CN102876621A - 中慢生根瘤菌zy1及其在土壤修复中的应用 - Google Patents

Abstract

中慢生根瘤菌ZY1及其在土壤修复中的应用，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年9月25日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.6622。该菌能在以多氯联苯为唯一碳源和能源的培养基上生长，培养10d时其降解率达到62.7%，而接种于土壤28d后，土壤中PCBs降解率达到57.6%，该菌株在PCBs污染土壤的生物修复中具有很好的应用前景。

Description

中慢生根瘤菌ZY1及其在土壤修复中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种中慢生根瘤菌ZY1及其在多氯联苯污染土壤修复中的应用。

背景技术

多氯联苯（Polychlorinated biphenyls，PCBs）作为一类典型的持久性有机污染物(Persistentorganic Pollutants，POPs)，广泛分布于各类环境介质中，土壤被认为是PCBs最大的库和汇。PCBs污染土壤的微生物修复技术中需要解决的首要问题是高效降解菌株的筛选和构建。1973年Ahmed和Focht筛选出两株对卤代联苯具有降解效果的无色杆菌（Achromobacter）以来，已分离出多种具有PCBs降解功能的细菌菌株。滕应等（2005，2006）研究发现了PCBs复合污染土壤中存在部分优势革兰氏阴性降解菌，如鞘氨醇单胞菌等。但是，有关能降解PCBs的根瘤菌种质资源很少被发现。目前关于紫云英根瘤菌对PCBs污染土壤的修复效果尚无报道。鉴此，本专利从PCBs污染农田的紫云英根瘤中分离筛选出一株对PCBs具有良好降解性能的中慢生根瘤菌ZY1，研究了紫云英根瘤菌对PCBs复合污染农田土壤的修复效应，为进一步研发PCBs污染土壤的生物修复提供了科学依据和新思路，具有十分广泛的应用潜力。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供了一种能够降解多氯联苯（如PCB77）的微生物资源。

技术方案：一种中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sp.strain ZY1），该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年9月25日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.6622。中慢生根瘤菌（Mesorhizobiumsp.strain ZY1）在多氯联苯污染土壤中的修复应用。中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sp.StrainZY1）在多氯联苯污染土壤修复中的应用。中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sp.strain ZY1）的培养基，按质量比组成为：NaCl 1.00g，NH₄NO₃ 1.00g，K₂HPO₄ 1.50g，KH₂PO₄ 0.50g，MgSO₄.7H₂O 0.50g，添加PCB77（3，3'，4，4'-四氯联苯），使其浓度达到15mg/L，pH7.0~7.5。

本发明提供一种多氯联苯的降解菌，其菌株是一株革兰氏阴性菌ZY1（2012年9月25日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.6622），经鉴定为中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sp.)。ZY1在甘露醇酵母汁琼脂培养基（YMA）培养基（按质量配比为：甘露醇10.0g，酵母粉0.4g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.2g，NaCl 0.2g，微量元素溶液1mL，加超纯水至1L，pH7.0~7.2。微量元素溶液（g/L）：H₃BO₃ 2.86g，MnSO₄ 1.81g，ZnSO₄ 0.22g，CuSO₄ 0.80g，H₂MoO₂ 0.02g）平板上培养24h后，菌落乳白色、圆形、黏质半透明、边缘整齐、表面隆起、湿润光滑，菌落直径一般在1.0~2.5mm。经染色镜检，该菌为革兰氏阴性，菌体呈长杆状（0.5~0.6μm×1.8~3.8μm）（见图2、图3）。

该菌具有较高的降解多氯联苯的能力。将降解多氯联苯的Mesorhizobium sp.strain ZY1CGMCC No.6622菌株接种于甘露醇酵母汁琼脂培养基（YMA）摇瓶中，振荡培养至对数期；将上述培养好的菌种按10%vt的接种量接种入500mL三角瓶，培养至对数生长期。该菌株ZY1能以PCBs为唯一碳源生长，并对溶液中PCB77具有较高的降解效率。在15mg/L初始浓度条件下，第4d、第7d、第10d时其降解率分别达到了45.3%、51.0%和62.7%。可见，该菌株对多氯联苯具有较好的降解作用（见图6）。

