CN104762226B - 一种博罗中慢生根瘤菌及其应用 - Google Patents

一种博罗中慢生根瘤菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104762226B
CN104762226B CN201410768012.9A CN201410768012A CN104762226B CN 104762226 B CN104762226 B CN 104762226B CN 201410768012 A CN201410768012 A CN 201410768012A CN 104762226 B CN104762226 B CN 104762226B
Authority
CN
China
Prior art keywords
boluo
autoinducer
ritf741
lovers
boluoense
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201410768012.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104762226A (zh
Inventor
陆俊锟
朱亚杰
康丽华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Original Assignee
Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry filed Critical Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority to CN201410768012.9A priority Critical patent/CN104762226B/zh
Publication of CN104762226A publication Critical patent/CN104762226A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104762226B publication Critical patent/CN104762226B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Abstract

本发明公开了一种博罗中慢生根瘤菌及其应用。博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741，该菌于2014年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014491。本发明是从黑木相思根瘤中分离筛选出的博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741，该菌株能与黑木相思(Acacia melanoxylon)、网脉相思(Acacia aneura)、南洋楹(Albizia falcataria)和银合欢(Leucaena leucocephala)等共生结瘤，具有较强的抗逆性，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

Description

一种博罗中慢生根瘤菌及其应用
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及一种增城中慢生根瘤菌及其应用。
背景技术：
空气中约有78％的氮气，而仅有部分微生物能够固定游离态的氮，然后转化成化合态氮才能够被动植物吸收利用，也就是所说的生物固氮。为了提高经济效益，化学氮肥在农林牧业生产中得到了广泛应用。但是化肥的应用造成了大量的能源消耗、水土污染，甚至破坏了生态平衡。近年来，环境问题已是全球关注的重点，国家也提出了可持续发展战略方针，为了改善生存条件、维持生态平衡，生物固氮这种无污染且高效的固氮方式日益受到重视。林业在保持水土、防风固沙以及改善土壤等方面都有重要作用，林业树种的栽培也引起了广泛关注。但是树种的生长周期较长，立地条件复杂，施肥较困难，所以研究者希望通过生物固氮来为其提供所需氮源，提高林木生长速率，增加经济效益。
随着环保意识的深入人心，生物制剂与化工产品相比具有无污和经济效益较高等特点，因此广受青睐。一些树种的种植栽培很大程度上依赖根瘤菌提供的氮源，所以研究和开发微生物肥料是林业发展的必要举措。
相思树种(Acacia)是我国除台湾相思是原产的之外，其他树种均是国外引进。它具有生长快、适应性强、耐干旱、耐贫瘠、可以与根瘤菌形成固氮共生体等特点，可用于改良土壤和木材制造等。目前在广西、福建、广东和海南等地进行了规模化种植，创造了良好的经济效益，同时在生态环境建设中发挥了重要作用。选择合适的根瘤菌制作菌肥是提高林业生产、创造经济价值和改善生态环境的重要环节。
微生物肥料制作的关键在于菌种。目前限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈是优良菌株的选育问题。林业生产迫切需求固氮能力强、抗逆性强的微生物肥料生产用菌株。
发明内容：
本发明的目的是提供一种能够与黑木相思、网脉相思、南洋楹和银合欢形成有效固氮根瘤的新菌种—博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741，该菌于2014年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014491。
本发明是从黑木相思根瘤中分离筛选出的博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumboluoense)RITF741，该菌株能与黑木相思(Acacia melanoxylon)、网脉相思(Acaciaaneura)、南洋楹(Albizia falcataria)和银合欢(Leucaena leucocephala)等共生结瘤，具有较强的抗逆性，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
