KR100818611B1 - 신규한 토양 미생물, 상기 토양 미생물로부터 분리된신규한 베타트랜스아미나제, 상기 베타트랜스아미나제를암호화하는 유전자 및 이들을 이용하여 광학적으로 순수한베타아미노산과 그 유도체를 생산하는 방법 - Google Patents

신규한 토양 미생물, 상기 토양 미생물로부터 분리된신규한 베타트랜스아미나제, 상기 베타트랜스아미나제를암호화하는 유전자 및 이들을 이용하여 광학적으로 순수한베타아미노산과 그 유도체를 생산하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100818611B1
KR100818611B1 KR1020060078204A KR20060078204A KR100818611B1 KR 100818611 B1 KR100818611 B1 KR 100818611B1 KR 1020060078204 A KR1020060078204 A KR 1020060078204A KR 20060078204 A KR20060078204 A KR 20060078204A KR 100818611 B1 KR100818611 B1 KR 100818611B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
acid
amino
phenylpropionic
beta
phenylpropionic acid
Prior art date
Application number
KR1020060078204A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080016287A (ko
Inventor
김병기
김주한
경도현
윤형돈
Original Assignee
재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인서울대학교산학협력재단 filed Critical 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority to KR1020060078204A priority Critical patent/KR100818611B1/ko
Publication of KR20080016287A publication Critical patent/KR20080016287A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100818611B1 publication Critical patent/KR100818611B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Abstract

본 발명은 토양으로부터 방향족 베타아미노산을 유일한 질소원으로 포함하는 최소배지를 이용하여 분리한 광학선택성이 높은 베타트랜스아미나제 활성을 갖는 신규한 미생물인 메조리조비움 sp. LUK (Mesorhizobium sp. LUK)와 상기 분리된 미생물로부터 분리 정제한 베타트랜스아미나제를 암호화하는 유전자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 분리된 토양 미생물 또는 이의 세포 파쇄물로부터 수득된 방향족 베타트랜스아미나제 추출물을 생촉매로 이용하여 광학적으로 순수한 방향족 L형- 또는 D형-베타아미노기 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
베타아미노산, 트랜스아미나제, 베타트랜스아미나제

Description

신규한 토양 미생물, 상기 토양 미생물로부터 분리된 신규한 베타트랜스아미나제, 상기 베타트랜스아미나제를 암호화하는 유전자 및 이들을 이용하여 광학적으로 순수한 베타아미노산과 그 유도체를 생산하는 방법 {A NOVEL SOIL MICROORGANISM, A NOVEL BETA TRANSAMINASE SEPERATED FROM THE SOIL MICROORGANISM, A GENE ENCODING THE BETA TRANSAMINASE, AND A METHOD FOR PRODUCING ENANTIOMERICALLY PURE BETA AMINO ACIDS AND THEIR DERIVATIVES BY USING THE SAME}
도 1은 본 발명에 사용한 화합물의 구조식 및 광학적으로 순수한 베타아미노산 및 그 유도체를 생산하는 방법의 개략적인 모식도이다.
도 2는 베타아미노산을 질소원으로 자라는 신규한 토양미생물 메조리조비움 sp. LUK 의 16S DNA의 서열 (서열번호 1)이다.
도 3은 메조리조비움 sp. LUK 로부터 생산된 베타트랜스아미나제의 염기 및 아미노산 서열 (서열번호 2 및 3)이다.
도 4는 라세믹 DL-3-아미노-3-페닐프로피온산을 신규한 베타트랜스아미나제로 광학분할하여 얻은 베타트랜스아미나제의 광학선택성 분석결과이다. (2)번 위치의 D-3-아미노-3-페닐프로피온산이 없어지면서, (1)번 위치의 L-3-아미노-3-페닐프로피온산이 농축되었다.
도 5는 신규한 베타아미노트랜스퍼라제로부터 3-케토-3-페닐프로피온 에틸에스테르로부터 광학적으로 순수한 D-3-아미노-3-페닐프로피온산의 광학순도 분석결과이다. 아래의 크로마토그램은 D/L형 화합물의 혼합물의 크로마토그램이며, 위의 크로마토그램은 베타트랜스아미나제를 이용하여 제조한 베타아미노산의 분석크로마토그램이다. 1 위치의 L형-화합물은 전혀 생산되지 않았고, 오직 2 위치의 D형-화합물만 생성되었다.
본 발명은 토양에서 분리한 베타아미노산을 질소원으로 하여 자라는 신규한 토양미생물을 분리하여, 분리한 토양미생물 또는 미생물의 세포추출물 또는 분리한 미생물로부터 정제한 베타아미노산에 기질 특이성을 가지는 트랜스아미나제, 또는 그 트랜스아미나제를 발현하는 유전자를 포함한 재조합 단백질, 또는 재조합 단백질을 암호화하는 발현벡터를 포함하는 재조합 균주 등을 생촉매로 이용하여 광학순도가 높은 천연 또는 비천연 베타아미노산을 효과적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 분리한 토양미생물 및 이로부터 분리한 베타아미노산에 특이성을 가지는 트랜스아미나제, 그리고 그 트랜스 아미나제를 암호화하는 유전자에 관한 것이다.
베타아미노산 및 그들의 유도체와 구조적으로 베타아미노산을 포함하는 화합 물들은 독특한 약리 활성을 보여 항생제 (sugawara 1998), 항암제 (Corbett 1997) 또는 항진균제 (Crews 1986)등으로서의 효과를 보인다. 이들 중 탁솔화합물들은 베타아미노산을 포함한 약리화합물로 중요한 예이다 (Ojima 1999). 또한, 베타아미노산을 포함한 펩티드 화합물은 알파아미노산에 비하여 생리조건에서 단백질 분해효소에 대한 저항성이 있어 각종 펩티드 신약의 연구에도 중요하게 쓰여왔다 (DeGrado 1999).
베타아미노산의 중요성에 입각하여, 각종 베타아미노산의 합성법이 화학적인 방법 (Angelaud 2005, Murahashi 2002, Palomo 1999)으로 연구 되어 왔다. 특히 광학활성을 가진 아미노산 화합물과 그 유도체들에서는 광학적으로 순수한 한가지의 화합물만이 의약활성을 나타내는 것이 대부분이다. 예를 들어, L-형 비천연 방향족 아미노산의 한 종류인 L-호모페닐알라닌의 경우, 고혈압 및 심장혈관질환의 효과적인 치료제로서, 현재 광범위하게 사용되고 있는 베나제프릴 (Benazepril), 에나라프릴 (Enalapril), 리시노프릴 (Lisinopril) 등의 ACE 저해제 생산의 중요한 중간체로 사용되고 있는 물질로서, L-호모페닐알라닌만이 중간체로서 생물학적 활성이 있다고 알려져 있다 (Iwasaki, 1989). 또한, 천연 방향족 아미노산인 L-페닐알라닌은 합성감미료인 아스파탐의 중간체로서 광학이성질체인 D-페닐알라닌이 불순물로 함유될 경우, 아스파탐의 맛 기능을 저하시키는 것으로 보고되어 있으며, 광학활성 의약품인 L-도파의 중간체로 사용될 수 있는 티로신의 경우에도 L-형만이 활성을 나타낸다 (Chan, 1993). 비천연 방향족 아미노산의 일종인 L-히드록시페닐글리신을 중간체로 포함하는 반코마이신, 클로로에레모마이신, 콤플레스타틴 등의 항생제의 경우, L-히드록시페닐글리신만이 활성을 나타내며 (Hubbard, 2000), 당뇨병치료에 사용되는 L-피라조일알라닌, L-트리아조일알라닌, L-아자인도일알라닌 등의 베타헤테로사이클릭알라닌 유도체들도 L-형만이 활성을 나타낸다 (Rolland-Fulcrand et al, 2000). 베타아미노산의 합성법도 이에 따라 광학적으로 순수한 베타아미노산 화합물을 개발하는 방법들이 소개되었다 (Juaristi 1997, Lelais and Seebach 2004).
광학활성 화합물을 생산하는데 있어서, 효소를 이용하는 방법은 화학합성법에 비하여 높은 광학순도를 수득하거나, 효소의 독특한 위치선택적 반응으로 화학공정의 많은 과정을 대체하여 경제적으로 유용한 기술을 제공한다. 따라서, 광학적으로 순수한 아미노산을 광학특이적으로 생산할 수 있는 방법에 관하여 오랫동안 연구되었으며, 현재 일반적으로 비천연 아미노산을 생산하는 효소적 방법으로는 리파아제 (Houng et al . 1996, 미국특허 제5,552,318 호), 하이단토이나제 (미국특허 제 5,552,327 호), 탈수소효소 (Asano et al. 1990, Stewart 2001, 미국특허 제 5,053,328 호), 아미노아실라제 (미국특허 제 5,552,317 호, 제 6,008,386 호, 제 4,670,395 호, 제3,907,638 호, 제 3,816,254 호), 아미노산 산화효소, 트랜스아미나제 (미국특허 제4,518,692 호, 제 5,919,669 호, 제5,962,281 호, 국제공개 WO98/53088)를 이용하는 공정이 보고되어 있다.