将Mesorhizobium sp.strain ZY1 CGMCC No.6622菌液按20％wt的接种量接入多氯联苯污染土壤中，28℃避光培养28d后结果发现，与对照相比，接种活菌ZY1显著促进了污染土壤中PCBs（包括PCB8，PCB18，PCB28，PCB44，PCB52，PCB66，PCB77，PCB101，PCB105，PCB118，PCB126，PCB128，PCB138，PCB153，PCB170，PCB180，PCB187，PCB195，PCB200，PCB206，PCB209）总量的降低，在第0、4、7、14、28d，土壤中PCBs残留量分别为9409.22μg/kg、8151.84μg/kg、4348.65μg/kg、3945.53μg/kg和3550.78μg/kg，在第28d降解率达到了57.6%（见图7～图8）。该菌株在PCBs污染土壤的生物修复中具有良好的应用前景。

本发明提供的Mesorhizobium sp.strain ZY1CGMCC No.6622菌株能在PCB77（3，3'，4，4'-四氯联苯）为唯一碳源和能源的无机盐基础培养基中生长并降解利用高分子量PCB77，其培养基质量比组成为：NaCl 1.00g，NH₄NO₃ 1.00g，K₂HPO₄ 1.50g，KH₂PO₄ 0.50g，MgSO₄.7H₂O0.50g，添加PCB77（3，3'，4，4'-四氯联苯），使其浓度达到15mg/L，微量元素溶液1.0mL，pH7.0~7.5。121℃灭菌30min。

有益效果：该菌株为中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sp.strain ZY1 CGMCC No.6622），游离态根瘤菌ZY1能够以四氯联苯PCB77（3，3'，4，4'-四氯联苯）为唯一碳源对其进行好氧降解，在以PCB77（15mg/L）为唯一碳源的基础盐液体培养基中培养10d后，其对PCB77的降解率达62.7%。该菌接种于土壤28d后，土壤PCBs的降解率可达57.6%，明显提高了污染土壤中细菌和联苯降解菌的数量，而且该根瘤菌与紫云英联合作用后土壤中多氯联苯去除率为53.1%，该菌株在PCBs污染土壤的生物修复中具有较好的应用前景。

附图说明：

图1为紫云英植株及其根瘤形态，其中a:紫云英田间长势；b:紫云英植株；c:紫云英根系；d:紫云英根瘤；

图2为菌株ZY1在固体培养基上菌落形态,其中a:平板上菌落生长；b:菌落形态；

图3为菌株ZY1的电镜照片；（图中左25000×，右12000×）；

图4为菌株ZY1的16S rDNA的PCR产物电泳结果；

图5为菌株ZY1的16S rDNA的系统发育树；

图6为菌株ZY1对PCB77的降解曲线；

图7为ZY1对污染土壤中PCBs含量的影响；

图8为不同处理下土壤中PCBs同系物百分含量；

图9为各处理土壤中联苯降解菌数量的动态变化；

图10为不同处理下土壤PCBs遗传毒性当量的变化。

具体实施方式

以下结合实例对本发明作进一步的描述：

实施例1：多氯联苯降解紫云英根瘤菌的筛选鉴定及降解特性

1.1材料与方法

1.1.1供试材料

改良基础盐培养基（降解培养基，MM，g/L）：NaCl 1.00g，NH₄NO₃ 1.00g，K₂HPO₄ 1.50g，KH₂PO₄ 0.50g，MgSO₄.7H₂O 0.50g，加超纯水至1L。pH7.0~7.5。添加PCB77（3，3'，4，4'-四氯联苯），使其浓度达到15mg/L，作为唯一碳源。

