KR101479718B1

KR101479718B1 - 오메가 트랜스아미나아제의 조기질 순환을 이용한 광학 활성 아미노산의 제조방법

Info

Publication number: KR101479718B1
Application number: KR20120074035A
Authority: KR
Inventors: 신종식; 박을수
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2015-01-08
Also published as: WO2014007588A1; KR20140006619A; US9376694B2; US20150284750A1

Abstract

본 발명은 트랜스아미나제의 조기질 순환을 이용한 광학 활성 아미노산을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 가지사슬 아미노산 전달효소에 의해서 케토산을 아미노산으로 전환시키는 반응과, 오메가 트랜스아미나제에 의해서 아민 기질의 아민을 전이시키는 반응을 아미노산 조기질에 의해서 커플링시켜 순환 반응시키는 것을 특징으로 하며, 본 발명은 종래 트랜스아미나제의 낮은 반응 평형상수 문제를 해결하여 고순도의 다양한 광학 활성 아미노산을 고효율로 생산할 수 있어 다양한 아미노산의 생산 공정에 산업적으로 사용될 수 있다. 또한, 높은 반응성과 안정성을 가지는 본 발명에 의해서 제약 전구체로 사용되는 다양한 비천연 아미노산을 손쉽게 생산할 수 있어 제약, 식품 첨가물, 각종 동물 사료 제조 분야에서 활용할 수 있다.

Description

오메가 트랜스아미나아제의 조기질 순환을 이용한 광학 활성 아미노산의 제조방법{Method for production enantiopure amino acids using ω-transaminase with cosubstrate recycling}

본 발명은 트랜스아미나제의 조기질 순환을 이용하여 광학 활성 아미노산을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 반응 평형상수가 큰 오메가 트랜스아미나제에 의한 아미노기 전이 반응과 가지사슬 아미노산 전달효소에 의한 반응을 양 반응에서 순환하는 아미노산 조기질과 이의 케토산으로 커플링시켜서 높은 전환율로 고순도의 광학 활성 아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

광학 활성 아미노산은 다양한 의약품의 중간체 등에 사용되는 중요한 화합물이며, 특히 광학활성 중간체로 각광받고 있는 비천연 아미노산의 경우 미생물의 대사산물이 아니기 때문에 발효와 같은 천연아미노산의 생산방법으로는 생산이 어렵다. 따라서 대부분 금속화학 촉매나 생촉매를 이용하는 방법이 개발되어 있지만 금속촉매의 경우 전이금속이 매우 고가이므로 비경제적이다. 따라서 효소적 방법의 기술개발은 광학 활성 아미노산에 경제적이고 효율적일 수 있다.

이와 관련하여 가지사슬 아미노산 전달효소의 경우 상당히 넓은 기질특이성을 가지고 있고 높은 광학선택성을 가지고 있어 산업적으로 광학 활성 아미노산을 생산하는데 유용하나, 낮은 평형상수를 가지고 있으므로 낮은 전환율 때문에 산업적으로 활용되기에 한계를 가지고 있다.

따라서, 효소적 방법을 이용한 광학 활성 아미노산의 생산을 산업적으로 활용하기 위해서는 가지사슬 아미노산 전달효소가 갖고 있는 낮은 평형상수를 극복하는 것이 절실히 필요한 실정이다.

종래에 효소적 방법을 이용한 광학 활성 아미노산을 생산하는 기술과 관련하여 한국공개특허 10-2011-0047789에 미생물에서 유래한 사슬형 트랜스아미나제를 이용하여 아미노산을 생산하는 방법이 기재되어 있고, 한국공개특허 10-2008-0016287에는 배타트랜스아미나제를 이용하여 아미노산을 생산하는 방법이 기재되어 있다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기와 같은 일반적인 트랜스아미나제가 갖고 있는 낮은 반응 평형상수를 극복하기 위하여, 반응 평형상수가 매우 큰 트랜스아미나제 반응과 커플링시시키고, 커플링 반응에 공통적으로 반응성을 보이는 아미노산 조기질 및 이의 케토산을 이용하여 고순도의 광학 활성 아미노산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,

가지사슬 아미노산 전달효소(branched-chain aminotransferase, BCAT)에 의해서 케토산(keto-acid)을 아미노산으로 전환시키는 반응과,