이러한 효소적 방법은 크게 광학분할을 이용하는 경우와 비대칭 합성을 이용하는 경우로 크게 나누어 볼 수 있다.　 이 중 광학분할을 이용하는 경우로는 아미노아실라제, 리파아제, 하이단토이나제, 아미노산 산화효소 등이 해당하고, 비대칭 합성을 이용하는 경우로는 탈수소효소와 트랜스아미나제 (아미노기 전이효소) 등이 속한다.　 상기한 아미노아실라제 또는 리파아제의 경우, 화학적으로 합성된 라세믹 유도체기질 (예를 들어, 아미노산 에틸에스테르)을 광학 분할하여 생산하는 방법으로서 주생산 공정 이외의 라세믹 기질의 화학적 또는 효소적으로 합성하는 과정이 필요하다.　 또한, 하이단토이나제를 사용하는 경우는 하이단토인의 가수분해공정에 필요한 하이단토이나제와 생성된 카바모일기를 다시 가수분해하는 카바모일라제의 2 개의 효소를 사용하여야 하는 것과 기질의 용해도가 낮아 고농도 반응이 어려운 단점이 있다.　 아미노산 산화효소를 이용하는 공정의 경우는 반응생성물인 과산화수소가 효소를 실활시키는 것이 큰 단점이며, 이 문제를 해결하기 위해 카탈라제 또는 퍼옥시다제 등의 과산화수소를 기질로 사용하는 효소를 동시에 사용해야 한다.　 또한, 위에서 열거한 광학분할을 이용한 생산공정은 라세믹체 기질을 이용하므로 이론 수율이 50% 라는 단점이 있다.
탈수소효소를 사용하는 경우는 환원적 아민화 반응을 통하여 케토산 기질을 비대칭적으로 변환시키는 방법을 이용하며, 케토산을 사용하는 면에서는 트랜스아미나제의 공정과 매우 흡사하나, 주 효소공정보다 고가의 조효소의 연속적 재생공정이 필요하게 되는 단점이 있다.　 트랜스아미나제를 이용하는 생산공정은 탈수소효소를 사용하는 공정과 비슷하게 케토산을 기질로 사용하며 조효소의 재생공정이 필요하지 않아 효과적인 공정을 구성할 수 있다.
트랜스아미나제는 사용되는 기질의 카르복실기의 위치에 기준하여 아미노기가 도입되는 위치에 따라 알파트랜스아미나제와 오메가트랜스아미나제로 분류되며, 알파아미노산의 알파아미노기를 전이하는 알파트랜스아미나제와는 달리 오메가아미노트랜스라제는 알파위치 이외의 아미노기를 전이하는 대표적인 반응을 가짐으로써 알파자리가 아닌 다른 위치의 아미노기 전이 특성을 가진다 (Yonaha et al, 1980; Christen et al, 1985). 이 중 베타트랜스아미나제는 오메가트랜스아미나제의 일종으로 극히 예외적으로 보고되어, 알킬베타트랜스아미나제가 보고된바 있으며 (Yun 2004), 최근에는 알칼리지너스 유트로푸스 균주와 바리오보락스 파라독서스 균주가 베타트랜스아미나제의 특성을 가지는 균주로 보고되어 특허출원된 바 있으나, 효소의 특성은 자세히 밝혀진 바가 없다 (Banerjee 2005, 국제공개 WO2005/005633).
이와 같은 상황에서, 본 발명은 토양에서 분리한 베타아미노산을 질소원으로 이용하는 신규한 미생물을 분리하여, 이로부터 얻은 베타트랜스아미나제 유전자, 상기 유전자를 혼입한 벡터, 상기 유전자로 형질 전환된 대장균 균주에 관한 것과 신규 미생물의 전세포, 또는 미생물의 세포 추출물, 세포 추출물의 부분 정제분획, 또는 베타트랜스아미나제의 형질 전환 균주를 사용하여 광학선택적으로 베타아미노산 및 이의 유도체를 생산하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명에서는 우선적으로 방향족 베타아미노산을 아미노기 공여체로 사용하는 방향족 트랜스아미나제를 함유하고 있는 미생물을 토양으로부터 선별하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
트랜스아미나제에 의한 아미노기 전이반응은 평형상수가 1이기 때문에, L형- 베타아미노산을 아미노기 공여체로 사용하는 미생물이나 그 트랜스아미나제를 이용한 광학분할반응에서 L형-베타아미노산을 제거하여 광학순도가 높은D형-베타아미노산을 선택적으로 생산하거나, 반대로 글루탐산 등의 아미노산을 아미노기 공여체로 이용하여 L형-베타아미노산의 케토산이나 그 유도체로부터 방향족 L형-베타아미노산을 비대칭 합성할 수 있으므로, 이러한 미생물이나 정제한 트랜스아미나제 또는 그 전이효소의 재조합 단백질 또는 재조합 균주 등을 생촉매로 사용함으로써 D형- 또는 L형-베타아미노산을 수득할 수 있다.　
그러므로, 본 발명은 또한 상기 미생물이나 그 트랜스아미나제 또는 그 재조합 단백질이나 재조합 균주를 이용하여 베타아미노산의 아미노기 전이반응을 수행하여 원하는 D형- 또는 L형-베타아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명에서는 우선적으로 D형-베타아미노산을 아미노기 공여체로 사용하는 베타트랜스아미나제를 함유하고 있는 미생물을 토양으로부터 선별, 신규한 베타트랜스퍼라제의 유전자 및 관련 ORF를 클로닝하여 DNA 서열을 결정하였다.
본 발명은 L형 광학선택성이 높은 베타트랜스아미나제 활성을 갖는 신규한 토양미생물 및 이를 이용하여 L형- 및 D형-베타아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 신규한 베타트랜스아미나제 및 이를 암호화하는 유전자에 대한 내용이다. 즉, 본 발명은 일차적으로 토양으로부터 베타아미노산을 유일한 질소원으로 포함하는 최소배지를 이용하여, 토양으로부터 D형- 베타아미노산에 대 한 광학선택성 및 높은 트랜스아미나제 활성을 갖는 신규한 미생물을 분별하고, 이로부터 신규한 베타트랜스아미나제 및 이를 암호화하는 유전자를 클로닝하며, 이러한 미생물 또는 그 추출물, 또는 정제된 D형 광학선택성 베타트랜스아미나제나 그 재조합 단백질 또는 재조합 균주를 이용하여 광학적으로 순도가 높은 L형- 또는 D형- 베타아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.
즉, 신규한 베타트랜스아미나제와 이를 암호화하는 유전자 서열을 제공하고, 정제된 베타트랜스아미나제를 이용하여 베타아미노산을 광학특이적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 미생물로서는, 특히 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganism)에 2006년 5월 8일자로 기탁번호 KCCM-10752P로 기탁된 메조리조비움 sp. LUK (Mesorhizobium sp. LUK)을 포함하는 미생물이다.
구체적으로, 본 발명은, 상기 메조리조비움 sp. LUK (Mesorhizobium sp. LUK) KCCM-10752P 및 그 세포 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 메조리조비움 sp. LUK 또는 그 세포 추출물을 생촉매로 사용하고, 광학분할 또는 비대칭 합성을 이용하여 L형- 또는 D형-베타아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 D형-베타아미노산을 생산하는 방법에서 리파제를 추가로 첨가하여 반응시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 DNA서열을 포함하는 베타트랜스아미나제 유전자 및 이를 포함하는 재조합 DNA 벡터, 그리고 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙 주세포를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것으로 당업자라면 그 의미를 누구나 이해할 수 있을 것이나, 본 명세서에서 간략히 설명하면 다음과 같다:
(1) 트랜스아미나제 (아미노기 전이효소) - 아미노기를 한 분자에서 다른 분자로 옮기는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.
(2) 세포 추출물 (트랜스아미나제 추출물) - 베타트랜스아미나제가 포함된 본 발명의 메조리조비움 sp. LUK 미생물의 세포추출물을 의미한다.
(3) 전세포 반응 - 특정 효소를 포함하는 세포를 파쇄하여 세포 내용물을 이용하거나 또는 효소를 분리정제하지 않고 온전한 세포 전체를 이용한 반응을 의미한다.
(4) 비대칭 합성 - 비광학물질 (achiral compound)에 광학적으로 순수하게 기능기를 도입하는 합성방법을 의미한다. 도1의 (B)로 표현되는 바와 같으며, 이때 화합물(5) 또는 화합물(1')로 표현되는 아미노기 공여체에서 베타트랜스아미나제가 아미노기를 떼어내어 각각의 화합물은 화합물(2) 또는 화합물(4)로 전환되며, 베타트랜스아미나제는 다시 화합물(3)으로 표현되는 아미노기 수용체에 떼어낸 아미노기를 전달하여, 광학적으로 순수한 화합물(1-D)로 표현되는 베타아미노산 또는 그 유도체를 생성한다. 단, 화합물 (1')를 아미노기 공여체로 사용하는 경우에는 화합물(1')의 R3 잔기는 화합물(3) 아미노기 수용체의 R1과 상이한 것을 사용한다.
Figure 112006058854268-pat00001
(여기에서, R1, R2, R3, X1, X2, X3및 X4 는 각각 독립적으로 H, C1-C20의 알킬기,
Figure 112006058854268-pat00002
을 나타내고, R4 및 R5는 H, C1-C10의 알킬기, F, Cl, Br, I, NO2, OH, CN 을 나타낸다. 상기 R1, R2, R3, X1, X2, X3및 X4 는 각각 독립적으로 H, 페닐, 티에닐, 푸릴, 나프틸, 메틸페닐, 메틸티에닐, 메틸푸릴 또는 메틸나프틸일 수 있다.)