甘露醇酵母汁琼脂培养基（YMA）（g/L）：甘露醇10.0g，酵母粉0.4g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.2g，NaCl 0.2g，微量元素溶液1mL，加超纯水至1L。pH7.0~7.2，121℃灭菌20min。微量元素溶液（g/L）：H₃BO₃ 2.86g，MnSO₄ 1.81g，ZnSO₄ 0.22g，CuSO₄ 0.80g，H₂MoO₂ 0.02g。用2mol/L HCl和2mol/L NaOH溶液调整培养基的pH值在7.0~7.2，为了避免水中氯离子对实验过程的影响，培养基采用超纯水配制。

主要化学品：PCB77（3，3'，4，4'-四氯联苯）购自北京百灵威化学技术有限公司。丙酮、正己烷等有机溶剂均为分析纯，重蒸后使用。硫酸为优级纯，无水硫酸钠（分析纯）、硅胶（100~200目，分析纯）、中性氧化铝（分析纯）400℃活化6h，冷却后置于全玻璃容器中密封贮存，待用。另备色谱纯正己烷、酸性硅胶（硅胶：浓硫酸=2：1，质量比）。提取DNA的试剂盒采用OMEGA的E.Z.N.A细菌DNA提取试剂盒。

1.1.2根瘤的获取

从长三角某典型多氯联苯污染农田土壤中生长状态良好的紫云英植物根部选择肥大、饱满、粉红色的有效根瘤，蒸馏水洗净后无菌水冲洗数次，无菌滤纸吸干4℃保存待用，如图1。

1.1.3降解根瘤菌的驯化、筛选

根瘤菌分离方法参照文献（Vincent，1970）。先用95%wt乙醇浸泡2min，再用7%wt次氯酸钠表面灭菌10min，然后用无菌水清洗10次。将单个根瘤在无菌条件下，用镊子将其在盛有适量无菌水的离心管内压碎夹破后，将离心管内无菌水和根瘤汁液接入100mL的以5mg/L PCB77为唯一碳源的基础盐培养液中（顾素芳等，1997）。30℃，170rpm好氧培养培养2~4d后，以1%的接种量连续富集、转接5次。富集培养液经测定有降解效果后，提高富集培养液中PCBs的浓度至10mg/L，继续富集。转接5次经测定有降解效果后，稀释10⁴~10⁶涂布150μL至YMA平板上，30℃培养。待平板上出现单菌落后，挑取单菌落划线3~4次进行纯化，纯化后将菌株转接至10mg/L PCB77为唯一碳源的基础盐培养液试管中，30℃、170rpm摇培，分析单菌的降解效果。

1.1.4菌株的生理生化鉴定

菌株形态及生理生化特性测定参照文献（Dong等，2001）进行。测定指标包括9项：甲基红实验（M.R.试验）、乙酰甲基甲醇试验（V.P.试验）、接触酶试验（过氧化氢酶试验）、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、液化明胶试验、柠檬酸利用试验和糖酵解试验（葡萄糖、乳糖）。

1.1.5菌株的16S rDNA分子鉴定

菌株16S rDNA的克隆及序列测定和比较参照文献（Sambrook等，1989）。将菌株ZY1转接至YMA培养液扩大培养，离心收集菌体，按照OMEGA的E.Z.N.A细菌DNA提取试剂盒提供的方法提取菌体总DNA。用细菌16S rDNA扩增通用引物（生工生物工程上海有限公司合成）对ZY1基因组进行PCR扩增。上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′（Escherichia coli对应位置为8~27）；下游引物：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′（E.coli对应位置为1507~1492）。以ZY1总DNA为模板，50μL体系为：模板1μL，Premix rTaq（包括Taq酶、Buffer、dNTP、Mg²⁺）25μL，引物（20mmol/L）各1μL，超纯水22μL。聚合酶链式反应条件：94℃，10min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1.5min；循环35次，72℃延伸10min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶，于120V电泳30分钟。PCR产物采Axygen凝胶回收试剂盒纯化后酶连至pMD-18T载体（TAKARA公司），转化E·coliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，验证插入片断后测序（由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成）。将测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比较。

