CN114410552B

CN114410552B - 一株氧化硫的盖氏假单胞菌及其在黑臭水体空气中降硫应用

Info

Publication number: CN114410552B
Application number: CN202210310354.0A
Authority: CN
Inventors: 邱建贺; 翁雯; 周国彪; 梁锡伟
Original assignee: Foshan City Yuhuang Ecological Environment Science And Technology Co ltd
Current assignee: Yuhuang Ecological Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2022-03-28
Filing date: 2022-03-28
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2042-03-28
Also published as: CN114410552A

Abstract

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株氧化硫的盖氏假单胞菌及其在黑臭水体空气中降硫应用。本发明提供一株盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4，保藏号为CCTCC NO：M 2022149。本发明的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4在温度25~37℃范围内能够有效的降解硫代硫酸盐，而且降解率达到了95%以上。用本发明的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4制备的菌剂，在黑臭水体逸散的空气中喷洒，能够有效降低空气中硫化氢浓度，改善空气质量。

Description

一株氧化硫的盖氏假单胞菌及其在黑臭水体空气中降硫应用

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株氧化硫的盖氏假单胞菌及其在黑臭水体空气中降硫应用。

背景技术

随着中国经济发展和城市化进程的加快，大量未经处理的生活污水和工业废水排入到城市河流之中，使得水体的氮( N) 、磷( P) 、硫( S) 等污染物严重超标，水体的自净能力丧失，导致城市河道出现季节性黑臭甚至终年黑臭。黑臭水体中的污染物如硫元素以硫化氢的形式逸散到空气中，从而影响空气质量，进而威胁居民的身心健康。

黑臭水体的研究大多集中在水体治理方面，如通过生化法、膜法、化学氧化法等技术去除水体中有机污染物等，然而对直接去除黑臭水体释放到空气中硫化氢的研究较少。利用微生物技术解决环境污染问题是一种有优势的技术，该技术依靠微生物活性，将污染物逐步降解，从而改善环境质量。同时由于微生物的持续繁殖，能够在环境中存活，从而能够持续的发挥功能，保持良好的环境质量。利用微生物技术解决环境污染问题，关键在于找到高效的功能微生物，同时该微生物还具有良好的环境适应性，能够在不同的条件下存活，并发挥污染物降解功能。因此，解决黑臭水体释放到空气中硫化氢污染物，首先需要找到一株能够降解硫的功能微生物，同时微生物的环境适应性如在不同温度或者不同含氧浓度的条件下能否存活以及发挥降硫功能亟待明确。

发明内容

鉴于以上问题，本发明的目的在于提供一株氧化硫的盖氏假单胞菌及其在黑臭水体空气中降硫应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一株盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4，该菌株于2022年 2 月 24 日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号：CCTCC NO：M 2022149。

所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4生长条件至少满足以下之一：温度20~37℃，转速100~250 rpm。

所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4用于降解硫代硫酸钠至少满足以下条件之一：温度20~37℃，转速100~250 rpm。

所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4在温度30 ℃、转速200 rpm的条件下，针对初始浓度50 mmol/L的硫代硫酸钠，反应16 h时，硫代硫酸钠降解率均达到96.4%以上。降解率通过下述方法检测：

（1）在250 mL的三角烧瓶中加入50 mL验证培养基，按照1%的接种量（验证培养基体积的1%）接种盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4；

（2）验证培养基中加入50 mmol/L硫代硫酸钠，用于验证盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4降解硫代硫酸钠的能力；

（3）将加入硫代硫酸钠的三角烧瓶放入恒温培养振荡器中培养，微生物在生长过程降解硫代硫酸钠。培养结束后取出一定量的样品检测硫代硫酸钠的浓度。

（4）利用离子色谱分别测定初始时和16 h时三角烧瓶中硫代硫酸钠的浓度。根据公式

计算得到16 h硫代硫酸钠的降解率为96.4%：

[c(0) – c(16)] / c(0)×100%

其中，c(0)为三角烧瓶中初始硫代硫酸钠浓度；c(16)为16 h三角烧瓶中硫代硫酸钠浓度。

本发明第二方面提供一种盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4在黑臭水体空气中降解硫的应用。

本发明提供应用步骤，所述步骤至少包括如下步骤：

（1）培养盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4制得微生物菌剂；

（2）取一定量的微生物菌剂在黑臭水体的空气中进行喷洒，降解空气中的硫。

优选地，所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4，保藏号为CCTCC NO：M2022149。