(5) 방향족 아미노산 - 아미노산 중 측쇄기가 방향족인 것을 의미한다.
(6) 케토산 - 케토카르복시산이라고도 한다. 카르보닐기와 카르복시기가 직접 결합하고 있는 것을 α-케토산, 1개의 탄소원자에 의해 떨어져 있는 것을 β-케토산, 2개, 3개 등의 탄소원자에 의해 떨어져 있는 것을 각각 α-케토산, δ-케토산 등으로 구별한다. 이 중 β-케토산은 대단히 불안정하며, 분해하여 케톤과 이산화탄소가 된다. 본 발명에서는 아미노기 전이반응에서 아미노기를 전달받는 물 질이거나 또는 광학분할 과정에서 생성된 부산물이다.
(7) 아미노기 공여체 - 아미노기 전이반응에서 아미노기를 제공하는 물질을 말한다.
(8) 아미노기 수용체 - 아미노기 전이반응에서 아미노기를 전달받는 물질을 말한다.
(9) 광학분할반응 - 양쪽 거울상이성질체 (enantiomer)가 동일한 비율로 섞여 있는 라세믹 혼합물 (racemic mixture)로부터 순수한 한쪽 거울상이성질체만을 분리 (resolution)해 내는 반응을 의미한다.
본 발명의 경우, 도 1의 (A)와 같으며, 이때 화합물(1)로 표현되는 라세믹 혼합물의 D형 화합물에서 베타트랜스아미나제가 아미노기를 떼어내어 화합물(1)은 화합물(4)로 전환되며 L형인 화합물(1-L)가 광학적으로 농축된다. 떼어낸 아미노기는 화합물(2)로 표현되는 아미노기 수용체에 전달되어 화합물(5)로 전환된다.
Figure 112006058854268-pat00003
(여기에서, R1, R2, X1 및 X2 는 각각 독립적으로 H, C1-C20 의 알킬기,
Figure 112006058854268-pat00004
을 나타내고, R4 및 R5는 H, C1-C10의 알킬기, F, Cl, Br, I, NO2, OH, CN 을 나타낸다. 상기 R1, R2, X1 및 X2 는 각각 독립적으로 H, 페닐, 티에닐, 푸릴, 나프틸, 메틸페닐, 메틸티에닐, 메틸푸릴 또는 메틸나프틸일 수 있다.)
(10) bp - 염기쌍을 의미한다.
(11) 클로닝 - DNA 절편을 재조합 DNA 클로닝 벡터에 혼입시키고 이러한 재조합 DNA를 사용하여 숙주세포를 형질전환시키는 방법을 의미한다.
(12) 코스미드 (cosmid) - 숙주세포 내에서 플라스미드와 동일한 방식으로 복제할 수 있을 뿐 아니라 파지 헤드 (phage head)로 패키징 (packaging)될 수도 있는 플라스미드인 제조합 DNA 클로닝 벡터를 의미한다.
(13) 게놈라이브러리 - 특정 유기체의 실질적으로 모든 DNA 서열을 대표하는 DNA 절편들이 클로닝된 재조합 DNA 클로닝 벡터 세트를 의미한다.
(14) kb - 킬로 염기쌍을 의미한다.
(15) ORF - 오픈리딩 프레임 (Open Reading Frame)을 의미한다.
(16) PCR - 중합 효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction)으로서, DNA의 어떤 영역을 특이적으로 증폭시키는 방법을 의미한다.
(17) 벡터 - 단일가닥, 이중가닥, 원형 또는 초나선 DNA 또는 RNA 로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 벡터는 재조합 단백질을 생산할 수 있도록 적절한 거리에 작동적으로 연결되어 있는 구성요소들을 포함할 수 있다. 이러한 구성요소에는 복제 오리진, 프로모터, 인핸서, 5'mRNA 리더 서열, 리보솜 결합부위, 핵산 카세트, 종결 및 폴리아데닐화 부위, 및 선별가능한 표지 서열 등이 포함될 수 있으며, 상기 구성요소들은 특이적인 용도에 따라 하나 또는 그 이상이 빠질 수 도 있다. 핵산 카세트는 발현할 재조합 단백질의 삽입을 위한 제한효소 부위를 포함할 수 있다. 기능적 벡터에 있어서, 핵산 카세트는 번역 개시 및 종결 부위를 포함하는 발현될 핵산 서열을 함유한다. 벡터 내에는 때로 재조합 단백질의 수거의 편의를 돕기 위한 인트론이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 코딩 서열의 5' 또는 3'에 100bp 이내로 포함될 수 있다. 재조합 벡터의 생산은 때론 특이한 발현 균주를 필요로 하는데, 예를 들어 노바젠의 pET28a 벡터는 그 발현을 위하여 T7 DNA 폴리머라제가 발현되는 BL21(DE3) 대장균 균주를 사용할 수 있으나, 그 발현 균주의 사용은 각각의 벡터에 따라 달라질 수 있다. 이러한 벡터 및 발현 균주는 당업자라면 용이하게 선택할 수 있다.
신규한 베타아미노전이효소를 함유한 미생물의 선별
본 발명의 토양 미생물의 선별을 위해 본 발명자들은 하기 표 1의 조성성분으로 이루어진 광학활성 베타아미노산인 DL-베타호모페닐글리신을 유일한 질소원으로 포함하는 최소배지를 구성하고, 이를 이용하여 토양으로부터 표 1에서 첨가된 DL-베타호모페닐글리신을 질소원으로 사용하고 D-베타호모페닐글리신에 특이성을 갖는 트랜스아미나제를 함유하고 있는 미생물을 선별하였다. ·
베타아미노산을 유일한 질소원으로 포함하는 최소배지성분
구분 성분 조성
탄소원 글리세롤 100 ~ 500mM
질소원 베타아미노산 20 ~ 100mM
완충성분 KH2PO4 K2HPO4 1.31g/L 2.68g/L
미량성분 CaCl2 MgSO4·H2O ZnCl2 MnSO4 CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O NiSO4 H3BO3 Na2MoO4·2H2O FeSO4·7H2O EDTA 0.2 ~ 1mM 1 ~ 5g/L 0.1 ~ 0.5mg/L 0.1 ~ 0.5mg/L 0.1 ~ 0.5mg/L 0.1 ~ 0.5mg/L 0.1 ~ 0.5mg/L 0.02 ~ 0.1mg/L 2 ~ 10mg/L 4 ~ 20mg/L 0.5 ~ 2.5mg/L
고체배지 한천 3%
본 발명의 최소배지를 이용하는 선별방법은 성장 속도에 따라 미생물을 선별하는 간단한 방법으로서, 트랜스아미나제의 활성이 낮은 미생물은 배양단계에서 자발적으로 제거되므로 베타아미노산에 기질특이성을 나타내는 아미노기전이효소를 함유한 고활성 미생물을 선별할 수 있다.
본 발명에서 선별된 미생물은 신규한 것으로서, 본 발명자들은 이의 16S rRNA 부분 서열을 코딩하는 DNA 서열 (서열번호 1)의 특징을 통해 메조리조비움 종으로 파악하고, 이를 메조리조비움 sp. LUK 로 명명하였다.　 또한, 이를 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganism)에 2006년 5월 8일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCCM-10752P 이다.
본 발명의 선별된 메조리조비움 sp. LUK를 이용하여 기질특이성을 확인한 결과, 이 미생물은 방향족 D형-베타아미노산을 아미노기 공여체로 사용하는 방향족 트랜스아미나제를 함유하고 있었다 (표 2).
본 발명의 베타트랜스아미나제의 아미노기 공여체에 대한 기질 특이성
아미노기 공여체 상대활성 (%)
D-베타호모글리신 100
D-베타호모루신 185
D-베타호모알라닌 208
L-페닐알라닌 8.4
L-티로신 6.5
S-알파메틸벤질아민 0.1
페닐프로필아민 0.1
본 발명의 베타트랜스아미나제의 아민 수용체에 대한 특이성
아미노기 수용체 상대활성 (%)
피루빅산 100
메틸피루빅산 90
에틸피루빅산 101
옥살아세트산 37
2-케토글루탐산 111
프로판알 4
본 발명자들은 또한 상기 미생물을 파쇄하여 이를 원심분리하고 원심분리액의 상등액으로부터 트랜스아미나제 추출물을 포함하는 세포추출물을 생산하였다.
베타트랜스아미나제 추출물을 생촉매로 이용한 L형-베타아미노산의 생산방법
상기 수득한 미생물 또는 생산된 베타트랜스아미나제 추출물, 라세믹 베타아미노산 및 피루빅산으로 구성된 반응액으로부터 광학분할 (도1의 (A))하여 L형-베타아미노산을 생산한다. 반응액에는 아미노기 수용체로서 피루빅산, 아미노기 공여체로서 라세믹형의 DL-베타호모페닐글리신이 포함되어 있고, 본 발명의 미생물 또는 생산된 베타트랜스아미나제 추출물을 생촉매로서 반응액에 첨가하여 반응을 개시한다.
