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一种增城中慢生根瘤菌及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增城中慢生根瘤菌及其用途。增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)RITF1218于2014年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014492。本发明是从黑木相思根瘤中分离筛选出的增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)RITF1218，该类菌株与黑木相思(Acacia melanoxylon)、网脉相思(Acacia aneura)、南洋楹(Albizia falcataria)和银合欢(Leucaena leucocephala)等结合能力，具有强的抗逆性，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

Description

一种增城中慢生根瘤菌及其用途
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及一种增城中慢生根瘤菌及其用途。
背景技术：
生物固氮是指一些细菌等可以将大气中的分子态氮转换成植物能够直接吸收利用的氨态氮的过程。大气中78％的氮气，只有通过生物固氮才能够得到利用。氮是动植物以及微生物生长发育所必须的元素之一，为了提高经济效益，过去曾大力发展化工产业，生产化肥以改善土壤肥力，促使植物的快速生长。但是，化肥的大量使用能源消耗、水土污染，甚至破坏了生态平衡。世界上的人口、资源、环境已成为当今全球性的问题，被称为“绿色革命”的生物固氮日益受到重视，尤其在林业上的应用。由于林业具有生产周期长，立地条件复杂等特点，使林业的施肥并不像农业那样的方便、有效。因此，生物固氮成为林木所需氮素的重要来源。
一些发达国家的林业生产中，非常重视固氮微生物资源的开发与利用。由于物价的上涨、保护环境意识的提高，生物制剂因为物美价廉、对环境无污染而广受青睐。世界上许多国家都把研究和开发微生物肥料及制品作为一项长远的计划。
相思树种(Acacia)是我国引种的重要速生树种，它不仅速生而且适应性广，耐干旱，耐贫瘠，速生丰产，能产生根瘤，有固氮作用，具有良好的改良土壤性能，从其引进试种到目前的规模化种植，已在林业产业和生态环境建设中发挥了重大作用。选择合适的根瘤菌制作菌肥是提高林业生产、创造经济价值和改善生态环境的重要环节，可实现经济效益及生态效能的双赢，并能带动林业技术进步。
菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈是优良菌株的选育问题。林业生产迫切需求固氮能力强、抗逆性强的微生物肥料生产用菌株。
发明内容：
本发明的目的是提供一种高效固氮结瘤并能与黑木相思、银合欢、南洋楹和网脉相思共生结瘤的新菌种—增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)RITF1218，该菌于2014年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014492。
本发明是从黑木相思根瘤中分离筛选出的增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumzengchengense)RITF1218，该类菌株能与黑木相思(Acacia melanoxylon)、网脉相思(Acacia aneura)、南洋楹(Albizia falcataria)和银合欢(Leucaena leucocephala)等共生结瘤，具有较强的抗逆性，因此在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
本发明的Mesorhizobium zengchengense RITF1218于2014年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014492。
附图说明：
图1是增城中慢生根瘤菌的16S rRNA与参比菌株的系统发育树
图2、图3和图4是采用最大似然法构建的系统发育树，分别是以增城中慢生根瘤菌和中慢生根瘤菌属内较相近种群的持家基因recA、atpD和glnII的序列构建的。
图5是增城中慢生根瘤菌的生理生化反应。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
YMA培养基：甘露醇10.0g，谷氨酸钠0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl0.01g，酵母粉0.5g，琼脂粉17g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。灭菌备用。
Jensen’s无氮营养液：K2HPO4 0.05g，NaCl 0.05g，MgSO4·7H2O 0.05g，CaHPO40.25g，FeCl3 0.05g，1mL微量元素溶液(H3BO3 2.86g/L，MnSO4·H2O 2.08g/L，ZnSO4·7H2O0.022g/L，CuSO4·7H2O 0.08g/L，NaMoO4 0.11g/L)，蒸馏水1000mL。灭菌备用。
实施例1：增城中慢生根瘤菌RITF1218、RITF907、RITF908的分离与鉴定
一、根瘤菌的分离
