CN103382446A - 一株具有降解多氯联苯能力的根瘤菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明微生物领域，涉及一株具有降解多氯联苯能力的根瘤菌及其应用。苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium melilon）SL1，于2012年12月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.6962。该菌株能以多氯联苯为唯一碳源和能源生长，在实验室摇瓶条件下对2,4,4'‐TCB及3,3',4,4'‐PCB均有较好的降解能力。对其降解条件进行了优化，进一步提高了该菌株对多氯联苯的降解效果。为生物法降解多氯联苯并用于水体污染修复提供了基础。

Description

一株具有降解多氯联苯能力的根瘤菌及其应用

技术领域

本发明微生物领域，涉及一株具有降解多氯联苯能力的根瘤菌及其应用。 

背景技术

多氯联苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)是一类人工合成的有机化合物，具有较强的化学惰性和生物难降解性，土壤是其在环境中最主要的归宿。由于许多PCBs能够在生物体内累积，具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应，因此已被列为首批需要削减和控制的12种持久性有机污染物(POPs)之一。如何修复PCBs污染土壤成为人们关心的热点。 

目前，安全、经济的生物修复特别是微生物修复措施已成为极具应用前景的PCBs污染修复技术。自1973年Ahmed和Focht筛选出两株无色杆菌(Achromobacter sp.)能够降解卤代联苯得到对-氯苯甲酸以来，已分离出多种能够降解PCBs的细菌菌株。 

根瘤菌作为一种既可以游离状态存在，又可以共生状态与植物互作存在的特殊微生物，一直以来都受到人们的关注。以往的研究多关注于根瘤菌固氮给植物提供营养和保护，促进植物生长。而随着土壤污染植物修复的兴起，根瘤菌的促修复作用受到越来越多的关注。此外，有研究表明，以游离状态存在于土壤环境中的根瘤菌，有耐受并降解广谱芳香烃污染物的能力，在共生状态下，根瘤菌也可强化植物对PCBs污染土壤的修复效果。然而在我国有关于能降解PCBs的根瘤菌的资源却鲜有报道。因此，本专利分离出了一株对PCBs具有良好降解性能的根瘤菌SL1，研究了该根瘤菌对不同浓度不同种多氯联苯的降解效果。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株具有降解多氯联苯能力的根瘤菌及其应用。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现: 

一株具有降解多氯联苯能力的苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium melilon）SL1，于2012年12月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.6962。 

所述根瘤菌菌落较小，成白色，圆球状隆起，半透明，边缘整齐，表面光滑伴有粘液，呈圆形或椭圆形，单个或者不规则堆状排列。 

所述根瘤菌菌的生理生化特性是：革兰氏阴性，好氧，化能异养，接触酶阳性，M.R和VP试验阴性，淀粉水解阴性，明胶水解阴性，硝酸盐还原阴性，柠檬酸盐利用阴性。 

所述多氯联苯优选三氯联苯PCB28或四氯联苯PCB77中的任意一种。 

本发明所述的苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium melilon）SL1在降解多氯联苯中的应用。 

所述多氯联苯为三氯联苯PCB28或四氯联苯PCB77中的任意一种。 

本发明所述的根瘤菌具有较高的降解多氯联苯的能力，将降解多氯联苯的SL1菌株接种于YMA培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；将上述培养好的菌种按一定量接种于以多氯联苯（PCB28和PCB77）为唯一碳源和能源的无机盐培养基进行降解转化。Sinorhizobium melilon SL1CGMCC No.6962对这两种多氯联苯均有较好的降解效果。 

通过对发酵培养的进一步优化，提高SL1根瘤菌的降解效果。选取不同发酵时间转接入以多氯联苯为唯一碳源和能源的无机盐培养基中转化，得到48h时SL1菌株降解效果较好。设置温度、pH、接种量、通气量四个因素做正交试验，得到当温度为25℃、pH为7、接种量为4.5mL、通气量为150mL时SL1菌株对10mg/L PCB28的降解率最高可达85.49%。同时通过在转化过程中添加不同有机质作为多氯联苯的共代谢底物，得到以柠檬烯为共代谢底物可显著提高SL1的降解效果，对10mg/L PCB28的降解率达89.40%。 