본 발명에서 광학분할에 사용할 수 있는 아미노기 수용체로는 구조식 (2)(도 1)로 표현되는 케토산군으로서, 예를 들면 벤조일피루빅산(C6H5), 페닐피루빅산(C6H5CH2), 벤질피루빅산(C6H5CH2CH2), 페닐케토발레릭산 (C6H5CH2CH2CH2), p-토릴글리옥시릭산(CH3C6H4), p-토릴피루빅산(CH3C6H4CH2), p-토릴케토부티릭산(CH3C6H4CH2CH2), p-토릴케토발레릭산(CH3C6H4CH2CH2CH2), 2,6-디메틸페닐글리옥시릭산((CH3)2C6H3), p-에틸페닐글리옥시릭산(C2H5C6H4), p-tert-부틸페닐글리옥시릭산((CH3)3CC6H4), p-tert-부틸페닐피루빅산 ((CH3)3CC6H4CH2), p-이소프로필페닐글리옥시릭산((CH3)2CHC6H4), 2,4,6-트리메틸페닐글리옥시릭산((CH3)3C6H2), 2,3,5,6-테트라메틸페닐글리옥시릭산 ((CH3)4C6H), 2,3,4,6-테트라메틸페닐글리옥시릭산((CH3)4C6H), 펜타메닐페닐글리옥시릭산((CH3)5C6), 2,4,6-트리메틸페닐피루빅산 ((CH3)3C6H2CH2), 디메틸페닐피루빅산(C6H5C(CH3)2), 프탈로닉산((CO2H)C6H4), 3-카르복시페닐글리옥시릭산((CO2H)C6H4), 3-카르복시-4-히드록시페닐글리옥시릭산((CO2H)(OH)C6H3), 3-카르복시페닐피루빅산 ((CO2H)C6H4CH2), 3-카르복시-4-히드록시페닐피루빅산((CO2H)(OH)C6H3CH2), 4-메톡시페닐글리옥시릭산((CH3O)C6H4), p-히드록시페닐글리옥시릭산 ((OH)C6H4), 2,5-디히드록시페닐글리옥시릭산((OH)2C6H3), 2-카르복시메틸페닐글리옥시릭산((CO2H)CH2C6H4), 4-메톡시페닐케토부티릭산 ((CH3O)C6H4CH2CH2), p-히드록시페닐피루빅산((OH)C6H4CH2), p-메틸시오페닐글리옥시릭산(CH3SC6H4), p-브로모페닐글리옥시릭산(BrC6H4), p-클로로페닐글리옥시릭산(ClC6H4), p-플루오르페닐글리옥시릭산(FC6H4), p-요오드페닐글리옥시릭산(IC6H4), o-브로모페닐글리옥시릭산(BrC6H4), m-브로모페닐글리옥시릭산(BrC6H4), 2,4-디클로로페닐글리옥시릭산(Cl2C6H3), 3-플루오르-4-메톡시페닐글리옥시릭산(F(CH3O)C6H3), p-니트로페닐글리옥시릭산((NO2)C6H4), m-니트로페닐글리옥시릭산((NO2)C6H4), p-브로모페닐피루빅산(BrC6H4CH2), p-클로로페닐피루빅산(ClC6H4CH2), p-플루오르페닐피루빅산(FC6H4CH2), o-클로로페닐피루빅산(ClC6H4CH2), m-클로로페닐피루빅산(ClC6H4CH2), p-니트로페닐피루빅산((NO2)C6H4CH2), m-니트로페닐피루빅산((NO2)C6H4CH2), o-니트로페닐피루빅산((NO2)C6H4CH2), 3-요오드-4-히드록시페닐피루빅산((OH)IC6H3CH2), 3,5-디요오드-4-히드록시페닐피루빅산((OH)(I)2C6H2CH2), p-아미노페닐글리옥시릭산(H2NC6H4), p-아미노페닐피루빅산(H2NC6H4CH2), α-나프틸글리옥시릭산(C10H7), β-나프틸글리옥시릭산(C10H7), 4-메틸-1-나프틸글리옥시릭산((CH3)C10H6), 1-나프틸피루빅산(C10H7CH2), 2-나프틸피루빅산(C10H7CH2), 디페닐피루빅산 ((C6H5)2CH), 트리페닐피루빅산((C6H5)3C), 디페닐케토부티릭산((C6H5)2CHCH2) 등이 있으나, 도 1에 표현된 다양한 구조를 포함할 수 있다.
본 발명에서 생산가능한 L형-베타아미노산은 도1의 구조식 (1-L) 로 표현되며, 예를 들면, L-3-아미노-3-페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2-플루오로) 페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3-플로로)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(4-플루오로)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2-클로로)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3-클로로)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(4-클로로) 페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2,3-디클로로)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2,3-디클로로)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2,3-디클로로) 페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2,4-디클로로)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2,4-디클로로)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2,4-디클로로) 페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2-브로모)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3-브로모)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(4-브로모)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2-트리플루오로메틸)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3-트리플루오로메틸)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(4-트리플루오로메틸) 페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3-시안)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(4-시안)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2-니트로)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3-니트로)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(4-니트로) 페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2-메틸)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3-메틸)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(4-메틸)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2-메톡시)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3-메톡시)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(4-메톡시)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2,3-디메톡시) 페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2,3-디메톡시)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2,3-디메톡시)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3.4-디메톡시) 페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3,4-디메톡시)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3,4-디메톡시)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3,5-디메톡시) 페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3,5-디메톡시)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3,5-디메톡시)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2-수산화)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(3-수산화)페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(4-수산화) 페닐프로피온산, L-3-아미노-3-(2-티에닐)프로피온산, L-3-아미노-3-(3-티에닐)프로피온산, L-3-아미노-3-(2-퓨릴)프로피온산, L-3-아미노-3-(1-나프틸)프로피온산, L-베타호모루신, L-베타호모이소루신, L-베타호모아르기닌, L-베타호모아스파라긴, L-베타호모글루타민, L-베타호모아스파틱산, L-베타호모글루탐산, L-베타호모페닐알라닌, L-베타호모프롤린, L-베타호모라이신, L-베타호모메치오닌, L-베타호모쓰레오닌, L-베타호모트립토판, L-베타호모티로신, L-베타호모세린, L-베타호모발린, L-아미노부틸산 등이 있으나, 도1의 구조식 (1-L)로 표현되는 화합물과 그들의 유도체에 다양하게 적용될 수 있다.
아미노기 공여체의 사용농도는 아미노기 수용체인 케토산 농도와 동일하며, 바람직하게는 1 내지 2배이다.　 본 발명의 반응온도는 2 내지 80℃가 바람직하며, 20 내지 70℃가 더 바람직하고, 30내지 45℃가 더욱 바람직하다.　 반응액의 pH는 5 내지 11이며, 5 내지 10이 더 바람직하고, 더욱 바람직하게는 7 내지 8 이다.　 산 또는 염기로 반응액의 pH를 조절할 수 있다.
베타트랜스아미나제 추출물을 생촉매로 이용한 D형-베타아미노산의 생산방법
상기 수득한 미생물 또는 생산된 베타트랜스아미나제 추출물, 아미노기 수용체 (구조식 (3)) 및 아미노기 공여체 (구조식 (5) 또는 (1')로 구성된 반응액으로부터 D형-베타아미노산을 역합성하여 생산한다 (도 1의 (B)).　
본 발명에서 생산가능한 D형-베타아미노산은 도1의 구조식 (1-D) 로 표현되며, 예를 들면, D-3-아미노-3-페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-플루오로) 페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-플로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-플루오로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-클로로) 페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디클로로) 페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,4-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,4-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,4-디클로로) 페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-브로모)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-브로모)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-브로모)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-트리플루오로메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-트리플루오로메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-트리플루오로메틸) 페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-시안)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-시안)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-니트로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-니트로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-니트로) 페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디메톡시) 페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3.4-디메톡시) 페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,4-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,4-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,5-디메톡시) 페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,5-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,5-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-수산화)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-수산화)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-수산화) 페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-티에닐)프로피온산, D-3-아미노-3-(3-티에닐)프로피온산, D-3-아미노-3-(2-퓨릴)프로피온산, D-3-아미노-3-(1-나프틸)프로피온산, D-베타호모루신, D-베타호모이소루신, D-베타호모아르기닌, D-베타호모아스파라긴, D-베타호모글루타민, D-베타호모아스파틱산, D-베타호모글루탐산, D-베타호모페닐알라닌, D-베타호모프롤린, D-베타호모라이신, D-베타호모메치오닌, D-베타호모쓰레오닌, D-베타호모트립토판, D-베타호모티로신, D-베타호모세린, D-베타호모발린, D-아미노부틸산 등이 있으나, 도1의 구조식 (1-D)로 표현되는 화합물과 그들의 유도체에 다양하게 적용될 수 있다.
아미노기 공여체의 사용농도는 아미노기 수용체의 동일하며, 바람직하게는 1 내지 2배이다.　 본 발명의 반응온도는 2 내지 80℃가 바람직하며, 20 내지 70℃가 더 바람직하고, 30내지 45℃가 더욱 바람직하다.　 반응액의 pH는 5 내지 11이며, 5 내지 10이 더 바람직하고, 더욱 바람직하게는 7 내지 8 이다.　 산 또는 염기로 반응액의 pH를 조절할 수 있다.