1.1.6菌株ZY1的溶液降解性能分析

将灭菌的降解培养基（PCB77终浓度为15mg/L），以每瓶5mL分装在60mL玻璃离心瓶（用黑色胶布进行避光处理，先塞上橡皮塞，再用锡箔纸包裹）中待用。挑取YMA平板活化的单菌落于50mLYMA液体培养基中，30℃、170rpm振荡培养至对数期，8000rpm离心5min收集菌体，用pH7.0的0.05mol/L磷酸缓冲液洗涤2次后重悬，并调节OD₆₀₀至1.0作为降解试验的接种菌液。向降解培养基中接种1mL菌悬液，设接种灭活菌悬液处理为对照（CK）。将离心瓶放于28℃、170rpm摇床培养10天，分别在第0d、第4d、第7d、第10d时取样，测定其PCBs浓度和菌的生长情况（OD600nm）。

1.1.7转化液中PCBs的提取和测定

取样后先加入100μL高氯酸终止反应。萃取相用色谱级的正己烷，按照每1mL样品中加入3mL（三倍体积）的正己烷萃取，加入0.4g硫酸铵作破乳剂，涡旋振荡2min，静置1h。待样品分层稳定后，取上层有机相转移到玻璃离心管中，并加入0.4g无水硫酸钠脱水，取1mL用正己烷定容至5mL待GC分析。每批样品设3组平行数据。用已知浓度的标准品检测样品回收率，其平均回收率达到95%。表明该方法能够满足实验要求。

色谱条件：采用带有电子俘获检测器和自动进样器的Varian 3800型气相色谱仪分析。色谱柱：CP-sil24CB（30m×0.25mm×0.25um），进样温度为260℃，检测器温度为300℃。程序升温：初始温度为180℃，保留0.5min，30℃/min梯度升温至260℃，持续18min，然后15℃/min梯度升温至270℃，持续2min。无分流进样1μL，载气为高纯氮，流速为1.0mL/min。

质量控制：采用七点校正进行标准物质的校正曲线和外标法进行，借助Starwork Station6.0进行数据采集和处理。21种PCBs混标(10μg/kg)的基质加标平均回收率是72.0~109.8%，相对标准偏差是3.1%~57.3%，仪器检测限为1.43~5.10μg/kg，方法检出限为1.33~3.45μg/kg。该方法满足痕量有机物定量分析要求。

数据处理方法：降解率（%）=（灭菌处理溶液浓度-活菌处理溶液浓度）/灭菌处理溶液浓度×100%。

1.2.结果与讨论

1.2.1菌株ZY1的菌落形态特征

通过分离纯化从紫云英根瘤中筛选得到4株根瘤菌，将其中一株能较好降解PCBs的菌编号为ZY1。ZY1在YMA培养基平板上培养24h后，菌落乳白色、圆形、黏质半透明、边缘整齐、表面隆起、湿润光滑，菌落直径一般在1.0~2.5mm（图2）。

菌体革兰氏染色呈阴性，在扫描电镜下可见菌体呈长杆状（0.5~0.6μm×1.8~3.8μm），因生长时期的不同，大小略有差异，单根极生鞭毛（图3）。

1.2.2菌株ZY1的生理生化特征

菌株ZY1的生理生化特性测定结果见表1.1。由表1.1可知，菌株ZY1的甲基红和V.P.反应阳性，过氧化氢酶和接触酶测定阳性，氧化酶测定阴性，不能利用硝酸盐和柠檬酸盐，能利用淀粉，不能液化明胶，吲哚试验呈阴性，蔗糖、葡萄糖发酵产酸产气，乳糖发酵不产酸不产气。