菌株分离自广东省惠州市和增城市苗圃的黑木相思根瘤。根瘤用自来水冲洗干净表面泥沙，于95％酒精浸泡30秒后，放入0.1％升汞溶液中表面消毒5分钟，无菌水冲洗8次。将经表面消毒后的根瘤放在两片无菌载玻片之间，用力挤压使根瘤破碎，用无菌接种针沾取根瘤液在YMA平板上划线，28～30℃恒温培养箱培养至菌落出现，挑取典型菌落纯化及鉴定。由此纯化得到根瘤菌RITF1218、RITF907、RITF908。
二、根瘤菌的鉴定
从以下几个方面鉴定根瘤菌RITF1218、RITF907、RITF908：
1、形态学鉴定
将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化的根瘤菌RITF1218、RITF907和RITF908进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。
对于处于对数生长期的根瘤菌，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明，上述步骤一分离纯化的3株根瘤菌RITF1218、RITF907和RITF908为革兰氏阴性菌，菌落圆形凸起，乳白色，半透明，表面光滑，边缘整齐；菌体杆状无芽孢。
2、生理生化特征分析
API 50CH和API 20NE用来分析代表菌株RITF1218的生理生化特征。如图5。
所述根瘤菌的生理生化特征测定结果如下：
根瘤菌RITF1218、RITF907和RITF908的菌落黏稠，边缘整齐；在BTB培养基上产酸；菌株RITF1218能利用甘氨酸、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、L-木糖、D-侧金盏花醇1、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、卫矛醇、肌醇、甘露醇、山梨醇、熊果苷、七叶灵、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-密二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-棉籽糖、木糖醇、D-龙胆二糖、D-松二糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯醇和苹果酸作为唯一碳源的培养基上生长；在L-山梨糖、甲基-αD-吡喃葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、水杨苷、D-乳糖、L-阿拉伯醇和5酮葡萄糖酸钾作为唯一碳源的培养基上缓慢生长；但是不能在能在赤藻糖醇、甲基-βD吡喃木糖苷、甲基-αD-吡喃甘露糖苷、苦杏仁苷、菊粉、D-松三糖、淀粉、糖原、葡萄糖酸盐、2酮葡萄糖酸钾、葵酸、己二酸、柠檬酸和苯乙酸的培养基上生长。硝酸盐反应、脲酶反应、半乳糖苷酶反应和氧化酶反应为阳性；色氨酸吲哚反应、葡萄糖酸化反应、精氨酸双水解反应和明胶蛋白酶水解反应为阴性。
3、16S rRNA序列测定及系统发育分析
常规方法培养根瘤菌RITF1218、RITF907和RITF908，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16S rRNA通用引物，27F：5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’，1492R：5’－TACGGTTACCTTGTTACGACTT－3’进行PCR反应。反应程序为：95℃变性1min、56.7℃1min、72℃延伸1.5min，共30个循环。DNA测序由英潍捷基(上海)生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAMAN软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库在线完成。
根瘤菌RITF1218、RITF907和RITF908的16S rRNA序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示。用16S rRNA基因的邻接法建树的系统发育树(图1)，显示了这三株根瘤菌和其他中慢生根瘤菌种群之间的亲属关系，与根瘤菌RITF1218、RITF907和RITF908的16S rRNA基因相似性最高的菌株是M.plurifarium LMG 11892T(99.8％)。根瘤菌RITF1218、RITF907和RITF908菌株的3个编码蛋白质的持家基因recA、atpD和glnII系统发育树分别见图2、图3和图4。根据系统发育树可知，与其持家基因recA相似性最高的菌株是M.plurifarium USDA4413T、M.silamurunense CCBAU 01550T、M.shonense AC39aT、M.abyssinicae AC98cT，相似性均为95.2％；其持家基因atpD与M.plurifarium USDA 4413T、M.shonense AC39aT和M.boluoense RITF741T有较高的相似性，均为95.7％；持家基因glnII与M.shonense AC39aT和M.boluoense RITF741T的相似性均为93.8％。
4、DNA同源性分析
利用常规方法大量提取3株根瘤菌RITF1218、RITF907和RITF908以及参比菌株DNA。选取的参比菌株在基因型和表现型方面与供试根瘤菌较为相似，分别是M.boluoenseRITF741T、M.shonense AC39aT、M.abyssinicae AC98cT、M.hawassense AC99bT、M.septentrional SDW014T和M.silamuruense CCBAU 01550T。采用复性速率法对菌株的DNA同源性进行测定。结果见表1。