본 발명자들은 또한 상기 미생물을 파쇄하여 이를 원심분리하고 원심분리액의 상등액으로부터 베타트랜스아미나제 추출물을 포함하는 세포추출물을 생산하였다. 이로부터 순수한 오메가트랜스아미나제를 정제하였으며, 정제된 오메가트랜스아미나제의 N말단 서열을 결정하여 유전자의 클로닝하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예로서 상세히 설명하나, 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.　 하기 실시예에서 특별한 언급이 없으면, 모든 퍼센트는 최종 조성물의 100 중량%를 기준으로 한다.
실시예 1
메조리조비움 sp . LUK ( KCCM -10752P)의 선별
상기 표 1의 최소배지 100mL을 토양시료 10g에 첨가하고, 상온에서 2시간 교반하였다. 혼탁액 1mL을 최소배지 2mL에 첨가하여 30℃에서 2일간 배양하였다. 상기 배양액 1mL을 새로운 최소배지 2mL에 첨가하고 30℃에서 2일간 배양하는 과정을 3회 반복한 후, 배양액 0.2mL을 상기 액체최소배지와 1.5% 한천으로 구성되는 고체최소배지에 플레이팅하여 30℃에서 2일간 배양하여 콜로니를 얻었다. 상기 미생물 콜로니를 새로운 액체최소배지 2mL에 접종하고 30℃에서 2일간 배양하여 반응시키고 활성이 가장 높은 콜로니를 동정한 결과, 메조리조비움 종으로 확인되었으며, 메조리조비움 sp. LUK 로 명명하였다.
실시예 2
베타트랜스아미나제 추출물의 생산
효모추출물(4g/L), 펩톤(8g/L), 염화나트륨(3g/L)으로 구성된 배지(이하, '완전배지'라 함)에 배양된 세포를 PBS완충용액(pH 7)으로 3회 세척하여 회수된 세포외부의 배지성분을 제거하였다.　 회수된 세포(이하 '세포'라 함)를 3배 내지 5배 (부피비)의 10mM 인산완충용액, 20mM 피리독살 5-인산, 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 1mM 페닐메틸설포닐플로라이드, 0.01% (w/w) 2-메르캅토에탄올, 10% 글리세롤로 구성된 완충용액에 혼탁한 후, 음파파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다.　 상기 파쇄 세포 추출물을 12,000rpm에서 30분간 원심분리 후, 상등액을 회수하고 투석하여 최종 베타트랜스아미나제 추출물을 생산하였다.
실시예 3
메조리조비움 sp . LUK 전세포 반응을 이용한 DL - 베타호모페닐글리신에 대한 광학선택성의 확인
완전배지에 라세믹 DL-베타호모페닐글리신을 10mM 농도로 첨가하여 이틀간 배양한 세포 배양액을 고압크로마토그래피를 이용하여 광학분석한 결과, D-베타호모페닐글리신만이 선택적으로 없어지고, L-베타호모페닐글리신이 농축되었다.
실시예 4
베타트랜스아미나제의 정제 및 내부 펩티드 서열 결정
실시예 2에서 얻어진 추출물에 암모늄설페이트을 천천히 가하면서 교반하여 포화도가 25%에 이르렀을 때 평형시간 30분을 가하고 12,000rpm에서 침전시켰다. 이후 상등액을 회수 45%까지 가하여 평형시간 30분후 12,000rmp으로 침전시키고, 이 침전물을 100mM 인산완충용액 (pH 7.0)에 용해시켰다. 이 용해액을 20μM피리독살 5-인산(PLP)이 포함된 50mM 트리스완충용액 (pH 6.0)을 이용하여 막투석하였다. 투석물질은 Q-세파로즈 FF(10mmⅩ20㎝, 파머샤, 스웨덴)을 이용하여 분획하였고, 얻어진 활성 용액을 다시 막투석하였다. 얻어진 막투석 물질은 페닐 세파로즈 FF 컬럼(1mL, 파머샤)를 이용하여 분획을 하고 이를 막투석하여 정제된 베타트랜스아미나제를 획득하였다.
정제된 베타트랜스아미나제의 N 말단 아미노산의 서열은 10% SDS 전기영동의 산물인 겔을 PVDF 막으로 옮긴 후 (바이오 래드), 에드만 분해기법을 이용하는 procise 491 sequencer(어플라이드 바이오시스템, 칼리프)를 이용하여 결정하였다. 분석결과 8개의 아미노산으로 구성된 N-말단 아미노산 서열로, MNEPIGEP가 결정되었다. 내부 펩티드의 서열 결정은 서열결정용 트립신(프로메가)으로 처리후 얻어진 펩티드 단편의 서열을 MALDI MS/MS를 이용하여 일부서열을 결정하였다. 결정된 서열은FFFHM(I 또는L)R 로, 질량분석을 이용하여 I 와 L 은 분자량이 같으므로 구분이 안되었지만, 7개의 내부 아미노산 서열을 확인하였다.
실시예 5
메조리조비움 sp . LUK 으로부터 전체 세포 DNA 단리
완전배지에 배양한 세포를 4℃에서 4,000rpm 으로 10분 원심분리하여 세포를 펠렛화했다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 15mL의 용해(lysis) 완충용액(15% 수크로즈, 25mM EDTA, 25mM Tris 완충용액)으로 녹인후 4℃ 4,000rpm으로 원심분리하여 상등액을 버리고, 라이소자임 (TSB완충용액내에 5mg/mL)을 넣고 37℃ 10분간 반응하였다. 이후 0.5M EDTA 1.2mL를 넣고 37℃ 5분 방치후 10% SDS 1mL를 넣고 70℃에서 10분간 얼음물에 방치 이후 5M 포타슘아세테이트 2.5mL를 넣고 얼음물에 15분 방치하였다. 상기 용액의 양과 동일한 양의 페놀-클로로포름 혼합물 (50:50)을 넣고 30분 혼합하여 준 다음, 4℃, 4000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 획득하였다. 얻어진 용액의 0.5배에 달하는 클로로포름을 더하고 서서히 흔든 이후 4℃ 4000rpm에서 원심분리하고, 다시 상등액을 획득, 이를 50㎍/mL 의 양에 달하도록 RNase처리 37℃ 1시간 반응하였다. 이후 0.8배에 달하는 아이소프로판올과 2.5배에 달하는 에탄올를 첨가하고 서서히 흔들어 준다음 구멍을 막은 파스퇴르 피펫을 이용하여 전체세포 DNA를 수집 에펜튜브에 옮겼다. 완전히 마르도록 건조 후 TE 완충용액으로 녹여 사용하였다.
실시예 6
게놈 코스미드 라이브러리의 제조
실시예 5의 과정을 거처 단리된 전체세포 DNA를 제한 효소 Sau3AI으로 소화 처리하여 10-20kb 크기 범위의 부분-소화된 DNA 단편이 최대농도가 되게하는 효소대 전체 세포 DNA의 적당한 비율을 결정하여 0.5M EDTA를 이용하여 반응을 정지시켰다. 정지된 반응용액은 빙냉된 에탄올을 이용하여 부분-소화된 DNA 단편을 획득하였다. 코스미드 라이브러리의 제조에 사용된 벡터는 선별을 위한 아프라마이신 내성 유전자를 함유하는 pOJ446이었으며 이를 제한효소 BamHI 과 HpaI으로 소화 처리하였다. Sau3AI으로 소화된 게놈 DNA를 pOJ446의 탈인산화된 BamHI부위에 부분-소화된 인서트 대 벡터의 양을 조절하여 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 제조업자의 지시에 따라 기가팩 Ⅲ 골드 패키징 익스트렉트 (스트라타진)을 이용하여 패키징시키고, 이를 대장균 균주 XLI-blue MRF 세포를 이용하여 재조합하였다. 암프라마이신 함유한 완전배지에서 콜로니가 획득되었다.
실시예 7
코스미드 라이브러리의 스크리닝 및 베타트랜스아미나제 유전자를 포함하는 코스미드의 확인
실시예 4에서 획득된 N 말단 및 내부 펩티드 서열을 이용 역전사 시켜 프라이머를 제작, PCR을 하여 산물을 얻고, 이를 이용하여 탐침을 제작하여 코스미드 라이브러리 중 대표적인 클론을 선택하였다. 탐침제작은 비동위원소 방법인 로슈어플라이드사이언스사의 DIG 탐침제조키트를 사용하여 제작하였다.
서던 블롯 기법을 이용하여 탐침과 혼성화하며 EcoRI 과 Pst I 제한 자리를 가지는 3.7kb에 달하는 단편을 확인하고, 이를 EcoRI 과 Pst I으로 소화하여 pUC18에 서브클로닝 하고 이를 대장균 DH5에 형질전환 시킨후 DNA를 획득하여 ABI3000 DNA 시퀀서(퍼킨-엘머)를 이용하여 서열을 결정하였다.