优选地，所述微生物菌剂中盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4含量不少于5×10⁸ CFU/mL。

优选地，所用的微生物菌剂的喷洒量为100mL/m²。

如上所述，本发明盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4制备的微生物菌剂喷洒在黑臭水体的空气中，能够降解空气中的硫化氢。

附图说明

图1为本发明中盖氏假单胞菌P4培养16 h的菌落形态；

图2为本发明盖氏假单胞菌P4在不同温度的生长情况；

图3为本发明盖氏假单胞菌P4在不同温度降解硫代硫酸钠情况；

图4为本发明盖氏假单胞菌P4在不同转速的生长情况；

图5为本发明盖氏假单胞菌P4在不同转速降解硫代硫酸钠情况。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一株盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4。

本发明提供的菌株是研究室保存的，并于2022年02 月 24 日在中国典型培养物保藏中心(简称 CCTCC)保藏，地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏号：CCTCCNO：M 2022149。

所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4，生长温度范围20 ~37℃，转速100~250 rpm。

所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4，降解硫代硫酸钠的温度范围20~37℃，转速100~250 rpm。

所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4在温度25~37℃、转速200 rpm条件下培养16 h时，根据公式

计算得到硫代硫酸钠的降解率均达到95 %以上：

[c(0) – c(16)] / c(0)×100%

其中，c(0)为三角烧瓶中初始的硫代硫酸钠的浓度；c(16)为16 h时三角烧瓶中硫代硫酸钠的浓度。

本发明第二方面提供了所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4在黑臭水体空气中降解硫的应用。

所述盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4在黑臭水体空气中降解硫的应用，至少包括如下步骤：

（1）使用糖蜜培养基培养盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4，制得微生物菌剂；

（3）取一定量的微生物菌剂均匀喷洒在黑臭水体的空气中，进行降解硫的应用。

进一步的，所述糖蜜培养基组成为：糖蜜 20.0 g/L，酵母提取物2.0 g/L，KH₂PO₄0.25 g/L，K₂HPO₄ 1.0 g/L，MgCl₂ 0.2 g/L；调节pH值为6.8。

进一步的，所述盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4的保藏号为CCTCC NO：M2022149。

进一步的，所述微生物菌剂中盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4的含量不少于5×10⁸ CFU/mL。

进一步的，所述微生物菌剂的喷洒量为100mL/m²。

实施例1：氧化硫的盖氏假单胞菌P4的筛选及鉴定

本发明所述的盖氏假单胞菌P4，筛选样品采集于黑臭水体。

富集培养：

取5 mL采集的样品，加到装有100 mL富集培养基的三角烧瓶中，置于恒温培养振荡器上培养。

富集培养基组成：LB培养基（酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L）添加10 mmol/L Na₂S₂O₃；调节pH值为6.8。

培养条件为30 ℃、转速200 rpm，培养36 h后结束。结束后取出5 mL培养物接种于新鲜的富集培养基中传代培养，传代条件与上述培养条件一致，传代2~3次结束培养。最终的培养物用于分离目标微生物。

分离纯化：

将经过富集培养的培养物梯度稀释，均匀涂布在固体LB培养基上。

固体LB培养基组成：琼脂粉 15.0 g/L，胰蛋白5.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，氯化钠10 .0 g/L；调节pH值为6.8。

涂布完成后，平板倒置在30 ℃的恒温培养箱中，培养36 h结束。根据平板上长出的单菌落，依据菌落的形态差异，挑选到6株不同形态的微生物，分别编号为1、2、3、4、5，验证其降解硫代硫酸钠的能力。

降解硫代硫酸钠功能的验证：

验证培养基组成： LB培养基（酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，氯化钠10.0 g/L）添加50 mmol/L Na₂S₂O₃。

将挑选的5株微生物分别用LB培养基培养12 h，然后按照1%的接种量接种于装有50 mL验证培养基的三角烧瓶中，接种后分别取出2 mL培养基，即0 h样品，用于检测初始硫代硫酸钠的浓度。然后将装有剩余验证培养基的三角烧瓶置于恒温培养振荡器中培养，控制温度30 ℃，转速200 rpm。培养16h结束培养。分别取出2mL的培养物，即16h的样品，用于检测培养16h后培养基中残留的硫代硫酸钠。

将0h和16h取出的培养液，控制12000g的条件下离心10min，离心后的上清液用于测定硫代硫酸钠浓度。硫代硫酸钠浓度用离子色谱测定，色谱柱为岛津公司生产的IC-A3型号离子色谱柱，流动相为8 mmol/L对羟基苯甲酸、3.2 mmol/L Bis-Tris，50 mmol/L的硼酸，流速1.0 mL/min。