本发明的Mesorhizobium boluoense RITF741于2014年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014491。
附图说明：
图1是博罗中慢生根瘤菌的16S rRNA与参比菌株的系统发育树。
图2是采用最大似然法构建的博罗中慢生根瘤菌的持家基因recA,glnII和atpD的序列系统发育树。
图3是博罗中慢生根瘤菌RITF741的氧化酶还原反应。
图4是API 50CH测定博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741的生理生化 反应。
图5是黑木相思幼苗接种博罗中慢生根瘤菌RITF741的结瘤情况。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
YMA培养基：甘露醇10.0g，谷氨酸钠0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl0.01g，酵母粉0.5g，琼脂粉17g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。灭菌备用。
Jensen’s无氮营养液：K2HPO40.05g，NaCl 0.05g，MgSO4·7H2O 0.05g，CaHPO40.25g，FeCl30.05g，1mL微量元素溶液(H3BO32.86g/L，MnSO4·H2O 2.08g/L，ZnSO4·7H2O 0.022g/L，CuSO4·7H2O 0.08g/L，NaMoO40.11g/L)，蒸馏水1000mL。灭菌备用。
实施例1：博罗中慢生根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909的分离与鉴定
一、根瘤菌的分离
菌株分离自广东省惠州市和增城市黑木相思的根瘤。根瘤用自来水冲洗干净表面泥沙，于95％酒精浸泡30秒后，放入0.1％升汞溶液中表面消毒5分钟，无菌水冲洗8次。将经表面消毒后的根瘤放在两片无菌载玻片之间，用力挤压使根瘤破碎，用无菌接种针沾取根瘤液在YMA平板上划线，28～30℃恒温培养箱培养至菌落出现，挑取典型菌落纯化及鉴定。由此纯化得到根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909。
二、根瘤菌的鉴定
从以下几个方面鉴定根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909：
1、形态学鉴定
将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化的根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。
对于处于对数生长期的根瘤菌，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明，上述步骤一分离纯化的3株根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909为革兰氏阴性杆菌，菌落圆形凸起，乳白色，半透明，表面光滑，边缘整齐。
2、生理生化特征分析
API 50CH和API 20NE用来分析代表根瘤菌RITF741的生理生化特征。如图3和4。
所述根瘤菌的生理生化特征测定结果如下：
根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909的菌落黏稠，边缘整齐。菌株能利用甘氨酸、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、L-木糖、D-侧金盏花醇1、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、肌醇、山梨醇、熊果苷、七叶灵、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-密二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-棉籽糖、木糖醇、D-松二糖、D-来苏糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖和D-阿拉伯醇。菌株在赤藻糖醇、L-山梨糖、甲基-αD-吡喃葡萄糖苷、水杨苷、D-龙胆二糖、D-塔格糖、L-阿拉伯糖、5酮葡萄糖酸钾和苹果酸中生长缓慢。但是菌株不能利用甲基-βD吡喃木糖苷、卫矛醇、甲基-αD-吡喃甘露糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、苦杏仁苷、菊粉、D-松三糖、淀粉、糖原、葡萄糖酸盐、2酮葡萄糖酸钾、葵酸、己二酸、柠檬酸和苯乙酸。氧化酶还原反应、硝酸盐还原反应和半乳糖苷酶反应为阳性，吲哚反应、葡糖糖酸化反应、精氨酸水解反应、脲酶反应和明胶蛋白酶水解反应均为阴性。
3、16S rRNA序列测定及系统发育分析
常规方法培养根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16S rRNA通用引物，27F：5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’，1492R：5’－TACGGTTACCTTGTTACGACTT－3’进行PCR反应。反应程序为：95℃变性1min、56.7℃ 1min、72℃延伸1.5min，共30个循环。DNA测序由英潍捷基(上海)生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAMAN软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库在线完成。
