CN115651855A

CN115651855A - 施氏假单胞菌及其产品和用途

Info

Publication number: CN115651855A
Application number: CN202210643018.8A
Authority: CN
Inventors: 洪培; 杨克胤; 疏义林; 吴海龙
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2022-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2042-06-08
Also published as: CN115651855B

Abstract

本发明提供一种施氏假单胞菌菌株，保藏编号为CCTCC NO：M20211100，拉丁学名为Pseudomonas stutzeri YC‑34，于2021年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明提供的施氏假单胞菌株YC‑34可同时实现脱氮和除铬的功能，与此同时菌株还具有良好的自聚集特性，使用方便，操作简单，降低了污水处理成本。该菌株YC‑34可制作成新型微生态菌剂，具有良好的复合废水处理应用前景。

Description

施氏假单胞菌及其产品和用途

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种施氏假单胞菌及其产品和用途。

背景技术

氮是生物圈最基本的元素之一，是大量化肥和食物的原料，但环境中过多的氮会引发氮污染，必须采取有力措施去除水体中的氮污染。

传统生物脱氮技术涉及好氧硝化和厌氧反硝化两个过程，通过硝化菌群和反硝化菌群两种不同类群进行。由于不同菌群具有不同的环境要求，这两个过程始终在不同的反应器中或在一个具有不同时间顺序的反应器中分别运行，这就导致工艺操作复杂，运行能耗和成本高。

废水中的重金属铬主要来源于劣质化妆品原料、皮革制剂、金属部件镀铬部分，工业颜料以及鞣革、橡胶和陶瓷原料等，因处理不善导致水体环境被铬污染，如误食饮用，可致腹部不适及腹泻等中毒症状，引起过敏性皮炎或湿疹，呼吸进入，对呼吸道有刺激和腐蚀作用，引起咽炎、支气管炎等。水污染严重地区，经常接触或过量摄入者，易得鼻炎、结核病、腹泻、支气管炎、皮炎等。传统的铬去除方法包括化学沉淀法、吸附法和膜分离法，均取得了良好的效果。但其去除效率低、二次污染和建设成本高的缺点也很明显。已有报道微生物可以通过吸附和还原等方式去除水体中铬，但是相关材料和方法还不完善，未能大规模利用。因此提供性能优良的微生物材料对氮和铬复合污染水体修复有积极作用。

好氧反硝化技术提供了一种克服常规反硝化技术缺点的方法，因为它只需要一个单一的反应器进行硝化/反硝化，这极大地减轻了对反应条件的控制难度。在好氧条件下将硝酸盐转化为气体。好氧反硝化菌剂强化应用虽然短期内就可以有效增加污水处理系统的脱氮效能，但菌群流失严重，无法长期稳定地维持在系统中。微生物聚集是生物膜发育和维持的关键步骤，兼具高效成膜和反硝化能力的菌株强化可以实现功能菌驻留和高效脱氮。同时，生物聚合体也为重金属吸附或聚集提供了附着位点。

现有技术中公开了多种好氧反硝化菌种，如：铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PCN-2^[1]；芸苔假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)LZ-4^[2]，鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)AL-6^[3]，皱褶念珠菌(Diutina rugosa)菌株DW 1(CN110607244B)，假单胞菌XD9(Pseudomonas alcaliphila XD9， CN111534449A)，节杆菌(Arthrobactersp.)WZUF01(CN107245463B)。

其中皱褶念珠菌菌株DW-1、假单胞菌XD9、节杆菌WZUF01、鲍曼不动杆菌AL-6、芸苔假单胞菌LZ-4、铜绿假单胞菌PCN-2的优点很明显，具有优秀的好氧反硝化能力，能够去除水体中的氮污染；同时鲍曼不动杆菌AL-6、芸苔假单胞菌LZ-4、铜绿假单胞菌PCN-2还能去除六价铬。但是皱褶念珠菌菌株DW-1、假单胞菌XD9、节杆菌WZUF01不能应对这种重金属的冲击。鲍曼不动杆菌AL-6 仅能将六价铬还原，还原后的三价铬仍然留在水体中危害环境，铜绿假单胞菌 PCN-2仅能适应0-5mg/L六价铬，不足以应对废水中的六价铬浓度，芸苔假单胞菌LZ-4在去除六价铬耗时过长难以满足实际需要。

[1]He,Da et al.“Interaction of Cr(VI)reduction and denitrification bystrain Pseudomonas aeruginosa PCN-2 under aerobic conditions.”Bioresourcetechnology vol.185(2015):346-52.

