CN110452840B

CN110452840B - 一株白色杆菌及其在还原六价铬中的应用

Info

Publication number: CN110452840B
Application number: CN201910681909.0A
Authority: CN
Inventors: 柴立元; 丁春连; 黎佳未; 杨志辉; 石岩
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2039-07-26
Also published as: CN110452840A

Abstract

本发明涉及一株白色杆菌及其在还原六价铬中的应用，属于环境微生物技术领域。本发明提供的白色杆菌Leucobacter chromiireducens LYC‑2分离自制革废水，已于2018年10月19日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC NO.16823。该菌株对六价铬的耐受能力达30g/L，且菌株LYC‑2的培养和还原六价铬的过程均可以在好氧、常压、较宽的温度范围(25‑35℃)及较宽的pH范围(pH 7‑11)条件下进行，能有效地将高毒性的六价铬还原为低毒性的三价铬。该菌培养方法简易、繁殖快、周期短，在六价铬污染处理中具有重要的应用前景。

Description

一株白色杆菌及其在还原六价铬中的应用

技术领域

本发明涉及一株白色杆菌及其在还原六价铬中的应用，属于环境微生物技术领域。

背景技术

铬在铬盐制造、电镀、印染、鞣革、木材防腐、石油开采等方面都有广泛的应用，在这些生产过程中产生大量的含铬废渣和废水，严重威胁人类健康。据报道，饮用受到铬污染的水，可致腹泻；铬还会引起过敏性皮炎或湿疹；铬对呼吸道也有一定的腐蚀作用；铬还是致癌因子和致突变因子。

自然界中，铬通常以三价铬(Cr(III))和六价铬(Cr(VI))两种形态存在，且在特定条件可以相互转化。三价铬相对稳定，是生物体内必需的微量元素之一，在水中容易形成沉淀，实现固液分离达到去除目的；而六价铬毒性大、迁移能力强、氧化性强，是公认的致癌物之一，毒性是三价铬的约100倍。因此，把毒性强的Cr(VI)还原为Cr(III)，是减少环境中铬污染的主要途径。

对于铬污染的治理，传统的物理或化学方法存在能耗高、使用大量的化学试剂、处理成本高其存在二次污染等问题。因此，微生物处理铬污染因其成本低、解毒彻底、无二次污染等被看作是一种具有很大应用潜力的策略。但目前分离的细菌对六价铬的耐受能力较低，限制了微生物还原在高铬环境下的推广和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有超强六价铬耐受能力的细菌及其应用。

一株白色杆菌(Leucobacter chromiireducens)LYC-2，其保藏号为CGMCCNO.16823。

所述的白色杆菌，对六价铬的耐受浓度不超过30g/L。

所述的白色杆菌，培养条件为：好氧，温度25～35℃，pH为7～11。

所述的白色杆菌，液体培养基为：蛋白胨1～5％，酵母浸粉0.1～5％，NaCl 0.1～3％，水定容至1000mL；固体培养基为：蛋白胨1-5％，酵母浸粉0.1-5％，NaCl 0.1-3％，琼脂1.5-2％，水定容至1000mL。

所述的白色杆菌，菌落呈圆形、乳黄色、表面光滑，菌落直径为0.5～1.0mm，100000×电子显微镜下观察为具有平行边和圆端的短杆菌。

本发明所述的白色杆菌在还原六价铬中的应用。

所述的白色杆菌在48小时内能100％还原100mg/L的六价铬，96小时能100％还原300mg/L的六价铬。

具体应用时将扩大培养到OD600＝0.8～1.0的白色杆菌液按10％的体积比接种到含的Cr(VI)的液体LB培养基中进行六价铬还原。

进一步的，将所述的白色杆菌在好氧、常压、25-35℃、pH 7-11条件下应用于含六价铬废水的处理。

本发明涉及的微生物经鉴定为白色杆菌(Leucobacter chromiireducens)LYC-2，该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年11月26日，保藏编号为：CGMCC NO.16823。

本发明所涉及菌株是从湖南长沙某制革厂的制革废水中分离出的革兰氏阴性细菌，菌落呈圆形、乳黄色、表面光滑，菌落直径为0.5～1.0mm，电子显微镜下(100000×)观察为具有平行边和圆端的短杆菌。白色杆菌(Leucobacter chromiireducens)LYC-2在好氧、常压、一定的温度范围(25-35℃)及较宽的pH范围(pH 7-11)条件下表现超强的六价铬耐受能力，且能有效还原一定浓度的六价铬。

本发明还对于目前现有技术中的一些具有六价铬还原能力的菌株进行了比较研究，发现本发明菌株LYC-2的六价铬耐受能力是有显著优势的。

如：Leucobacter chromiireducens CRB2，a new strain with high Cr(VI)reduction potential isolated from tannery-contaminated soil(Fez,Morocco)AnnMocrobiol DOI 10.1007/s13213-015-1125-y.中的菌株Leucobacter chromiireducensCRB2。