表1.1菌株ZY1的生理生化特征

1.2.3菌株ZY1的分子鉴定结果

以菌株ZY1基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度为1527bp的扩增产物，菌株ZY1的16S rDNA的PCR产物电泳结果如图4所示。

测序工作委托英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。根据GeneBank序列同源性比较，菌株ZY1与Mesorhizobium sp.（GenBank登录号为AM491622.1）同源性为99%，结合其形态特征和生理生化特性结果，初步将该菌鉴定为中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium sp.）。图5是该菌株的16S rDNA的系统发育树。

1.2.4菌株ZY1的对PCB77的溶液降解性能

菌株ZY1对溶液中PCB77的降解动态结果如图6所示。从图6可知，接入ZY1进行生物降解后，溶液中PCB77（3，3'，4，4'-四氯联苯）降解率显著增加，在第0、4、7、10d时降解体系中PCB77浓度分别为14.58mg/L、6.39mg/L、6.07mg/L、5.91mg/L。试验组与对照组之间存在显著差异（p＜0.05），第4d、第7d和第10d，在15mg/L初始浓度条件下，该菌对PCB 77的降解率相对于灭菌对照分别达到了45.3%、51.0%和62.7%。在加入灭活菌液的对照组中，PCB77的浓度也有所下降，这可能是由于PCB77在提取纯化过程中挥发或发生光解等非生物因素造成。

实施例2：紫云英根瘤菌对污染土壤中多氯联苯的降解性能

2.1材料与方法

2.1.1供试材料

供试菌株：菌株中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sp.strain ZY1 CGMCC No.6622），从长江三角洲某典型PCBs污染农田的紫云英植株根瘤中，经驯化富集后分离筛选得到。先将菌种接种于YMA固体平板培养基上28℃活化，然后接入YMA液体培养基中扩大培养，测得菌液中根瘤菌的含量为3×10⁸cfu/mL。

改良基础盐培养基（降解培养基，MM，g/L）：NaCl 1.00g，NH₄NO₃ 1.00g，K₂HPO₄ 1.50g，KH₂PO₄ 0.50g，MgSO₄.7H₂O 0.50g，加超纯水至1L，pH7.0~7.5。添加PCB77（3，3'，4，4'-四氯联苯），使其浓度达到15mg/L，作为唯一碳源。（沈雨佳等，2007）

甘露醇酵母汁琼脂培养基(YMA)（g/L）：甘露醇10.0g，酵母粉0.4g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄0.2g，NaCl 0.2g，微量元素溶液1mL，加超纯水至1L，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。微量元素溶液（g/L）：H₃BO₃ 2.86g，MnSO₄ 1.81g，ZnSO₄ 0.22g，CuSO₄ 0.80g，H₂MoO₂ 0.02g。利用2mol/L HCl和2mol/L NaOH溶液调整培养基的pH值在7.0-7.2，为了避免水中氯离子对实验过程的影响，培养基采用超纯水配制。

供试土壤：采自南京市栖霞区农田土壤，未检出PCBs，pH值为6.32±0.21，风干后过60目筛，向其中添加PCB77，使土壤中PCB77含量达到10mg/kg。

主要化学品：PCB77和PCBs混合标准样品包括PCB8，PCB18，PCB28，PCB44，PCB52，PCB66，PCB77，PCB101，PCB105，PCB118，PCB126，PCB128，PCB138，PCB153，PCB170，PCB180，PCB187，PCB195，PCB200，PCB206，PCB209共21种单体）购自北京百灵威化学技术有限公司。丙酮、正己烷等有机溶剂均为分析纯，重蒸后使用。硫酸为优级纯，无水硫酸钠（分析纯）、硅胶（100~200目，分析纯）、中性氧化铝（分析纯）400℃活化6h，冷却后置于全玻璃容器中密封贮存，待用。另备色谱纯正己烷、酸性硅胶（硅胶：浓硫酸=2：1，质量比）。