[2]Yu,Xuan et al.“Simultaneous aerobic denitrification and Cr(VI)reduction by Pseudomonas brassicacearum LZ-4 in wastewater.”Bioresourcetechnology vol.221 (2016):121-129.

[3]An,Qiang et al.“Efficient ammonium removal through heterotrophicnitrification-aerobic denitrification by Acinetobacter baumannii strain AL-6in the presence of Cr(VI).”Journal of bioscience and bioengineering vol.130,6(2020): 622-629.

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种施氏假单胞菌，该菌株的活性功能可以应用在生活污水处理、养殖废水处理和工业废水处理中。该菌株可以进行硝化和反硝化作用来去除废水中的氮，同时能对铬进行生物吸附和生物还原，将六价铬还原为三价铬，且耗时短，能满足实际需求。

一方面，本发明提供了一种施氏假单胞菌。

所述的施氏假单胞菌为施氏假单胞菌菌株YC-34，其保藏编号CCTCC NO：M20211100，拉丁学名为Pseudomonas stutzeri YC-34，于2021年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。

菌株YC-34的菌落形态：菌落呈圆形，黄色，湿润，表面光滑，菌体呈短棒状(约0.1-0.2×1-2.0μm)。

另一方面，本发明提供了一种施氏假单胞菌的制备物。

所述的制备物中包括前述的施氏假单胞菌YC-34的菌体。

所述的制备物的类型为培养物、培养物提取物、发酵液、发酵液沉淀、发酵液上清、发酵液提取物、冻干粉中的一种或多种。

所述的培养物为施氏假单胞菌YC-34接种于培养基制备。

所述的冻干粉中包括施氏假单胞菌YC-34的菌体，还可能包括冻干保护剂。

所述的冻干保护剂可以是多羟基化合物、糖、蛋白质、聚合物、氨基酸、盐、胺、表面活性剂等。

再一方面，本发明提供了一种培养前述施氏假单胞菌的方法。

所述的方法中包括将施氏假单胞菌YC-34接种于培养基。

优选地，培养基氮浓度50-100mg/L，碳氮比5-30，pH值5-9，培养温度 25-35℃，在需氧条件下进行。

优选地，所述的方法包括以下步骤：

取出保存的纯菌株样品备用；

配制反硝化培养基，121℃灭菌；

在超净工作台中将纯菌株样品接种至无菌的反硝化培养基；

放入培养箱中，等待菌株扩培完成。

在一些实施例中，所述的方法包括以下步骤：

(1)取出保存的纯菌株样品备用；

(2)配制反硝化培养基，121℃灭菌；

(3)在超净工作台中将纯菌株样品接种至无菌的反硝化培养基；

(4)放入培养箱中，等待菌株扩培完成。

又一方面，本发明提供了施氏假单胞菌YC-34和/或其制备物在污水处理中的应用。

所述的应用为将菌种扩大化培养后加入污水，或将菌种直接加入污水。

优选地，将施氏假单胞菌YC-34培养至对数期后将培养物加入污水。

优选地，所述的培养物的接种量为1％-10％；进一步优选地，所述的培养物的接种量为1％-5％；更进一步地，所述的培养物的接种量为2％。

又一方面，本发明提供了一种菌剂。

所述的菌剂中包括施氏假单胞菌YC-34。

所述的菌剂可以通过施氏假单胞菌YC-34的培养物或冻干粉进行制备。

又一方面，本发明提供了一种污水处理剂。

所述的污水处理剂中包括施氏假单胞菌YC-34和/或其制备物。