有益效果：苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium melilon SL1CGMCC No.6962），游离态能够以三氯联苯PCB28（2,4,4'-TCB）和四氯联苯PCB77（3,3',4,4'-PCB）为唯一碳源对其进行降解。在以PCB28为唯一碳源的基础无机盐液体培养基中培养7d后，初始浓度1.0mg/L时降解率可达93.3%，最高初始浓度50.0mg/L时降解率达65.1%。在以PCB77为唯一碳源的基础无机盐液体培养基中培养7d后，初始浓度1.0mg/L时降解率可达56.2%，最高初始浓度25.0mg/L时降解率达22.8%。通过对菌株发酵过程的优化，10mg/L2,4,4'-TCB时SL1菌株降解率可由原来的54.8%提高至85.49%；在转化过程中的优化，也可使其降解率提高至89.4%。该菌株在去除环境中多氯联苯的污染中起到了较好的作用，用于PCBs污染水体的生物修复也有良好的前景。 

附图说明

图1是本发明菌株SL1的菌落图； 

图2是SL1菌株的16S rDNA的系统发育树； 

图3表示SL1菌株降解率的F值。 

生物材料保藏信息 

SL1，分类命名为Sinorhizobium melilon，于2012年12月10日在位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.6962。 

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。 

实施例1多氯联苯降解根瘤菌的筛选及鉴定 

培养基配制： 

改良基础盐培养基（降解培养基）：KH₂PO₄3.7g，K₂HPO₄·3H₂O5.2g，NH₄Cl1.0g，Na₂SO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，微量金属盐溶液1mL，补水至1000mL，pH7.0～7.5。添加PCB28（2,4,4'-TCB）的丙酮溶液，使其浓度达到1mg/L，做为唯一碳源，敞口至丙酮挥发待用。固体培养基加18g/L的琼脂。 

微量金属盐溶液(去离子水1000mL)：FeCl₂·4H₂O0.3g，CoCl₂·6H₂O0.038g，MnCl₂·4H₂O0.02g，ZnCl₂0.014g，H₃BO₃0.0124g，Na₂MoO₄·2H₂O0.04g，CuCl₂·2H₂O0.0034g。 

LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水定容至1000mL。固体培养基加18g/L的琼脂。 

降解根瘤菌的驯化、筛选： 

从浙江省台州市电子拆解园区附近苜蓿植物根际土中分离。 

称取备用土样1.0g，加入到100mL的降解培养基中，于30℃，180r min^-1摇床富集培养7d，以1%的接种量连续富集、转接5次。将最后一次富集培养的菌液稀释，选取10^-4～10^-6三个浓度梯度涂布于LB固体培养基上，30℃培养至有明显菌落长出，挑单菌落于降解固体培养基上划线纯化三次。至平板上长出单一菌落即为纯菌。 

菌株的形态特征（图1）：根瘤菌菌落较小，成白色，圆球状隆起，半透明，边缘整齐，表面光滑伴有粘液，呈圆形或椭圆形，单个或者不规则堆状排列。 

菌株的生理生化特性：革兰氏阴性，好氧，化能异养，接触酶阳性，甲基红试验（M.R）和乙酰甲基甲醇试验（V.P）阴性，淀粉水解阴性，明胶水解阴性，硝酸盐还原阴性，柠檬酸 盐利用阴性。 

菌株16SrDNA分子鉴定：采用DNA小量提取方法提取细菌总DNA。采用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增其16S rDNA基因，将PCR产物直接测序，将获得的16S rDNA基因序列输入GenBank，对数据库中序列进行比较分析，发现SL1菌序列与Ensifer mexicanus ITTG R7T（DQ411930）有97%的同源性。结合生理生化结果特征，SL1菌的初步鉴定结果为苜蓿中华根瘤菌。图2是该菌株的16S rDNA的系统发育树。 

实施例2SLI根瘤菌对不同浓度的2,4,4'-TCB及3,3',4,4'-PCB降解率 

所需培养基： 

甘露醇酵母汁琼脂培养基(YMA)培养基：甘露醇10.0g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.5g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.2g，氯化钠(NaCl)0.1g，酵母汁(1%)100mL，碳酸钙(CaCO₃)3.0g，蒸馏水900mL，pH为7.0～7.2。 

无机盐基础培养基，其培养基质量比组成为：KH₂PO₄3.7g，K₂HPO₄·3H₂O5.2g，NH₄Cl1.0g，Na₂SO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，微量金属盐溶液1mL，补水至1000mL。 