실시예 8
발현용 벡터에의 재조합 및 형질전환된 대장균에서의 발현
얻어진 베타트랜스아미나제의 유전자 서열로 부터 각각 NcoI/BamHI 제한효소로 양 말단이 소화되는 베타트랜스아미나제의 유전자 클론을 PCR 기법을 이용하여 제조하고, 그 분획을pET28a(노바젠)에 라이게이션하여 재조합 플라스미드를 생성, 발현용 대장균 균주인 BL21(DE3)에 형질전환 시켰다. 클로닝한 유전자의 5'-말단을 NcoI 으로 소화하기 위해서는 베타트랜스아미나제의 말단 서열 ATGAAC- 의 중간에 3개의 염기를 추가하여 삽입하였으며, 이는 ATGGGCAAC- 의 서열이다. 이로 인하여 재조합 유전자에 의해 발현된 단백질은 본래의 N-말단 서열인 서열번호 3의 MNEP- 의 첫번째 아미노산 메티오닌 (M) 뒤에 삽입된 염기서열인 GGC 에 의해 번역되는 글리신 (G)이 추가된 형태인 MGNEP- 의 서열로 얻어진다 (3/1335bp = 1/445 아미노산 = 0.22%). 얻어진 형질전환 대장균은 카나마이신을 함유한 배지에서 배양 하였으며, 세포현탁도가 0.3 내지 0.7이 되었을 때 IPTG를 부가하고 상온에서 16시간을 더 배양함으로써 효소의 발현을 유도하였다. 얻어진 효소는 실시예 4와 같은 방법으로 정제하였으며, 정제한 효소와 동일한 베타트랜스아미나제의 활성을 지님을 확인하였다.
또한, 재조합 베타트랜스아미나제의 정제를 쉽게 하기 위하여, 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 분리에 도움을 주는 아미노산 서열을 더하기도 하였다. 이런 분리에 도움을 주는 서열 중에 히스티딘 다중 서열을 이용하기 위하여 서열번호 2의 염기서열 말단의 부분에서 전사중단 서열인 ATG를 제거한 절편을, BamHI/HindIII 의 2 가지 제한효소로 소화한 노바젠의 pET28a 벡터에 삽입하였다. 삽입한 결과 서열번호 2의 염기서열 말단은 ATG가 제거되고, 다음의 염기서열인 AAG CTT GCG GCC GCA CTC GAG CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA 가 pET28a 의 서열에 의하여 추가되어, 이에서 발현되는 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열에서 추가하여 다음의 13개의 아미노산인 KLAAALEHHHHHH 서열이 C-말단에 더해지는효과를 가진다 (13/458 = 3%). pET28a 에 삽입된 유전자는 발현 균주인 BL21(DE3)에서 0.1 mM의 IPTG로 세포현탁도가 1.0 일 때 전사를 유도하여 단백질을 발현하였으며, 발현된 단백질은 세포를 파쇄한 후 Ni-NTA 칼럼에 흡착하여 분리하였다. 분리한 단백질은 실시예 4에서 분리한 단백질과 동일한 역가를 가짐을 확인하였다.
이와 같이, 본 발명의 서열번호 3의 아미노산 서열에 일반적으로 단백질의 분리를 용이하게 하기 위해 당업계에서 통상 사용되는 단백질 흡착정제 서열을 삽입할 수 있다. 또한, 본 발명의 베타트랜스아미나제 활성에 영향을 미치지 않는 한, 이러한 삽입 서열은 제한 효소의 종류에 따라 그 길이를 조금씩 다르게 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 베타트랜스아미나제 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 이와 97% 이상, 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 가지고 베타트랜스아미나제 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하며, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 갖는다.
실시예 9
유도 발현된 효소를 이용한 아릴아민의 광학분할 반응 및 다양한 아민 공여체에 대한 활성 측정
오메가트랜스아미나제의 활성도는 1유닛을 30℃와 pH 7.5에서 5mM DL-베타호모페닐글리신과 10mM 피루빅산을 반응시켰을 때 1μM의 알라닌이 생성되는 것으로 정의하여, 아민공여체에 대한 활성도는 다양한 아민공여체 5mM 과 피루빅산 10mM을 반응하여 생성되는 L-알라닌의 양을 측정하였고 아민수용체에 대한 활성도는 다양한 아민수용체 10mM과 DL-베타호모페닐글리신 5mM을 반응하여 소모되는 D-베타호모페닐글리신의 양을 측정하였다. 반응액의 부피는 200μL 이며 반응의 정지는 75μL 16%(V/V) 퍼클로릭에시트를 사용하였다. 상기 표2 및3에 각 아민공여체와 아민수용체에 대한 활성의 예시를 나타내었다.
실시예 10
베타트랜스아미나제 추출물을 이용한 광학분할을 이용한L- 베타호모페닐글리신의 생산
실시예 2에서 생산된 내열성 방향족 트랜스아미나제 추출물을 10mM 라세믹 베타호모페닐글리신, 10mM 피루빅산, 50mM 트리스완충용액(pH 7.4)으로 구성된 반응액 5mL에 1mL첨가하고, 리파제를 첨가하여 37℃에서 24시간 동안 반응하였다. 아세토니트릴을 반응액과 동부피 첨가하여 반응종료 후, 반응액을 고압크로마토그래피를 이용하여 광학분석한 결과, 광학순도 99%이상의L-베타호모페닐글리신을 약49%의 수율로 농축할 수 있었다.
실시예 11
재조합 베타트랜스아미나제를 이용한 D- 베타호모페닐글리신의 비대칭 합성
실시예 8에서 생산된 재조합 베타트랜스아미나제를 10mM 3-아미노부틸산, 10mM 3-케토-3-페닐프로피온산에틸에스테르, 50mM 트리스완충용액 (pH 7.4)으로 구성된 반응액 5mL에 1mL첨가하고, 리파제를 첨가하여 30℃에서 20시간 동안 반응하였다. 3-케토-3-페닐프로피온산은 상온에서 불안정하므로, 이의 에스테르 화합물을 기질로 사용하였으며, 베타트랜스아미나제는 에스테르 화합물에 반응하지 않으므로, 리파제를 이용하여 에스테르 화합물을 가수분해 하고, 이에 따라 생성되는3-케토-3-페닐프로피온산을 베타트랜스아미나제가 이용할 수 있도록 하였다. 반응 후에는 아세토니트릴을 반응액과 동부피 첨가하여 반응종료 후, 반응액을 고압크로마토그래피를 이용하여 광학분석한 결과, 광학순도 99.99%이상의D-베타호모페닐글리신을 약 20%의 수율로 합성할 수 있었다.
일반적으로, 오메가트랜스아미나제는 알파자리가 아닌 아미노산 및 아민에 대한 반응성을 보이는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 기존에 알려진 오메가트랜스아미나제와는 그 기질 특이성면에서 현저히 다른 신규한 오메가트랜스아미나제, 특히 베타자리에 특이성이 있는 베타트랜스아미나제를 스크리닝, 그 유전자 서열을 확인하였다. 이 신규한 베타트랜스아미나제는 기존의 오메가트랜스아미나제에 비하여 그 서열이 기존의 오메가트랜스아미나제와 상이하며, 광학활성의 천연 또는 비천연의 베타아미노산 및 그 유도체들을 생산할 수 있다는 장점을 가진다.
또한, 본 발명에서는 베타트랜스아미나제의 추출물을 그대로 이용하여 광학분할 반응을 이용하여, L-베타아미노산을 생산할 수 있었으며, 또한 밝혀진 유전자 서열을 바탕으로 재조합 베타트랜스아미나제를 제조하고, 이 재조합 단백질을 대장균에서 과발현하여, D형-베타아미노산을 높은 광학순도로 생산하였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (35)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 베타트랜스아미나제 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 메조리조비움 sp. LUK (Mesorhizobium sp. LUK) KCCM-10752P.
  2. 제 1 항의 메조리조비움sp. LUK의 세포 추출물.
  3. 제 1 항의 메조리조비움 sp. LUK 또는 제 2 항의 세포 추출물을 생촉매로 사용하고, 광학분할을 이용하여 L형-베타아미노산을 생산하는 방법.