又如：从北纳生物公司购买的一株铬还原能力优异的同属细菌Leucobacter sp.，编号为BNCC 195677，分别探究了Cr(VI)耐受和还原能力。

又如：朱文杰；Leucobacter sp.CRB1菌还原铬(VI)的机理及其在铬渣解毒中的应用[D]；中南大学；2008年中提及的菌株Leucobacter sp.CRB1。

本发明中的LYC-2与Leucobacter chromiireducens CRB2、Leucobacter sp.BNCC195677和Leucobacter sp.CRB1比较：

所以，在相同的培养条件下，白色杆菌属(Leucobacter)均表现出一定的Cr(VI)耐受和还原能力，其中LYC-2与CRB2、BNCC 195677的还原能力相当，但LYC-2的Cr(VI)耐受能力明显强于其他细菌，使得LYC-2的应用范围更广。本发明具有积极有益的效果：

本发明首次采集分离到具有超强六价铬耐受能力的白色杆菌(Leucobacterchromiireducens)LYC-2，对六价铬的耐受能力达30g/L。菌株LYC-2的培养和还原六价铬的过程均可以在好氧、常压、较宽的温度范围(25-35℃)及较宽的pH范围(pH 7-11)条件下进行。

本发明所涉及的白色杆菌Leucobacter chromiireducens LYC-2已于2018年11月26日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中(CGMCC)提交生物保藏。

附图说明

图1：菌株LYC-2在固体培养基上的生长情况和菌落形态；

图2：菌株LYC-2在不同浓度Cr(VI)中生长的扫描电镜图；

图3：菌株LYC-2的16S rRNA系统发育树；

图4：菌株LYC-2对六价铬的耐受能力；

图5：菌株LYC-2在六价铬还原中的应用。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的使用范围并不仅限于此。

实施例1：超强六价铬耐受菌的分离、鉴定

第一步：细菌的分离

从制革厂废水排放口取回废水样本，对其进行富集培养，在明确获得有效菌种后进行平板分离，挑取专性菌种进行纯培养，逐步提高六价铬的浓度，得到具有超强六价铬耐受能力的细菌。

第二步：菌落形态观察

将菌株Leucobacter chromiireducens LYC-2在LB平板上进行划线分离，48h后观察菌株在固体平板上的菌落形态特征：菌落呈圆形、乳黄色、表面光滑，菌落直径为0.5～1.0mm(图1)。

第三步：菌体革兰氏染色

将菌体制片，进行革兰氏染色，用带拍摄装置的光学显微镜观察该菌株的革兰氏染色呈阴性。

第四步：扫描电镜观察细菌微观形态

将菌株Leucobacter chromiireducens LYC-2在LB培养基中培养12-16h，用phenon-world台式扫描电子显微镜进行观测和拍摄。实验方法如下：

(1)收集菌体：8000rpm离心5min收集菌体，弃上清；

(2)固定、脱水：使用2.5％的戊二醛固定4h→磷酸缓冲液反复清洗三次→1％锇酸处理5h→缓冲液反复清洗3次→梯度乙醇脱水，30％、50％、70％、85％、95％各一次，100％乙醇2次，每次脱水需15min→乙酸异戊酯进行置换(2次)，每次20min(每步均需离心，8000rpm，4min，去掉上清，倒入下一种试剂，吹打几次，打散菌块)

(3)干燥：普通定性滤纸剪裁后制成袋装，将离心浓缩后的细菌菌液滴入纸袋，并封好袋口。放入临界点干燥器样品室，进行CO₂临界点干燥。

(4)喷金：用双面胶将载玻片黏在样品台上，喷金，电镜观察。

扫描电镜(100000×)结果显示：LYC-2具有平行边和圆端的短杆菌，细菌的长度为800nm～1.5μm，其尺寸在六价铬的刺激下发生变化，主要表现为随着六价铬浓度的增加，细菌由短杆状变成了长杆状(图2)，菌体形态的变化使得细菌能有效适应极端的外界环境。

第五步：16S rRNA分子鉴定

(1)菌株DNA的提取

使用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根，中国北京)提取菌株基因组DNA。

(2)16S rRNA的基因扩增

A.PCR反应引物

27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT

B.在冰上建立PCR反应体系:2×Taq PCR Mastermix 12.5μL，27F 1μL，1492R 1μL，DNA template 1μL，ddH₂O补足至25μL。

C.扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸45sec，32个循环；72℃下延伸为双链5min。最后将系统稳定在4℃。取5μL的PCR产物，在1％的琼脂糖凝胶120V下电泳45min，电泳冲液为0.5×TAE，然后用溴化乙锭(EB)染色检验扩增产物。扩增产物的检测由上海生工生物工程有限公司完成。

(3)构建系统发育树

序列同源性搜索使用Blast进行在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行。并应用MEGA 4.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis,version 4.0)与数据库中相似菌株的16S rDNA序列(见序列表)进行比对，建立菌株16S rDNA系统发育树。

系统发育树结果显示：LYC-2属于Leucobacter属，与Leucobacterchromiireducens strain L-1(NR042287.1)的系统发育距离近，因此LYC-2被鉴定为Leucobacter chromiireducens LYC-2(图3)。