硫代硫酸钠降解率根据公式

计算得到：

[c(0) – c(16)] / c(0)×100%

其中，c(0)为三角烧瓶中初始硫代硫酸钠浓度；c(16)为16h时三角烧瓶中硫代硫酸钠浓度。

反应16 h后5株菌对硫代硫酸钠的降解率如表1。其中编号为4的菌株降解硫代硫酸钠能力最为突出，降解率基本达到了96.4%。

表1 菌株对硫代硫酸钠的降解能力

菌株	1	2	3	4	5
						硫代硫酸钠的降解率 %	38.14	64.5	76.4	96.4	25.6

编号4菌株的鉴定：使用AXYGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，提取编号4菌株的基因组，并以此为模板扩增16S rDNA。

扩增引物分别为27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT

PCR反应体系（50 μL）：模板DNA 1.0 μL，KOD mix 25.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 12.0 μL。

PCR程序：98 ℃ 5 min，98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 90 s，循环30次，68 ℃10 min，16 ℃ 10 min。

PCR产物的纯化和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。测序得到编号4菌株的16S rDNA序列，长度1389 bp，核酸序列如SEQID NO.1所示。该序列经过NucleotideBLAST分析，与NCBI数据库中假单胞菌CIP 105469（NCBI序列号：NR-024928.1）碱基，相似性达到99%。同时结合细菌的形态特征、生长特性确定筛选的编号4菌株为盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii，将其命名为Pseudomonas gessardii P4。

盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4的生物学特征如下：革兰氏阴性，短杆状，菌体大小为（0.4~1.0）×（1.0~3.5）μm，菌落直径2.0~4.0 mm，菌落圆形、表面光滑、边缘整齐。

将筛选到的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称 CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏日期：2022年 02 月 24 日，保藏号：CCTCC NO：M 2022149。

实施例2：盖氏假单胞菌P4在不同条件下的性能

通过考察盖氏假单胞菌P4在不同温度、不同转速条件下，菌株生长情况以及降解硫代硫酸钠的能力，明确盖氏假单胞菌P4的性能。具体实验如下：

（1）温度：将盖氏假单胞菌P4接种在上述验证培养基中，控制不同温度，验证菌株的生长情况以及降解硫代硫酸钠的能力。控制培养温度分别为15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃。每隔一定时间取出1ml的培养基，利用分光光度计测定菌体的生长情况（OD₆₀₀），离心后的上清液利用离子色谱测定硫代硫酸钠的浓度。培养16h结束。

盖氏假单胞菌P4在不同温度的生长情况如图2所示。盖氏假单胞菌P4高温42℃基本不生长，在20~37 ℃均能够生长，尤其在25℃、30 ℃的范围内生长良好，培养16 h后OD₆₀₀达到6.0以上；

盖氏假单胞菌P4在不同温度降解硫代硫酸钠的情况如图3所示。降解硫代硫酸钠的规律与菌株在不同温度下生长情况的规律相近。在高温42℃几乎不降解硫代硫酸钠，在15~37 ℃的范围内均能够降解硫代硫酸钠,尤其在25~37 ℃范围内，硫代硫酸钠16h的降解率达到95%以上。

（2）转速：将盖氏假单胞菌P4接种在上述验证培养基中，控制不同转速，验证菌株的生长情况以及降解硫代硫酸钠的能力。控制转速分别为100 rpm、150 rpm、200 rpm、250rpm。培养过程，每隔一定时间取出1ml的培养基，利用分光光度计测定菌体的生长情况（OD600），离心后的上清液利用离子色谱测定硫代硫酸钠的浓度。培养16h结束。

盖氏假单胞菌P4在不同转速的生长情况如图4所示。盖氏假单胞菌P4在转速100rpm~250 rpm均生长良好，其中在150 rpm~250 rpm的范围内生长较好，培养16 h后OD600达到4.243~6.247；

盖氏假单胞菌P4在不同转速降解硫代硫酸钠的情况如图5所示。盖氏假单胞菌P4在转速100 rpm~250 rpm对硫代硫酸钠的降解率较高，降解16h后，降解率均达到了95%以上。

实施例3：盖氏假单胞菌P4在黑臭水体的空气中降解硫的应用

微生物菌剂的制备：将盖氏假单胞菌P4用LB培养基培养12 h，然后按照1%的接种量接种于装有50 mL糖蜜培养基的三角烧瓶中，置于恒温培养振荡器中培养，控制温度30℃，转速200 rpm，培养16h结束，所得培养物即为制备的微生物菌剂。