表1 供试根瘤菌与相近参比菌株的DNA同源性
结果表明，所述的3株根瘤菌RITF1218、RITF907和RITF908之间的DNA同源性高于78％，而与参比菌株同源性低于60％，属与中慢生根瘤菌的新种。菌株RITF1218、RITF907和RITF908的(G+C)mol％含量分别为65.5、64.9、64.6，结果与已报道的中慢生根瘤菌属菌株的(G+C)mol％含量值相似。
5、菌株脂肪酸测定
脂肪酸种类及含量测定采用MIDI Sherlock微生物鉴定系统，菌株RITF1218细胞中含有8种脂肪酸，其中16:0、19:0cycloω8c和Summed Feature8含量最高(表2)。
表2 RITF1218和相近中慢生根瘤菌的脂肪酸类型
Summed feature 3包含iso-C15 2-OH和/或C16:1ωv7c(或16:1ω7c/16:1ω6c和/或16:1ω6c/16:1ω7c,当标记为)。Summed feature 5包含17:1iso I/anteiso B和/或r 17:1anteiso B/I I。Summed feature 7包含18:1cis 11/t9/t6和/或18:1trans 9/t6/c11。Summed feature 8包含C18:1ω6c/C18:1ω7。
该数据是用MIDI系统检测所得，数据库为TSBA6。菌株：1,RITF1218T；2,RITF907；3,RITF908；4,M.boluoense RITF741T；5,M.shonense AC39AT；6,M.abyssinicae AC98cT；7,M.hawassense AC99bT；8,M.septentrional SDW 014T；9,M.silamuruense CCBAU01550T。-,未检测到。
鉴于上述形态、生理生化特征、16S rRNA序列测定及系统发育分析、DNA同源性分析及脂肪酸等结果，将步骤一分离纯化得到的3株根瘤菌鉴定为增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)。其中根瘤菌RITF1218命名为：增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)RITF1218，由于其是模式菌株，其模式菌株名为：增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense sp.nov.)RITF1218T。本发明的增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)RITF1218已于2014年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014492。
实施例2、增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)RITF1218接种黑木相思、网脉相思、南洋楹和银合欢的效应。
一、菌液培养
将增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)RITF1218斜面上活化后转入YMA液体培养基，28-30℃摇床振荡培养(转速150转/分钟)至对数生长后期，得到增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)RITF1218菌液。
二、种子处理与萌发
先用浓硫酸浸泡种子半小时，然后将浓硫酸倒出，再用无菌水洗涤7～8次后，用无菌水浸泡到种子膨胀。将处理过的种子放在无菌培养皿中(内垫无菌滤纸加无菌水保湿)，置于30℃培养箱中发芽。
三、接种
苗木采用黑木相思组培苗以及网脉相思、南洋楹和银合欢的种子，基质用Jensen’s无氮水培液拌湿、121℃灭菌1h的1:1(蛭石：珍珠岩)，选用直径为1.8cm的试管，试管顶部用锡箔纸包覆。取长势接近的相思组培瓶苗，用蒸馏水将根部琼脂清洗干净后栽种于试管中，每管移栽1株苗，育苗期间按照常规育苗方法管理。移栽1个月后进行接种，每个试管内注入增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)RITF1218菌液(菌体浓度为108CUF/mL)5mL，对照(CK)不接种。试验采用单因素随机区组设计，每个处理10次重复。接种3个月后观察结瘤及生长情况。
三、测定及计算方法
1、统计植株瘤数、瘤重、苗高和鲜重。
2、生物量测定采用植物样品在80℃烘至恒重称干重。
结果如表3所示，黑木相思、网脉相思、南洋楹和银合欢接种增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)RITF1218后，能促进苗木的结瘤数量、鲜重和生物量，且与黑木相思形成的结瘤较多。黑木相思接种增城中慢生根瘤菌RITF1218后苗高、鲜重和生物量增加分别为7.906％、57.813％和42.114％；银合欢接种增城中慢生根瘤菌RITF1218后对苗高、根长、鲜重以及生物量的促进作用比其他几个树种更明显；南洋楹和网脉相思接种后只对鲜重和生物量有促进作用。
表3 代表豆科植物接种博罗中慢生根瘤菌RITF1218T后的生长情况

Claims (2)

1.增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)RITF1218，其保藏编号为CCTCCNO：M 2014492。
2.权利要求1所述的增城中慢生根瘤菌(Mesorhizobium zengchengense)RITF1218在制备固氮微生物菌剂或生物有机肥中的应用。
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