实施例2细菌的六价铬耐受能力

第一步细菌的活化

从LYC-2的平板上挑取单菌落到20mL的LB液体培养基中过夜培养，然后转接到100mL的LB液体培养基中扩大培养。

第二步细菌的六价铬耐受能力

将扩大培养到OD600＝0.8～1.0的菌液按10％的体积比接种到含不同浓度(1～35g/L)的Cr(VI)的LB培养基中，每隔一段时间取样测定OD600以检测细菌的生长情况，绘制不同浓度Cr(VI)下细菌的生长曲线。

结果显示：Leucobacter chromiireducens LYC-2在好氧、常压、30℃、pH＝9条件下，当Cr(VI)浓度为0～20g/L时，LYC-2生长状况良好；当浓度为25～30g/L时，生长量开始降低，但不是很显著，当浓度为35g/L时，细菌的生长几乎被完全抑制。因此，LYC-2对六价铬的耐受能力达30g/L(图4)。后续试验证实本发明菌株LYC-2在25-35℃，及pH 7-11条件下均能达到上述相当的六价铬耐受效果，说明本发明菌株LYC-2在较宽的温度范围和较宽的pH范围内都有较好的六价铬耐受能力。

实施例3细菌在六价铬还原中的应用

第一步细菌的活化

同实施例2中第一步。

第二步细菌还原六价铬

将扩大培养到OD600＝0.8～1.0的菌液按10％的体积比接种到含不同浓度(50～500mg/L)的Cr(VI)的LB培养基中，每隔一段时间取样测定培养基剩余的六价铬的浓度，已检测细菌的还原六价铬的情况，绘制不同浓度Cr(VI)下细菌还原六价铬的还原曲线。

结果显示：Leucobacter chromiireducens LYC-2在好氧、常压、30℃、pH＝9条件下，48小时内能完全还原100mg/L的六价铬，96小时能100％还原300mg/L的六价铬，表现出较强的六价铬还原能力，可应用于实际废水的处理(图5)。后续试验证实本发明菌株LYC-2在25-35℃及pH 7-11条件下均能达到上述相当的六价铬还原效果，说明本发明菌株LYC-2在较宽的温度范围和较宽的pH范围内都有较好的六价铬还原能力。

序列表

<110> 中南大学

<120> 一株白色杆菌及其在还原六价铬中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1432

<212> DNA

<213> 白色杆菌(Leucobacter chromiireducens)

<400> 3

caaagtgcgg catgctacca tgcaagtcga acgatgaagc ccagcttgct gggtggaaga 60

gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgagcaa cctgcccttc actctgggat aagcactgga 120

aacggtgtct aatactggat atgcacaatg gccgcatggt ctgttgtggg aaagatttat 180

cggtgaagga tgggctcgcg gcctatcagc ttgttggtga ggtagtggct caccaaggcg 240

acgacgggta gccggcctga gagggtgacc ggccacactg ggactgagac acggcccaga 300

ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagcaac 360

gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt ttagtaggga agaagcgaaa 420

gtgacggtac ctgcagaaaa agcaccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 480

agggtgcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagagc tcgtaggcgg cttgtcgcgt 540

ctgctgtgaa aacccgaggc tcaacctcgg gcctgcagtg ggtacgggca ggctagagtg 600

cggtagggga gattggaatt cctggtgtag cggtggaatg cgcagatatc aggaggaaca 660

ccgatggcga aggcagatct ctgggccgta actgacgctg aggagcgaaa gcatggggag 720

cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg ttgggaacta gatgtagggc 780

ctgttccacg ggttctgtgt cgtagctaac gcattaagtt ccccgcctgg ggagtacggc 840

cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgcggat 900

taattcgatg caacgcgaag aaccttacca aggcttgaca tatagaagaa cgctgtagag 960

atacagcact ctttggacac ttctatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1020

tgagatgttc ggttaagtcc ggcaacgagc gcaaccctcg tcctatgttg ccagcacgtt 1080

atggtgggaa ctcatgggat actgccgtgg tcaacacgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140

aatcatcatg ccccttatgt cttgggcttc acgcatgcta caatggccga tacaaagggc 1200

tgcgataccg cgaggtggag cgaatcccaa aaagtcggtc tcagttcgga ttggggtctg 1260

caactcgacc ccatgaagtc ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcaacg ctgcggtgaa 1320

tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcaagtcatg aaagtcggta acacccgaag 1380

ccggtggcct aacccctcgt gggagggagc cgtcgaaggt gcactattcc tt 1432

Claims

1.一株白色杆菌(Leucobacter chromiireducens) LYC-2，其保藏号为CGMCC NO.16823。

2.权利要求1所述的白色杆菌在还原六价铬中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将扩大培养到OD600=0.8-1.0的白色杆菌液按10%的体积比接种到含六价铬的液体LB培养基中，在好氧、常压、30℃、pH值为9的条件下48小时内能100%还原100 mg/L的六价铬，96小时能100%还原300 mg/L的六价铬。