根瘤菌RITF741的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，用邻接法建树系统发育树(图1)，显示了RITF741和其他中慢生根瘤菌种群之间的亲属关系。根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909菌株的3个编码蛋白质的持家基因recA、glnII、atpD系统发育树见图2。根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909菌株与其它中慢生根瘤菌之间的16S rRNA和3个蛋白质编码基因的相似性范围见表1。
表1博罗中慢生根瘤菌种内及与其它代表菌株间的基因的相似性
4、DNA同源性分析
利用常规方法大量提取3株根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909以及参比菌株DNA。 选取的参比菌株在基因型和表现型方面与供试根瘤菌较为相似，分别是M.shonenseAC39AT、M.abyssinicae AC98cT、M.hawassense AC99bT、M.septentrional SDW014T、M.silamuruense CCBAU 01550T。采用复性速率法对菌株的DNA同源性进行测定。结果见表2。
表2供试根瘤菌与相近参比菌株的DNA同源性
结果表明，所述的3株根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909之间的DNA同源性高于73％，而与参比菌株同源性低于60％，属于根瘤菌的新种。根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF909的(G+C)mol％含量分别为64.1、63.3、64.1，结果与已报道的中慢生根瘤菌属菌株的(G+C)mol％含量值相似。
5、菌株脂肪酸测定
脂肪酸种类及含量测定采用MIDI Sherlock微生物鉴定系统，根瘤菌RITF741细胞中 含有6种脂肪酸，其中19:0 cyclo ω8c和Summed Feature8含量最高(表3)。
表3 RITF741和相近中慢生根瘤菌的脂肪酸类型
Summed feature 3包含iso-C152-OH和/或C16:1ωv7c(或16:1ω7c/16:1ω6c和/或16:1ω6c/16:1ω7c,当标记为).Summed feature 5包含17:1iso I/anteiso B和/或17:1anteiso B/I I.Summed feature 7包含18:1cis 11/t9/t6和/或18:1trans 9/t6/c11.Summed feature 8包含C18:1ω6c/C18:1ω7。
该数据是用MIDI系统检测所得，数据库为 TSBA6 。菌株: 1, RITF741T； 2,RITF1220； 3,RITF909； 4, M. shonense AC39AT； 5, M. abyssinicae AC98cT； 6, M.hawassense AC99bT； 7, M.septentrional SDW 014T； 8, M. silamuruense CCBAU01550T. -, 未检测到。
鉴于上述形态、生理生化特征、16S rRNA 序列测定及系统发育分析、DNA同源性分析及脂肪酸等结果，将步骤一分离纯化得到的3株根瘤菌鉴定为博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense) 。其中根瘤菌RITF741命名为： 博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741，由于其是模式菌株，其模式菌株名为：博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense sp. nov)RITF741 T，该菌于2014年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014491。
实施例2、博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741接种黑木相思、网脉相思、南洋楹和银合欢的效应
一、菌液培养
将博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741斜面上活化后转入YMA液体培养基，28-30℃摇床振荡培养(转速150转/分钟)至对数生长后期，得到博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741菌液。
二、种子处理与萌发
先用浓硫酸浸泡种子半小时，然后将浓硫酸倒出，再用无菌水洗涤7～8次后，用无菌水浸泡到种子膨胀。将处理过的种子放在无菌培养皿中(内垫无菌滤纸加无菌水保湿)，置于30℃培养箱中发芽。
三、接种
苗木采用黑木相思组培苗以及网脉相思、南洋楹和银合欢的种子，基质用Jensen’s无氮水培液拌湿、121℃灭菌1h的1:1(蛭石：珍珠岩)，选用直径为1.8cm的试管，试管顶部用锡箔纸包覆。取长势接近的相思组培瓶苗，用蒸馏水将根部琼脂清洗干净后栽种于试管中，每管移栽1株苗，育苗期间按照常规育苗方法管理。移栽1个月后进行接种，每个试管内注入上述博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741菌液(菌体浓度为108CUF/mL)5mL，对照(CK)不接种。试验采用单因素随机区组设计，每个处理10次重复。接种3个月后观察结瘤及生长情况。
三、测定及计算方法
1、统计植株瘤数、瘤重、苗高和鲜重。
2、生物量测定采用植物样品在80℃烘至恒重称干重。
结果如图5和表4所示，黑木相思、网脉相思、南洋楹和银合欢接种博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741后，能促进苗木的结瘤数量。黑木相思接种博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741后可以促进鲜重和生物量提高，比对照分别提高37.42％、17.97％；银合欢接种后对苗高、根长、鲜重以及生物量都有促进作用；南洋楹接种后能促进根长、鲜重和生物量；网脉相思接种后只对鲜重有促进作用。
表4代表豆科植物接种博罗中慢生根瘤菌RITF741后的生长情况