  4. 제 1 항의 메조리조비움 sp. LUK 또는 제 2 항의 세포 추출물을 생촉매로 사용하고, 비대칭 합성을 이용하여 D형-베타아미노산을 생산하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 20 내지 70℃의 온도에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 20 내지 70℃의 온도에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, pH 5 내지 10에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, pH 5 내지 10에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 광학분할에 사용되는 아미노기 수용체가 케토산군에서 선택되는 것인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 아미노기 수용체가 벤조일피루빅산(C6H5), 페닐피루빅산(C6H5CH2), 벤질피루빅산(C6H5CH2CH2), 페닐케토발레릭산(C6H5CH2CH2CH2), p-토릴글리옥시릭산(CH3C6H4), p-토릴피루빅산(CH3C6H4CH2), p-토릴케토부티릭산(CH3C6H4CH2CH2), p-토릴케토발레릭산(CH3C6H4CH2CH2CH2), 2,6-디메틸페닐글리옥시릭산((CH3)2C6H3), p-에틸페닐글리옥시릭산(C2H5C6H4), p-tert-부틸페닐글리옥시릭산((CH3)3CC6H4), p-tert-부틸페닐피루빅산((CH3)3CC6H4CH2), p-이소프로필페닐글리옥시릭산 ((CH3)2CHC6H4), 2,4,6-트리메틸페닐글리옥시릭산((CH3)3C6H2), 2,3,5,6-테트라메틸페닐글리옥시릭산((CH3)4C6H), 2,3,4,6-테트라메틸페닐글리옥시릭산((CH3)4C6H), 펜타메닐페닐글리옥시릭산((CH3)5C6), 2,4,6-트리메틸페닐피루빅산((CH3)3C6H2CH2), 디메틸페닐피루빅산(C6H5C(CH3)2), 프탈로닉산((CO2H)C6H4), 3-카르복시페닐글리옥시릭산((CO2H)C6H4), 3-카르복시-4-히드록시페닐글리옥시릭산((CO2H)(OH)C6H3), 3-카르복시페닐피루빅산((CO2H)C6H4CH2), 3-카르복시-4-히드록시페닐피루빅산((CO2H)(OH)C6H3CH2), 4-메톡시페닐글리옥시릭산((CH3O)C6H4), p-히드록시페닐글리옥시릭산((OH)C6H4), 2,5-디히드록시페닐글리옥시릭산((OH)2C6H3), 2-카르복시메틸페닐글리옥시릭산((CO2H)CH2C6H4), 4-메톡시페닐케토부티릭산((CH3O)C6H4CH2CH2), p-히드록시페닐피루빅산((OH)C6H4CH2), p-메틸시오페닐글리옥시릭산(CH3SC6H4), p-브로모페닐글리옥시릭산(BrC6H4), p-클로로페닐글리옥시릭산(ClC6H4), p-플루오르페닐글리옥시릭산(FC6H4), p-요오드페닐글리옥시릭산(IC6H4), o-브로모페닐글리옥시릭산(BrC6H4), m-브로모페닐글리옥시릭산(BrC6H4), 2,4-디클로로페닐글리옥시릭산(Cl2C6H3), 3-플루오르-4-메톡시페닐글리옥시릭산(F(CH3O)C6H3), p-니트로페닐글리옥시릭산((NO2)C6H4), m-니트로페닐글리옥시릭산((NO2)C6H4), p-브로모페닐피루빅산(BrC6H4CH2), p-클로로페닐피루빅산(ClC6H4CH2), p-플루오르페닐피루빅산(FC6H4CH2), o-클로로페닐피루빅산(ClC6H4CH2), m-클로로페닐피루빅산(ClC6H4CH2), p-니트로페닐피루빅산((NO2)C6H4CH2), m-니트로페닐피루빅산((NO2)C6H4CH2), o-니트로페닐피루빅산((NO2)C6H4CH2), 3-요오드-4-히드록시페닐피루빅산((OH)IC6H3CH2), 3,5-디요오드-4-히드록시페닐피루빅산((OH)(I)2C6H2CH2), p-아미노페닐글리옥시릭산(H2NC6H4), p-아미노페닐피루빅산(H2NC6H4CH2), α-나프틸글리옥시릭산(C10H7), β-나프틸글리옥시릭산(C10H7), 4-메틸-1-나프틸글리옥시릭산((CH3)C10H6), 1-나프틸피루빅산(C10H7CH2), 2-나프틸피루빅산(C10H7CH2), 디페닐피루빅산((C6H5)2CH), 트리페닐피루빅산((C6H5)3C) 및 디페닐케토부티릭산((C6H5)2CHCH2)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  11. 제 4 항에 있어서, 비대칭 합성에 사용되는 아미노기 공여체가 3-아미노부틸산인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 4 항에 있어서, D형-베타아미노산이 하기 구조식 (1-D)인 방법:
    Figure 112007060394306-pat00005
    (여기에서, R1, X1 및 X2 는 각각 독립적으로 H, C1-C20 의 알킬기,
    Figure 112007060394306-pat00006
    을 나타내고, R4 및 R5는 H, C1-C10의 알킬기, F, Cl, Br, I, NO2, OH, CN 을 나타낸다).
  13. 제 12 항에 있어서, D형-베타아미노산이 D-3-아미노-3-페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-플루오로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-플로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-플루오로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,4-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,4-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,4-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-브로모)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-브로모)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-브로모)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-트리플루오로메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-트리플루오로메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-트리플루오로메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-시안)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-시안)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-니트로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-니트로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-니트로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,4-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,4-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,4-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,5-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,5-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,5-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-수산화)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-수산화)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-수산화)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-티에닐)프로피온산, D-3-아미노-3-(3-티에닐)프로피온산, D-3-아미노-3-(2-퓨릴)프로피온산, D-3-아미노-3-(1-나프틸)프로피온산, D-베타호모루신, D-베타호모이소루신, D-베타호모아르기닌, D-베타호모아스파라긴, D-베타호모글루타민, D-베타호모아스파틱산, D-베타호모글루탐산, D-베타호모페닐알라닌, D-베타호모프롤린, D-베타호모라이신, D-베타호모메치오닌, D-베타호모쓰레오닌, D-베타호모트립토판, D-베타호모티로신, D-베타호모세린, D-베타호모발린 및 D-아미노부틸산으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  14. 제 4 항에 있어서, 리파제를 추가로 첨가하여 반응시키는 방법.
  15. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 베타트랜스아미나제 단백질.
  16. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 베타트랜스아미나제 단백질을 코딩하는 DNA.
  17. 서열번호 3의 서열과 97% 이상의 상동성을 가지고 베타트랜스아미나제 효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항의 DNA를 포함하는 재조합 DNA 벡터.
  19. 제 18 항의 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  20. 서열번호 3의 서열과 97% 이상의 상동성을 가지고 베타트랜스아미나제 효소 활성을 가지는 단백질.
  21. 제 15 항의 단백질을 포함하는 세포 추출물.
  22. 제 20 항의 단백질을 포함하는 세포 추출물.
  23. 제 19 항의 숙주세포의 세포 추출물.
  24. 제 15 항의 단백질, 제 16 항의 DNA를 포함하는 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포, 제 16 항의 DNA를 포함하는 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포의 세포 추출물, 제 17 항의 DNA를 포함하는 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포, 제 17 항의 DNA를 포함하는 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포의 세포 추출물, 제 20 항의 단백질, 제 21 항의 세포 추출물 및 제 22 항의 세포 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 가지를 생촉매로 사용하고, 광학분할을 이용하여 L형-베타아미노산을 생산하는 방법.
  25. 제 15 항의 단백질, 제 16 항의 DNA를 포함하는 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포, 제 16 항의 DNA를 포함하는 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포의 세포 추출물, 제 17 항의 DNA를 포함하는 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포, 제 17 항의 DNA를 포함하는 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포의 세포 추출물, 제 20 항의 단백질, 제 21 항의 세포 추출물 및 제 22 항의 세포 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 가지를 생촉매로 사용하고, 비대칭 합성을 이용하여 D형-베타아미노산을 생산하는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 20 내지 70℃의 온도에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 20 내지 70℃의 온도에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 24 항에 있어서, pH 5 내지 10에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 25 항에 있어서, pH 5 내지 10에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 24 항에 있어서, 광학분할에 사용되는 아미노기 수용체가 케토산군에서 선택되는 것인 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 아미노기 수용체가 벤조일피루빅산(C6H5), 페닐피루빅산(C6H5CH2), 벤질피루빅산(C6H5CH2CH2), 페닐케토발레릭산(C6H5CH2CH2CH2), p-토릴글리옥시릭산(CH3C6H4), p-토릴피루빅산(CH3C6H4CH2), p-토릴케토부티릭산(CH3C6H4CH2CH2), p-토릴케토발레릭산(CH3C6H4CH2CH2CH2), 2,6-디메틸페닐글리옥시릭산((CH3)2C6H3), p-에틸페닐글리옥시릭산(C2H5C6H4), p-tert-부틸페닐글리옥시릭산((CH3)3CC6H4), p-tert-부틸페닐피루빅산((CH3)3CC6H4CH2), p-이소프로필페닐글리옥시릭산 ((CH3)2CHC6H4), 2,4,6-트리메틸페닐글리옥시릭산((CH3)3C6H2), 2,3,5,6-테트라메틸페닐글리옥시릭산((CH3)4C6H), 2,3,4,6-테트라메틸페닐글리옥시릭산((CH3)4C6H), 펜타메닐페닐글리옥시릭산((CH3)5C6), 2,4,6-트리메틸페닐피루빅산((CH3)3C6H2CH2), 디메틸페닐피루빅산(C6H5C(CH3)2), 프탈로닉산((CO2H)C6H4), 3-카르복시페닐글리옥시릭산((CO2H)C6H4), 3-카르복시-4-히드록시페닐글리옥시릭산((CO2H)(OH)C6H3), 3-카르복시페닐피루빅산((CO2H)C6H4CH2), 3-카르복시-4-히드록시페닐피루빅산((CO2H)(OH)C6H3CH2), 4-메톡시페닐글리옥시릭산((CH3O)C6H4), p-히드록시페닐글리옥시릭산((OH)C6H4), 2,5-디히드록시페닐글리옥시릭산((OH)2C6H3), 2-카르복시메틸페닐글리옥시릭산((CO2H)CH2C6H4), 4-메톡시페닐케토부티릭산((CH3O)C6H4CH2CH2), p-히드록시페닐피루빅산((OH)C6H4CH2), p-메틸시오페닐글리옥시릭산(CH3SC6H4), p-브로모페닐글리옥시릭산(BrC6H4), p-클로로페닐글리옥시릭산(ClC6H4), p-플루오르페닐글리옥시릭산(FC6H4), p-요오드페닐글리옥시릭산(IC6H4), o-브로모페닐글리옥시릭산(BrC6H4), m-브로모페닐글리옥시릭산(BrC6H4), 2,4-디클로로페닐글리옥시릭산(Cl2C6H3), 3-플루오르-4-메톡시페닐글리옥시릭산(F(CH3O)C6H3), p-니트로페닐글리옥시릭산((NO2)C6H4), m-니트로페닐글리옥시릭산((NO2)C6H4), p-브로모페닐피루빅산(BrC6H4CH2), p-클로로페닐피루빅산(ClC6H4CH2), p-플루오르페닐피루빅산(FC6H4CH2), o-클로로페닐피루빅산(ClC6H4CH2), m-클로로페닐피루빅산(ClC6H4CH2), p-니트로페닐피루빅산((NO2)C6H4CH2), m-니트로페닐피루빅산((NO2)C6H4CH2), o-니트로페닐피루빅산((NO2)C6H4CH2), 3-요오드-4-히드록시페닐피루빅산((OH)IC6H3CH2), 3,5-디요오드-4-히드록시페닐피루빅산((OH)(I)2C6H2CH2), p-아미노페닐글리옥시릭산(H2NC6H4), p-아미노페닐피루빅산(H2NC6H4CH2), α-나프틸글리옥시릭산(C10H7), β-나프틸글리옥시릭산(C10H7), 4-메틸-1-나프틸글리옥시릭산((CH3)C10H6), 1-나프틸피루빅산(C10H7CH2), 2-나프틸피루빅산(C10H7CH2), 디페닐피루빅산((C6H5)2CH), 트리페닐피루빅산((C6H5)3C) 및 디페닐케토부티릭산((C6H5)2CHCH2)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  32. 제 25 항에 있어서, 비대칭 합성에 사용되는 아미노기 공여체가 3-아미노부틸산인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 25 항에 있어서, D형-베타아미노산이 하기 구조식 (1-D)인 방법:
    Figure 112007060394306-pat00013
    (여기에서, R1, X1 및 X2 는 각각 독립적으로 H, C1-C20 의 알킬기,
    Figure 112007060394306-pat00014
    을 나타내고, R4 및 R5는 H, C1-C10의 알킬기, F, Cl, Br, I, NO2, OH, CN 을 나타낸다).