2.1.2菌株ZY1对模拟污染土壤中PCBs的降解试验

试验设置2个处理：试验组（R）：接种20%活菌液，对照组（CK）：接种20%灭活菌液。每个处理3次重复。根瘤菌菌液浓度为3×10⁸cfu/mL。称取供试土壤200g（干重）装入培养瓶，向其中添加PCB77的丙酮溶液，至终浓度为10mg/kg（干重）土。向土壤中接种根瘤菌菌悬液30mL，充分拌匀。将土壤含水量调整到田间持水量（Water-Holding Capacity，WHC）的45%，在28℃恒温箱中培养，分别在第0、7、14、28d取样分析测定土壤PCBs含量变化。

2.1.3土壤中多氯联苯组分含量的分析方法

称取冷冻干燥土壤样品10.0g放入离心管，加入体积比1:1的丙酮和正己烷混合溶剂30mL，蜗旋混合仪振荡数秒，静置12h浸提。在水温25℃，频率为100%条件下超声提取15min，离心（1500rpm/min，5min），上清液过滤，滤液收集至茄形瓶中。重复超声提取2次。将三次离心液70mL旋转蒸发（450mbar，60rpm/min，水浴锅42℃）近干（800μL），加入5mL正己烷替换1次，浓缩至2mL后转入复合硅胶柱进行纯化。复合硅胶柱（长250mm，内径10mm）内依次装填硅胶、中性氧化铝、酸性硅胶和无水硫酸钠（w/w=2:2:1:1）。用10mL正己烷淋洗该柱，弃去淋洗液，然后加入处理后的样品提取液，用25mL正己烷洗脱，洗脱液旋转蒸发浓缩，用正己烷定容至5mL，待上机分析。

色谱条件：采用带有电子俘获检测器和自动进样器的Varian 3800型气相色谱仪分析。色谱柱：CP-sil24CB（30m×0.25mm×0.25um），进样温度为260℃，检测器温度为300℃。程序升温：初始温度为180℃，保留0.5min，30℃/min梯度升温至260℃，持续18min，然后15℃/min梯度升温至270℃，持续2min。无分流进样1μL，载气为高纯氮，流速为1.0mL/min。

质量控制：采用七点校正进行标准物质的校正曲线和外标法进行，借助Starwork Station6.0进行数据采集和处理。21种PCB混标（10μg/kg）的基质加标平均回收率是72.0~109.8%，相对标准偏差是3.1%~57.3%，仪器检测限为1.43~5.10μg/kg，方法检出限为1.33~3.45μg/kg。该方法满足痕量有机物定量分析要求。

2.1.4土壤中联苯降解菌数量的测定

采用最大或然数法（Most Probable Number，MPN）测定不同培养时期土壤中联苯降解菌数量（Wrenn和Venosa，1996）。称取5.00g鲜土置于盛有10mL无菌水的玻璃离心瓶中，充分震荡，使土壤分散，即得到10^-1土壤悬浮液。在无菌条件下，吸取1mL土壤悬浮液至9mL无菌水中得到10^-2土壤悬浮液，依次稀释至10^-6。在96孔板微孔中分别加入10μL 0.4g/mL联苯、72μL Bushnell Haas（BH无机盐培养基）和10μL不同稀释梯度的土壤悬浮液。用锡箔纸包裹避光后，于28℃培养两周，向每个微孔添加3g/L无菌碘硝基四唑紫（p-iodonitrotetrazolium violet）培养12h，根据微孔颜色变化情况查MPN表计算土壤中联苯降解菌数量。