微量金属盐溶液(去离子水1000mL)：FeCl₂·4H₂O0.3g，CoCl₂·6H₂O0.038g，MnCl₂·4H₂O0.02g，ZnCl₂0.014g，H₃BO₃0.0124g，Na₂MoO₄·2H₂O0.04g，CuCl₂·2H₂O0.0034g。 

2.1根瘤菌的发酵培养 

将SL1根瘤菌菌种接种于YMA固体平板上30℃活化24h，后接入30ml液体种子YMA培养基中扩大培养，然后以3%的接种量再次转接到30ml液体YMA培养基中30℃，180r min^-1培养48h。 

2.2根瘤菌的细胞转化 

将发酵培养的根瘤菌悬液离心，收集菌体，后用pH7.0的0.05M磷酸缓冲液洗涤两次，转接入同等体积的含有不同浓度的PCBs的无机盐培养基中，30℃，180r min^-1转化7d，以接入灭活菌液处理为对照。 

转化液由无机盐培养基添加PCBs制成，，以2,4,4'-TCB为唯一碳源，浓度设定为：1.0，5.0，10.0，25.0，50.0（mg/L）。 

转化液由无机盐培养基添加PCBs制成，，以3,3',4,4'-PCB为唯一碳源，浓度设定为：1.0，5.0，10.0，25.0（mg/L）。 

2.3转化液中PCBs的提取和测定 

根瘤菌对PCBs转化后，采用等体积的乙酸乙酯萃取3次，后旋转蒸发至干，以正己烷定容，GC/MS待测。结果如表1和表2所示： 

表1SL1菌对不同浓度的2,4,4'-TCB的降解率 

表2SL1菌对不同浓度的3,3',4,4'-PCB的降解率 

实施例3不同发酵条件对SL1菌株降解率的影响 

针对不同温度、pH、接种量、通气量四因素进行正交试验，探索对该菌株降解率的影响。 

在SL1菌株发酵过程中，分别选取pH5、6、7、8、9；温度20、25、30、35、40℃；接种量0.5、1.5、3、4.5、6mL；通气量25、50、75、100、150mL四因素进行正交实验，因素各水平如表3所示。液体摇瓶振荡培养后离心收集菌体转接入含有10mg/L2，4，4ˊ-TCB的基础无机盐培养基中，30℃、180r min^-1培养7d。结果如下表4所示，本实验得到的最佳组合为A₂B₃C₃D₄，即温度25℃、pH7、接种量3mL、通气量100mL。各因素对SL1菌株降解率的影响依次为：接种量＞通气量＞pH＞温度。如图2所示，接种量的F值大于F临界值，这说明SL1菌株的接种量与其降解效果呈显著相关，这也与极差分析中接种量对降解率的影响最大相一致。因素中温度、pH、通气量的F值均小于F临界值，故可见当该菌株生长所需的这些因素在本研究设定的范围内时，SL1菌均具有较好的适应性。 

表3实验因素与水平表 

表4正交试验结果直观分析表 

实施例4不同代谢底物对SL1根瘤菌降解率的影响 

为了进一步优化得到的降解根瘤菌SL1，下面进行了添加不同有机质作为代谢底物对该菌株降解率的影响实验。 

将SL1菌体发酵离心（具体步骤同实施例2）后，收集菌体转接入含有10mg/L2,4,4'-TCB的基础无机盐培养基中，培养基中再分别加入浓度1mg/L不同有机质进行振荡培养7d。所添加有机质分别为：葡萄糖、蔗糖、甘露醇、联苯、香芹酮，柠檬烯。以接入灭活菌液作为对照。结果如表5所示，蔗糖、葡萄糖、香芹酮、联苯作为共代谢底物时对菌株的降解有一定的抑制作用。但加入共代谢底物柠檬烯和甘露醇均能一定程度的促进菌株SL1对2,4,4'-TCB的降解作用。尤其以柠檬烯为共代谢底物时SL1菌株降解率提高了15.8%。 

表5不同代谢物质对菌株SL1降解多氯联苯的影响 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 

Claims (4)

1.一株具有降解多氯联苯能力的苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium melilon）SL1，于2012年12月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.6962。

2.根据权利要求1所述的具有降解多氯联苯能力的苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobiummelilon）SL1，其特征在于：所述多氯联苯为三氯联苯PCB28或四氯联苯PCB77中的任意一种。

3.权利要求1所述的苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium melilon）SL1在降解多氯联苯中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述多氯联苯为三氯联苯PCB28或四氯联苯PCB77中的任意一种。

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