  34. 제 33 항에 있어서, D형-베타아미노산이 D-3-아미노-3-페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-플루오로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-플로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-플루오로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,4-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,4-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,4-디클로로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-브로모)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-브로모)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-브로모)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-트리플루오로메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-트리플루오로메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-트리플루오로메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-시안)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-시안)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-니트로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-니트로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-니트로)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-메틸)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2,3-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,4-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,4-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,4-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,5-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,5-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3,5-디메톡시)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-수산화)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(3-수산화)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(4-수산화)페닐프로피온산, D-3-아미노-3-(2-티에닐)프로피온산, D-3-아미노-3-(3-티에닐)프로피온산, D-3-아미노-3-(2-퓨릴)프로피온산, D-3-아미노-3-(1-나프틸)프로피온산, D-베타호모루신, D-베타호모이소루신, D-베타호모아르기닌, D-베타호모아스파라긴, D-베타호모글루타민, D-베타호모아스파틱산, D-베타호모글루탐산, D-베타호모페닐알라닌, D-베타호모프롤린, D-베타호모라이신, D-베타호모메치오닌, D-베타호모쓰레오닌, D-베타호모트립토판, D-베타호모티로신, D-베타호모세린, D-베타호모발린 및 D-아미노부틸산으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  35. 제 25 항에 있어서, 리파제를 추가로 첨가하여 반응시키는 방법.
KR1020060078204A 2006-08-18 2006-08-18 신규한 토양 미생물, 상기 토양 미생물로부터 분리된신규한 베타트랜스아미나제, 상기 베타트랜스아미나제를암호화하는 유전자 및 이들을 이용하여 광학적으로 순수한베타아미노산과 그 유도체를 생산하는 방법 KR100818611B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060078204A KR100818611B1 (ko) 2006-08-18 2006-08-18 신규한 토양 미생물, 상기 토양 미생물로부터 분리된신규한 베타트랜스아미나제, 상기 베타트랜스아미나제를암호화하는 유전자 및 이들을 이용하여 광학적으로 순수한베타아미노산과 그 유도체를 생산하는 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060078204A KR100818611B1 (ko) 2006-08-18 2006-08-18 신규한 토양 미생물, 상기 토양 미생물로부터 분리된신규한 베타트랜스아미나제, 상기 베타트랜스아미나제를암호화하는 유전자 및 이들을 이용하여 광학적으로 순수한베타아미노산과 그 유도체를 생산하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080016287A KR20080016287A (ko) 2008-02-21
KR100818611B1 true KR100818611B1 (ko) 2008-04-01

Family

ID=39384439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060078204A KR100818611B1 (ko) 2006-08-18 2006-08-18 신규한 토양 미생물, 상기 토양 미생물로부터 분리된신규한 베타트랜스아미나제, 상기 베타트랜스아미나제를암호화하는 유전자 및 이들을 이용하여 광학적으로 순수한베타아미노산과 그 유도체를 생산하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100818611B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9376694B2 (en) 2012-07-06 2016-06-28 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Method for preparing optically active amino acid using cosubstrate shuttling of transaminase

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104762225B (zh) * 2014-12-12 2017-12-01 中国林业科学研究院热带林业研究所 一种增城中慢生根瘤菌及其用途
WO2020130384A1 (ko) 2018-12-21 2020-06-25 건국대학교 산학협력단 글루탐산 재생성 반응을 이용한 베타 또는 감마 아미노산의 생산방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19980078037A (ko) * 1997-04-24 1998-11-16 박원훈 신규 고온성 바실러스 속 미생물 및 이로부터 생산되는 내열성 l-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, 알라닌 라세마아제 및 글루타메이트 라세마아제
KR20030072067A (ko) * 2002-03-05 2003-09-13 김병기 신규한 호열성 미생물 및 이를 이용한 방향족ｌ-아미노산의 제조 방법
KR20060007124A (ko) * 2004-07-19 2006-01-24 김병기 신규한 오메가아미노트랜스퍼라제, 이의 유전자 및 이의이용 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19980078037A (ko) * 1997-04-24 1998-11-16 박원훈 신규 고온성 바실러스 속 미생물 및 이로부터 생산되는 내열성 l-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, 알라닌 라세마아제 및 글루타메이트 라세마아제
KR20030072067A (ko) * 2002-03-05 2003-09-13 김병기 신규한 호열성 미생물 및 이를 이용한 방향족ｌ-아미노산의 제조 방법
KR20060007124A (ko) * 2004-07-19 2006-01-24 김병기 신규한 오메가아미노트랜스퍼라제, 이의 유전자 및 이의이용 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI GenBank Accession No.AY230775*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9376694B2 (en) 2012-07-06 2016-06-28 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Method for preparing optically active amino acid using cosubstrate shuttling of transaminase

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080016287A (ko) 2008-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5753470A (en) Process for preparing L-tertiary-Leucine and L-phosphinothricine by transamination
DK2327765T3 (en) nitrilases
JP5999565B2 (ja) （ｒ）−選択的アミノ化
JP2000505291A (ja) トランスアミナーゼ及びアミノトランスフェラーゼ
JP3150335B2 (ja) 新規ポリペプチドとその発現を可能にするｄｎａ配列，調製法およびその利用
CA2486062C (en) Nitrilases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
KR100818611B1 (ko) 신규한 토양 미생물, 상기 토양 미생물로부터 분리된신규한 베타트랜스아미나제, 상기 베타트랜스아미나제를암호화하는 유전자 및 이들을 이용하여 광학적으로 순수한베타아미노산과 그 유도체를 생산하는 방법
FR2825717A1 (fr) Preparation stereoselective de l-acides amines cycliques
JP2002325598A (ja) エナンチオマー濃縮したアミノ酸の製法またはラセミ化法ならびにｎ−保護アミノ酸の保護基の切断法、および得られたアミノ酸の使用
JP2603777B2 (ja) アジピン酸アンモニウムの酵素的合成方法
US6800464B2 (en) Arthrobacter D-carbamoylase and methods of preparing enantiomerically enriched D-amino acids
KR101497333B1 (ko) 탈라세믹화를 이용한 광학 활성 아미노산의 제조방법
KR101479718B1 (ko) 오메가 트랜스아미나아제의 조기질 순환을 이용한 광학 활성 아미노산의 제조방법
Nagayoshi et al. Purification and characterization of human brain serine racemase expressed in moderately halophilic bacteria
WO2012140507A1 (en) Production of enantiomerically purified amino acids
KR100433134B1 (ko) 신규한 호열성 미생물 및 이를 이용한 방향족ｌ-아미노산의 제조 방법
WO2011001889A1 (ja) 光学活性α－アミノ酸のラセミ化方法
Bour Use of transaminase enzymes for the synthesis of pharmaceutical intermediates
WO2007097429A1 (ja) 新規アシルアミダーゼ遺伝子およびその利用法
Novikov et al. The highly efficient expression of the aspartase gene (L-aspartate ammonia-lyase) in Escherichia coli cells
WO2009006492A2 (en) Stereoselective resolution of racemic amines
JP4652915B2 (ja) ノルボルナン誘導体の加水分解に関与するｄｎａ
KR19990039948A (ko) 2고온성 미생물 바실러스 속 균주 유래의 내열성 ｄ-아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 암호하는 유전자 및이를 이용한 ｄ-아미노산 아미노트랜스퍼라아제의 제조방법
Sonke Novel developments in the chemo-enzymatic synthesis of enantiopure α-hydrogen-and α, α-disubstituted α-amino acids and derivatives
JP2011024572A (ja) 光学活性アミノ酸の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130426

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140320

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150212

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160122

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180222

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200302

Year of fee payment: 13