2.2结果与讨论

2.2.1污染土壤中PCBs总量的变化

经过28d的ZY1生物强化修复后，各处理中污染土壤PCBs的总残留量变化动态见图7。与接灭活菌液的对照组相比，接种活菌ZY1显著促进了污染土壤中PCBs总量的降低，在第0、4、7、14、28d，土壤中PCBs残留量分别为9409.22μg/kg、8151.84μg/kg、4348.65μg/kg、3945.53μg/kg和3550.78μg/kg，在第28d降解率达到了57.6%。从降解动态上来看，各处理土壤中PCBs的总残留量均随修复时间的延长而逐渐降低。

2.2.2土壤中各PCBs组分含量的变化

修复后土壤中PCBs各组分的组成变化见图8，研究表明，PCBs生物可降解程度与其氯原子取代数量有关，随着氯原子取代数量的增加，生物可降解性逐渐降低。由图8可知，四氯组分百分比随着培养天数的增加而逐渐降低，在第0、4、7、14、28d时，分别为100%、85.1%、45.0%、42.6%和40.9%，下降速率表现为先快后慢，在第4~7d之间下降最快；三氯组分百分比从第4天至第28天由6.6%逐渐上升到44.4%；值得注意的是，二氯组分在第0、4、7、14、28天百分含量分别为8.4%、36.7%、22.1%和14.7%，表现出先增加再减少的趋势。在第0~4天，微生物主要利用四氯联苯PCB77为能源生长，并将其分解转化成二氯联苯和三氯联苯，但由于这一时期微生物数量有限，故二氯、三氯联苯百分比缓缓上升；在4~7天，微生物数量对数增长，四氯联苯持续被分解利用，但这阶段仍以脱氯作用为主，二氯、三氯联苯快速累积；微生物具有优先选择利用低氯代联苯的特性，当土壤中二氯和三氯联苯累积到一定量时，它们开环反应已经超过四氯联苯的脱氯作用，因此四氯联苯百分含量趋于平稳，而二氯联苯结构被微生物开环破坏，百分含量迅速降低。

2.2.3土壤中联苯降解菌数量的动态

各处理土壤中联苯降解菌数量见图9。研究结果显示，接种第0、7、14d试验组（R）土壤中联苯降解菌数量分别为6.4×10⁵MPN/g干土、4.0×10⁶MPN/g干土、4.7×10⁶MPN/g干土，是对照处理（CK）中联苯降解菌数量的7.1~8.9倍，接种活的根瘤菌的处理显著提高了土壤中联苯降解菌总量。

2.2.4土壤PCBs遗传毒性当量的变化

采用毒性当量因子（Toxic equivalency factor，TEF）计算出土壤PCBs遗传毒性当量(TEQ)的结果如图10所示。从图中可以看出，接菌处理R在第0、4、7、14和28d毒性当量分别为0.94、0.82、0.43、0.39和0.36，相对于对照组接菌处理显著降低了土壤中PCBs遗传毒性当量（p＜0.05），这说明菌株ZY1对PCBs污染土壤具有良好的修复潜力，可降低PCBs污染土壤对生态环境和人体健康的风险。

                        序列表

 

<110>  中国科学院南京土壤研究所

 

<120>  中慢生根瘤菌ZY1及其在土壤修复中的应用

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

agagtttgat cctggctcag                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  16

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

taccttgtta cgactt                                                     16

 

 

Claims (4)

1.中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sp. strain ZY1），该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年9月25日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 6622。

2.权利要求1所述的中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sp. strain ZY1）的培养基，其特征在于按质量比例组成为：NaCl 1.00g，NH₄NO₃ 1.00g，K₂HPO₄ 1.50g，KH₂PO₄ 0.50g，MgSO₄.7H₂O 0.50g，微量元素溶液1.0 mL，多氯联苯为 15 mg，该培养基pH 7.0-7.5。

3.根据权利要求2所述的中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sp. strain ZY1）的培养基，其特征在于所述多氯联苯为PCB77。

4.权利要求1所述的中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sp. strain ZY1）在多氯联苯污染土壤修复中的应用。

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