Claims (1)

1.博罗中慢生根瘤菌（Mesorhizobium boluoense）RITF741在制备固氮微生物菌剂或生物有机肥中的应用，所述的博罗中慢生根瘤菌（Mesorhizobium boluoense）RITF741，其保藏编号为CCTCC NO：M 2014491。
CN201410768012.9A 2014-12-12 2014-12-12 一种博罗中慢生根瘤菌及其应用 Expired - Fee Related CN104762226B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410768012.9A CN104762226B (zh) 2014-12-12 2014-12-12 一种博罗中慢生根瘤菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410768012.9A CN104762226B (zh) 2014-12-12 2014-12-12 一种博罗中慢生根瘤菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104762226A CN104762226A (zh) 2015-07-08
CN104762226B true CN104762226B (zh) 2018-07-03

Family

ID=53644321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410768012.9A Expired - Fee Related CN104762226B (zh) 2014-12-12 2014-12-12 一种博罗中慢生根瘤菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104762226B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1757716A (zh) * 2005-07-25 2006-04-12 中国林业科学研究院热带林业研究所 根瘤菌与解磷芽孢杆菌共培养发酵方法
CN103013856A (zh) * 2012-11-21 2013-04-03 中盈长江国际新能源投资有限公司 中慢生根瘤菌kdrm611及其应用
CN103045500A (zh) * 2012-11-21 2013-04-17 中盈长江国际新能源投资有限公司 中慢生根瘤菌kdrm295及其应用
CN103045501A (zh) * 2012-11-21 2013-04-17 中盈长江国际新能源投资有限公司 中慢生根瘤菌kdrm283及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1757716A (zh) * 2005-07-25 2006-04-12 中国林业科学研究院热带林业研究所 根瘤菌与解磷芽孢杆菌共培养发酵方法
CN103013856A (zh) * 2012-11-21 2013-04-03 中盈长江国际新能源投资有限公司 中慢生根瘤菌kdrm611及其应用
CN103045500A (zh) * 2012-11-21 2013-04-17 中盈长江国际新能源投资有限公司 中慢生根瘤菌kdrm295及其应用
CN103045501A (zh) * 2012-11-21 2013-04-17 中盈长江国际新能源投资有限公司 中慢生根瘤菌kdrm283及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
黑木相思根瘤菌遗传多样性;窦雅静等;《微生物学报》;20121204;第52卷(第12期);第1441页表1 *
黒木相思根瘤菌ACC脱氨酶活性的研究;窦雅静等;《中南林业科技大学学报》;20141115;第34卷(第11期);第77-83页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104762226A (zh) 2015-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104263684B (zh) 一种产铁载体类芽孢杆菌及其应用
CN104946554B (zh) 一种粘质沙雷氏菌及其用途
CN108949584A (zh) 一种抗盐耐碱的土曲霉菌株、其its序列及应用
CN108220169B (zh) 一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选及其鉴定方法
CN102586142A (zh) 一种用于防治黄瓜霜霉病的枯草芽孢杆菌及其微生物菌剂
CN102391960A (zh) 一种根际促生菌及其应用
CN103266073A (zh) 一种东南景天内生菌及其应用
CN107384811A (zh) 一种白囊耙齿菌及其应用
CN102796671A (zh) 一种降解辛硫磷的淡紫拟青霉菌株及其应用
CN103981101B (zh) 一种dse菌株及其在甘蔗生产上的应用
CN106399156B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其在马尾藻生物降解中的应用
CN110218670A (zh) 一株具有良好定殖能力的硒氧化型根瘤菌t3f4及其应用
Pinzari et al. Metabolic profiling of Minimedusa polyspora (Hotson) Weresub & PM LeClair, a cellulolytic fungus isolated from Mediterranean maquis, in southern Italy
CN104560817B (zh) 一株产植酸酶的嗜热地衣芽孢杆菌utm102及其应用
CN109321500A (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治油茶炭疽病害中的应用
CN109182194A (zh) 一株促进小冠花生长的杨凌根瘤菌及其培养方法与应用
CN108841748A (zh) 中华根瘤固氮菌株系h6及其应用
CN105060499B (zh) 一种提高养殖水体透明度的复合微生态制剂及其应用
CN106591173A (zh) 一种可活化土壤重金属镉的弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus）HL‑37及其应用
CN102703365B (zh) 一株具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌
CN105861373A (zh) 一种产角蛋白酶的铜绿假单胞菌及其应用
CN107446867B (zh) 一种红壤旱地非共生固氮菌及其培养方法和应用
CN104762226B (zh) 一种博罗中慢生根瘤菌及其应用
CN104498381B (zh) 一种惠州中慢生根瘤菌及其用途
CN102409018B (zh) 一株简单节杆菌及其培养方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180703

Termination date: 20201212