，2.5U/μl Taq酶0.3μl，去离子水补足25.0μl。 PCR程序为：95℃预变性5min后，94℃变性45s、56℃退火45s、72℃延伸1.5min， 30个反应循环后，72℃延伸10min。PCR产物经引物27F和1492R分别对序列两端进行测序，对双端测序结果进行拼接得到完整的序列，结果如SEQ ID NO.1所示。与NCBI的 GenBank数据库中的16S rRNA序列进行比对，获取同源性较高的近缘菌株的序列，经过 MEGA5上的ClustalW进行重新比对和修平后，再通过DNAman计算序列相似度。结果发现，菌株F8825与菌株Ciceribacterthiooxidans F43b相似度最高(99.0％)，而与菌株 Ciceribacter lividus MSSRFBL1相似度为98.4％。进一步分别扩增atpD、glnII、gyrB、recA 和thrC基因的部分片段和测序，测序结果进行比对和修剪后与16S rRNA按 16S-atpD-glnII-gyrB-recA-thrC的顺序进行串联，构建系统发育树(图2)。结果发现，菌株 F8825位于Ciceribacter菌属的分支上，且与Ciceribacter thiooxidans F43b和Ciceribacter lividus MSSRFBL1构成不同的三个分支，说明菌株F8825可能是Ciceribacter菌属的新菌种。
将菌株F8825分别与Ciceribacter thiooxidans F43b和Ciceribacter lividusMSSRFBL1进行DNA-DNA杂交。三个菌株的总DNA分别溶解到0.1×SSC缓冲液中进行，DNA经过超声剪切处理后，通过复性速率液相杂交法测定DNA-DNA杂交率，DNA-DNA杂交率的计算公式是：D％＝[4VM—(V1 T+V2 T)]/2V1 TV2 T，DNA-DNA杂交率小于70％是物种划分的界限。结果发现菌株F8825分别与Ciceribacter thiooxidans F43b和Ciceribacter lividus MSSRFBL1的DNA-DNA杂交率分别为38.3％(±11.6％)和48.1％(±6.0％)，说明菌株F8825与Ciceribacter thiooxidans F43b和Ciceribacter lividus MSSRFBL1是不同的物种。
综上所述，经过形态学、生理生化和分子分类学的鉴定表明，菌株F8825系属于根瘤菌科 Ciceribacter属的一个新种，并命名为根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825。该菌于2018 年12月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：60529。
实施例3根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825的硝酸盐还原亚铁氧化功能
将菌株F8825(Ciceribacter ferrooxidans F8825)及参考菌株F43b(Ciceribacter thiooxidans F43b)和菌株MSSRFBL1(Ciceribacter lividus MSSRFBL1)分别接种到硝酸盐还原亚铁氧化功能验证培养基中测定亚铁氧化活性。培养基的配方为：NH4Cl 0.5g，MgCl2·6H2O 0.5g， KH2PO4 2g，FeCl2 1g，KNO3 2g，NaHCO3 1g，去离子水1000ml，pH 6.5；制备方法为：将培养基中的各组分按配方量混合，灭菌。菌体经过培养基洗涤三次后，按OD600为0.01的生物量接种到含30ml培养基的35ml顶空瓶中厌氧培养。每个菌株设3个重复，设3个无菌对照组 (CK)。分别在0、2、4、6和8天用无菌注射器取样测定硝酸盐和亚铁的浓度。硝酸盐由离子色谱法测定，亚铁浓度由邻菲罗啉分光光度法测定。结果如图3所示，菌株MSSRFBL1与无菌对照一样，硝酸盐(图3A)和亚铁(图3B)的浓度都没有显著的变化，说明菌株MSSRFBL1 没有硝酸盐还原亚铁氧化功能。菌株F8825和F43b的硝酸盐和亚铁都随着时间逐渐下降，说明这两个菌株都具有硝酸盐还原亚铁氧化功能。而菌株F8825的亚铁下降比菌株F43b更快，说明其具有更高的活性。另外，通过透射电镜观察发现，菌株F8825在进行亚铁氧化时，不会产生阻挡代谢物进入胞内的细胞外壳覆盖层(图1B)，因此能进行持续性的亚铁氧化作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)
<120> 一种兼性自养具有硝酸盐还原亚铁氧化功能的根瘤菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1397
<212> DNA
<213> 根瘤菌 F8825(Ciceribacter ferrooxidans F8825)
<400> 1
ggaacttgcc ggcagcttac acatgcaagt cgagcgcccc gcaaggggag cggcagacgg 60
gtgagtaacg cgtgggaatc tacccatccc tacggaacaa ctccgggaaa ctggagctaa 120
taccgtatac gcccttaggg ggaaagattt atcggggatg gatgagcccg cgttggatta 180
gctagttggt ggggtaaagg cctaccaagg cgacgatcca tagctggtct gagaggatga 240
tcagccacat tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtggggaata 300
ttggacaatg ggcgcaagcc tgatccagcc atgccgcgtg agtgatgaag gccttagggt 360
tgtaaagctc tttcaccgat gaagataatg acggtagtcg gagaagaagc cccggctaac 420
ttcgtgccag cagccgcggt aatacgaagg gggctagcgt tgttcggaat tactgggcgt 480
aaagcgcatg taggcggaca tttaagtcag gggtgaaatc ccggggctca acctcggaac 540
tgcctttgat actgggtgtc tagagtgtgg aagaggtaag tggaattccg agtgtagagg 600
tgaaattcgt agatattcgg aggaacacca gtggcgaagg cggcttactg gtccattact 660
gacgctgagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 720
gtaaacgatg aatgttagcc gtcgggcagt tgactgttcg gtggcgcagc taacgcatta 780
aacattccgc ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acgggggccc 840
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gcagaacctt accagctctt 900
gacatctggg tcgcggttac cggagacggt aatcttcagt tcggctggac ccgagacagg 960
tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1020
caaccctcgc ccttagttgc cagcatttgg ttgggcactc taaggggact gccggtgata 1080
agccgagagg aaggtgggga tgacgtcaag tcctcatggc ccttacgggc tgggctacac 1140
acgtgctaca atggtggtga cagtgggcag cgagaccgcg aggtcgagct aatctccaaa 1200
agccatctca gttcggattg cactctgcaa ctcgagtgca tgaagttgga atcgctagta 1260
atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320
accatgggag ttggttttac ccgaaggtag tgcgctaacc cgcaagggag gcagctaacc 1380
acgtagttac ggggggc 1397

Claims (6)

1.根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825，其保藏编号为：GDMCC NO：60529。
2.一种根瘤菌微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂包含权利要求1所述的根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825。
3.权利要求1所述的根瘤菌(Ciceribacter ferrooxidans)F8825或权利要求2所述的根瘤菌微生物菌剂在有机污染物去除中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，是在污染水体、污染沉积物或污染土壤中有机污染物去除中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的根瘤菌(Ciceribacterferrooxidans)F8825通过硝酸盐还原、亚铁氧化作用促进有机污染物的去除。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的根瘤菌(Ciceribacterferrooxidans)F8825通过硝酸盐还原、亚铁氧化作用，与铁还原功能细菌共同构成铁循环，促进污染水体、污染沉积物或污染土壤中有机污染物的去除。
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