糖蜜培养基组成：糖蜜 20.0 g/L，酵母提取物2.0 g/L，KH₂PO₄ 0.25 g/L，K₂HPO₄1.0 g/L，MgCl₂ 0.2 g/L；调节初始pH值6.8。

降解黑臭水体空气中硫的应用：在约10m²的房间内放置4个敞口的塑料桶，将200L的黑臭水装入塑料桶内，然后关闭房门，保证水体中释放的硫化氢不会逸散出来。24h后，使用气体分析仪测定空气中硫化氢的浓度（北京市北斗星科技有限公司，Pair2000-EFF），记作黑臭水体空气中初始的硫化氢浓度。测定完成后，将制备的盖氏假单胞菌P4微生物菌剂1000mL（100mL/m²）均匀喷洒在房间内的空气中，喷洒后，同样的用气体分析仪测定空气中硫化氢的浓度。测定结果显示，初始空气中硫化氢浓度为0.199 mg/m³，喷洒后空气中硫化氢的浓度为0.025 mg/m³，空气中硫化氢的降解率达到了87.44%。

序列表

<110> 佛山市玉凰生态环境科技有限公司

<120> 一株氧化硫的盖氏假单胞菌及其在黑臭水体空气中降硫应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1389

<212> DNA

<213> Pseudomonas gessardii P4

<400> 1

gagaagcttg cttctcttga gagcggcgga cgggtgagta atgcctagga atctgcctgg 60

tagtggggga taacgttcgg aaacggacgc taataccgca tacgtcctac gggagagagc 120

aggggacctt cgggccttgc gctatcagat gagcctaggt cggattagct agttggtggg 180

gtaatggctc accaaggcga cgatccgtaa ctggtctgag aggatgatca gtcacactgg 240

aactgagaga cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc 300

gaaagcctga tccagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggtc ttcggattgt aaagcacttt 360

aagttgggag gaagggttgt agattaatac tctgcaattt tgacgttact gacagaataa 420

gcaccggcta actctgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga 480

attactgggc gtaaagcgcg cgtaggtggt tagttacgtt ggatgtgaaa tccccgggct 540

caacctggga actgcattca aaactgactg actagagtat ggtagagggt ggtggaattt 600

cctgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatag gaaggaacac cagtggcgaa ggcgaccacc 660

tggactgata ctgacactgc ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg 720

gtagtccacg ccgtaaacga tgtcaactag ccgttgggag ccttgagctc ttagtggcgc 780

agctaacgca ttaagttgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttagaa ctcaaatgaa 840

ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 900

cttaccaggc cttgacatcc aatgaacttt ctagagatag attggtgcct tcgggaacat 960

tgagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1020

taacgagcgc aacccttgtc cttagttacc agcacgttat ggtgggcact ctaaggagac 1080

tgccggtgac aaaccggcgg aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc ccttacggcc 1140

tgggctacac acgtgctaca atggtcggta cagagggttg ccaagccgcg aggtggagct 1200

aatcccaaaa accgatcgta gtccggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagtcgga 1260

atcgctagta atcgcgaatc agaatgtcgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1320

cgcccgtcac accatgggag tgggttgcac cagaagtagc tagtctaacc ttcgggagga 1380

cggttacca 1389

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctca 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一株氧化硫的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4，其特征在于，所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4的保藏号为CCTCC NO：M 2022149。

2.根据权利要求1所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4，其特征在于，所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。

3.根据权利要求1所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4生长温度为20~37 ℃，转速 100~250rpm；

盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4降解硫代硫酸钠的温度为20~37 ℃，转速100~250 rpm。

4.根据权利要求1所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4，其特征在于，所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4在温度25~37 ℃、转速200 rpm的条件下，针对初始浓度50 mmol/L的硫代硫酸钠，反应16 h时，硫代硫酸钠降解率达到95%以上。

5.根据权利要求1-3任一所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4 的应用，其特征在于，所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4在黑臭水体空气中降解硫的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，还包括以下步骤：

将盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4接种于糖蜜培养基中，控制培养温度37 ℃、恒温培养振荡器转速200 rpm，培养24 h获得微生物菌剂；

将培养的微生物菌剂在黑臭水体的空气中喷洒，实现盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4对空气中硫的去除。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂中盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii P4浓度不少于5×10⁸ CFU/mL。