优选地，包括施氏假单胞菌YC-34培养至对数期的培养物。

又一方面，本发明提供了一种污水处理方法。

所述的污水处理方法中包括向污水中加入前述的施氏假单胞菌。

所述的施氏假单胞菌在加入时可以是培养物、发酵液、发酵液沉淀、冻干粉等形态中的一种或多种。

所述的污水处理方法中可能包括：将菌种扩大化培养后加入污水，或将菌种直接加入污水。

所述的污水中可能包括较高浓度的硝氮和/或六价铬。

所述的污水可以来源于工业废水。

所述的污水可以是电镀、制革、化工、颜料、冶金、耐火材料等行业产生的工业废水。

所述的污水可以是化工行业使用硝酸盐材料作为原料或者氧化剂产生的废水，牲畜饲料厂使用硝酸盐或者亚硝酸盐作为抗氧化剂产生的废水；炼油、铁合金等产生含有大量氨氮的废水经氧化或硝化后生成高浓度的硝态氮，等等。

本发明的有益效果：

本发明所提供的YC-34菌株具有好氧反硝化的功能，可直接将硝氮转化为气体产物，亚硝氮和氨氮积累量较少，以硝氮为唯一氮源时，30小时内将54.11mg/L NO^3--N降解至9.75mg/L，去除率达到81.98％和1.48mg/L/h，脱氮作用主要发生在第0-20h；同时可以在0-10mg/L的六价铬存在条件下去除水体中的 N和铬，在不同浓度(3、5、7、10mg/L)六价铬条件下，该菌株可以在48小时内仍然可以保持高效的NO^3--N去除率，不同六价铬浓度时的NO^3--N去除率分别为81.46％、83.61％、82.98％、81.81％，对六价铬的去除率分别为76.26％、74.15％、69.16％、58.22％。这显著高于已报道的铜绿假单胞菌PCN-2 (Pseudomonasaeruginosa PCN-2)对0-5mg/L六价铬的处理。(Interaction of Cr(VI)reduction anddenitrification by strain Pseudomonas aeruginosa PCN-2 under aerobicconditions.)

本发明提供的施氏假单胞菌株YC-34可同时实现脱氮和除铬的功能，与此同时菌株还具有良好的自聚集特性，自聚集指数最高可以达到78.48％。这表现出了该菌株对N和铬的高去除效率。同时可以做到使用方便，操作简单，降低了污水处理成本。该菌株YC-34可制作成新型微生态菌剂，具有良好的复合废水处理应用前景。

保藏说明

中文名：施氏假单胞菌YC-34；

拉丁学名：Pseudomonas stutzeri YC-34；

保藏号：CCTCC NO：M20211100；

保藏机构：中国典型培养物保藏中心；

保藏地址：中国武汉武汉大学；

保藏时间：2021年8月30日。

附图说明

图1为施氏假单胞菌株在扫描电子显微镜下的细胞形态。

图2为施氏假单胞菌株16S rDNA基因构建的系统发育树。

图3为YC-34中氮通路相关基因扩增产物的凝胶电泳图。

图4为YC-34以硝氮为唯一氮源时的氮去除情况。

图5为YC-34不同时间EPS的产生及组成情况。

图6为YC-34在培养过程中自聚集能力的变化。

图7为YC-34在不同浓度六价铬条件下对硝氮的去除情况。

图8为在不同浓度六价铬条件下对铬的去除情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

基础实验例菌株筛选

将5mL活性污泥接种至反硝化富集培养基，培养三天后取5mL接种至新鲜反硝化富集培养基，重复5轮，将最后一轮培养液梯度稀释涂布至反硝化鉴别培养基，挑选出目的菌落，划线纯化后利用反硝化测试培养基验证，最终获得施氏假单胞菌菌株YC-34。

实施例1菌株YC-34形态学和分子生物学鉴定

本发明菌株YC-34的菌落形态：菌落呈圆形，黄色，湿润，表面光滑，菌体呈短棒状(约0.1-0.2×1-2.0μm)。图1为施氏假单胞菌株在扫描电子显微镜下的细胞形态。

分子生物学鉴定：利用16S rDNA基因的扩增通用引物(SEQ ID NO.1-2)，以YC-34菌液作为模板进行PCR扩增，得到PCR产物共有1375bp(SEQ ID NO.3)；所述序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST检索程序系统进行序列同源性分析，发现与施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的16S rDNA基因序列相似度为100％。图2为施氏假单胞菌株16S rDNA基因构建的系统发育树。

根据本发明所述菌株的形态特征、生理生化性质和分子生物学鉴定特征，鉴定该菌株属于施氏假单胞菌，并命名施氏假单胞菌YC-34(Pseudomonas stutzeri YC-34)。并于2021年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号 CCTCC NO：M20211100。

实施例2施氏假单胞菌YC-34的培养方法

将施氏假单胞菌YC-34接种于富氮废水培养基中，在25-35℃，90-200r/min 恒温振荡培养，得到种子液。

所述的富氮废水培养基包括以下成分：

六水合丁二酸钠16.67g/L，

KH₂PO₄ 0.2g/L，

MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，

KNO₃ 0.36g/L，

微量元素2mL/L，

pH7.0-7.3。

微量元素中包括：FeCl₂·4H₂O 1.8g/L，CoCl₂·6H₂O 0.25g/L，NiCl₂·6H₂O0.01g/L，CuCl₂·2H₂O 0.01g/L，MnCl₂·4H₂O 0.70g/L，ZnCl₂ 0.1g/L，H₃BO₃ 0.5g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.03g/L，NaSeO₃·5H₂O 0.01g/L。

实施例3YC-34氮通路相关基因的扩增

对YC-34中氮通路相关基因进行扩增，包括：nirS、norR、nosZ和napA基因，扩增引物如下：

扩增体系为25μL体系，其中包括：2xES Taq Master Mix 12.5μL，上游引物和下游引物各1.0μL模板0.5μL，双蒸水10μL；

扩增条件为：95℃预变性5min；然后进行35个循环：94℃，30s；退火1 min(57℃，59℃，58℃，69℃)；72℃延伸10min。

扩增结果见图3，其中M为Marker。表明，菌株YC-34呈现完整的反硝化通路，成功扩增出周质硝酸盐还原酶基因、亚硝酸盐还原酶基因，一氧化氮还原酶基因，氧化亚氮还原酶基因。

实施例4菌株YC-34在富氮废水中的除氮及胞外聚合物产生情况

将菌株YC-34培养至对数期，按2％的接种量接种于富氮废水培养基中，在温度30℃，摇床转速150r/min，培养60小时，常规方法测定处理前后总氮、氨氮、硝态氮和亚硝氮的含量变化，同时设置一组培养基曝氧气后接种，同等条件下密封培养，抽取顶空气体，常规方法测定氧化亚氮和氮气的浓度，用于氮平衡分析。经过30小时的培养，废水中硝氮的去除率为81.98％，氨氮和亚硝氮的积累量少(接近0)，如图4。氮平衡分析显示大部分硝氮通过好氧反硝化作用直接转化为气体产物，氨氮和亚硝氮积累量较少。

在12h、24h、36h、48h、60h分别检测培养基中胞外聚合物(蛋白、多糖) 的含量，结果表明胞外聚合物在36小时达到最大值(见图5)。菌株YC-34产生大量的胞外聚合物，自聚集指数达到78.48％(图6)。

实施例5菌株YC-34对铬离子的耐受及去除情况

将菌株YC-34培养至对数期，按2％的接种量接种至富氮废水培养基(分别加入3，5，7和10mg/L的铬离子)中，在温度30℃，摇床转速150r/min，培养48小时，测定处理前后硝氮、六价铬和总铬的含量变化，10mg/L的铬离子浓度胁迫下，硝氮的去除率仍然高达81.81％(见图7)，六价铬的去除率达到58.23％ (见图8)。

实施例6菌株YC-34铬离子的耐受上限

在实施例5的基础上对菌株YC-34铬离子的耐受上限进行检测，参照实施例5，设置富氮废水培养基(分别加入15，20，25和30mg/L的铬离子)，最终菌株YC-34在20mg/L的铬离子条件下硝氮的去除率为12.35％，六价铬的去除率为9.24％，在25mg/L的铬离子条件下硝氮去除率和六价铬都基本无效果，因此YC-34铬离子的耐受上限在20-25mg/L。

再次设置铬离子梯度浓度实验，参照实施例5，设置富氮废水培养基(分别加入21，22，23和24mg/L的铬离子)，最终测定菌株YC-34铬离子的耐受上限在22mg/L。

序列表

<110> 安徽师范大学

<120> 施氏假单胞菌及其产品和用途

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttgctccat gattcagcgg cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc ctggtagtgg 60

gggacaacgt ttcgaaagga acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagtggggga 120

tcttcggacc tcacgctatc agatgagcct aggtcggatt agctagttgg tgaggtaaag 180

gctcaccaag gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca ctggaactga 240

gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc 300

ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga ttgtaaagca ctttaagttg 360

ggaggaaggg cagtaagtta ataccttgct gttttgacgt taccaacaga ataagcaccg 420

gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata cgaagggtgc aagcgttaat cggaattact 480

gggcgtaaag cgcgcgtagg tggttcgtta agttggatgt gaaagccccg ggctcaacct 540

gggaactgca tccaaaactg gcgagctaga gtatggcaga gggtggtgga atttcctgtg 600

tagcggtgaa atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg cgaaggcgac cacctgggct 660

aatactgaca ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 720

cacgccgtaa acgatgtcga ctagccgttg ggatccttga gatcttagtg gcgcagctaa 780

cgcattaagt cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg 840

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 900

aggccttgac atgcagagaa ctttccagag atggattggt gccttcggga actctgacac 960

aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgtaacga 1020

gcgcaaccct tgtccttagt taccagcacg ttaaggtggg cactctaagg agactgccgg 1080

tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggcctgggct 1140

acacacgtgc tacaatggtc ggtacaaagg gttgccaagc cgcgaggtgg agctaatccc 1200

ataaaaccga tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc 1260

tagtaatcgt gaatcagaat gtcacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1320

gtcacaccat gggagtgggt tgctccagaa gtagctagtc taaccttcgg gggga 1375

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tctggaccat gggcttcaac ca 22

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acgacgaccg gccagcgcag 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gaacctcaag accactacca tc 22

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccttccagtt gtgctcctt 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggaaatgacc aagaacgagc 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aggtagcaga ccagaccgat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtaaccttg acaacaccga 20

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgacgaagc cgtgagaca 19

Claims

1.一种施氏假单胞菌菌株，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO：M20211100，拉丁学名为Pseudomonas stutzeriYC-34，于2021年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.一种施氏假单胞菌的制备物，其特征在于，所述的制备物中包括权利要求1所述的施氏假单胞菌的菌体。

3.根据权利要求2所述的制备物，其特征在于，所述的制备物的类型为培养物、培养物提取物、发酵液、发酵液沉淀、发酵液上清、发酵液提取物、冻干粉中的一种或多种。

4.一种培养权利要求1所述的施氏假单胞菌的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的施氏假单胞菌接种于培养基。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，培养基氮浓度50-100mg/L，碳氮比5-30，pH值5-9，培养温度25-35℃，在需氧条件下进行。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

取出保存的纯菌株样品备用；

配制反硝化培养基，121℃灭菌；

在超净工作台中将纯菌株样品接种至无菌的反硝化培养基；

放入培养箱中，等待菌株扩培完成。

7.权利要求1所述的施氏假单胞菌和/或权利要求2-3任一项所述的制备物在污水处理中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将菌种扩大化培养后加入污水，或将菌种直接加入污水。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的施氏假单胞菌培养至对数期后将培养物加入污水。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的培养物的接种量为1％-10％。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的培养物的接种量为1％-5％。

12.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的施氏假单胞菌。

13.一种污水处理剂，其特征在于，包括权利要求1所述的施氏假单胞菌和/或权利要求2-3任一项所述的制备物。

14.根据权利要求13所述的污水处理剂，其特征在于，包括权利要求1所述的施氏假单胞菌培养至对数期的培养物。

15.一种污水处理方法，其特征在于，包括向污水中加入权利要求1所述的施氏假单胞菌和/或权利要求2-3任一项所述的制备物。