오메가 트랜스아미나제(ω-transaminase, ωTA)에 의해서 아민 기질의 아민을 전이시키는 반응을,

아미노산 조기질에 의해서 커플링시켜 순환 반응시키는 단계를 포함하는 광학 활성 아미노산의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 아미노산 조기질은 가지사슬 아미노산 전달효소와 오메가 트랜스아미나제에 모두 반응성을 보이는 아미노산으로서, 알라닌, 호모 알라닌, 노르발린 및 노르류신 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 알라닌 또는 호모 알라닌일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 케토산은 파이루베이트, 2-옥소부티레이트, 2-(3-하이드록시-1-아다만틸)-2-옥소에타노익 엑시드, 트리메틸파이루베이트, 3-메틸-2-옥소부티레이트, 3-메틸-2옥소펜타노익 엑시드, 4-메틸-2-옥소펜타노익 엑시드, 2-옥소펜타노익 엑시드 및 2-옥소헥사노익 엑시드 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 아민 기질은 벤질아민, 메틸벤질아민 또는 이소프로필아민일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 광학 활성 아미노산은 L-발린, L-노르발린, L-류신, L-이소류신, L-노르류신, L-터트-류신 및 L-3-하이드록시아다만틸글라이신 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 순환 반응에서 상기 아미노산 조기질은 상기 케토산 기질 농도의 0.2-20%일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 순환 반응은 케톤이나 알데히드에 의한 오메가 트랜스아미나제의 반응성 저해가 있는 경우에 헥산과 같은 유기 용매를 더 첨가하여 반응시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 순환 반응에 첨가되는 가지사슬 아미노산 전달효소(U/mL)와 오메가 트랜스아미나제(U/mL)의 비율은 1 : 1-10일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 가지사슬 아미노산 전달효소는 대장균으로부터 분리한 것으로서, 서열번호 7의 DNA 서열 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 오메가 트랜스아미나제는 파라코쿠스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans)균으로부터 분리한 것으로서, 서열번호 9의 DNA 서열 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 오메가 트랜스아미나제는 오크로박트룸 안트로피(Ochrobactrum anthropi)균으로부터 분리한 것으로서, 서열번호 11의 DNA 서열 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명은 종래 트랜스아미나제의 낮은 반응 평형상수 문제를 해결하여 고순도의 다양한 광학 활성 아미노산을 고효율로 생산할 수 있는 것으로서, 다양한 광학 활성 아미노산의 생산 공정에 산업적으로 적용될 수 있다. 또한, 높은 반응성과 안정성을 가지는 본 발명에 의해서 제약 전구체로 사용되는 다양한 비천연 아미노산을 손쉽게 생산할 수 있어 제약, 식품 첨가물, 각종 동물 사료 제조 분야에서 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 가지사슬 아미노산 전달효소와 오메가 트랜스아미나제의 기질특이성 비교를 통하여 순환시킬 조기질의 선택을 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 가지사슬 아미노산 전달효소와 오메가 트랜스아미나제의 coupled 효소 반응에서의 조기질의 적정 농도를 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 가지사슬 아미노산 전달효소의 농도를 고정하고 오메가 트랜스아미나제 농도의 변화에 따른 coupled 효소 반응결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 오메가 트랜스아미나제의 농도를 고정하고 가지사슬 아미노산 전달효소 농도의 변화에 따른 coupled 효소 반응결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 오메가 트랜스아미나제 반응 저해를 극복하기 위한 유기 용매의 첨가와 라세믹 조기질의 사용에 따른 Coupled 효소 반응결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제한된 부피 내에서의 오메가 트랜스아미나제와 가지사슬 아미노산 전달효소간의 비율에 따른 Coupled 효소 반응결과 그래프이다.
도 7 내지 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 유기용매 첨가에 따른 coupled 효소 반응결과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 오메가 트랜스아미나제의 아민 기질에 따른 coupled 효소 반응결과 그래프이다.
도 10 내지 도 12는 본 발명의 일 실시에에 따라 라세믹 아민 기질을 사용한 coupled 효소 반응에 의한 L-tert-leucine 생산결과 그래프이다.
도 13 내지 도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 coupled 효소 반응에 의한 L-3-hydroxyadamantylglycine의 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 고농도의 trimethylpyruvate를 이용하여 coupled 효소 반응을 통해 고농도의 L-tert-leucine 생산결과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

트랜스아미나제는 아미노산의 대사과정에서 중요한 효소이고, 이 트랜스아미나제는 피리독살 인산(Pyridoxal phosphate, PLP)을 조효소로 하여 아미노산과 케토산 간의 아미노기 전달 반응을 촉매 하는 효소이다. 일반적인 트랜스아미나제와는 다르게 오메가 트랜스아미나제는 알파 위치에 아민기가 있는 아미노산 또는 카르복실 그룹이 없는 아민화합물의 아민기를 케토산 또는 케톤과 같은 아민 수용체에 전달해주는 반응을 수행한다. 따라서, 오메가 트랜스아미나제는 광학활성 아민화합물의 생산에 매우 유용한 효소이다.

따라서, 본 발명은 종래 가지사슬 아미노산 전달효소의 반응에 상기 오메가 트랜스아미나제에 의한 반응을 양 반응에서 순환하는 아미노산 조기질과 이의 케토산으로 커플링시켜서 고효율로 다양한 광학 활성 아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 종래 가지사슬 아미노산 전달효소(branched-chain aminotransferase, BCAT)에 의해서 케토산(keto-acid)을 아미노산을 전환시키는 반응이 갖는 낮은 반응 평형상수를 해결하여 손쉽게 다양한 광학 활성 아미노산을 고순도, 고효율로 생산하는 방법에 관한 것으로서, 하기 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 [반응식 1]과 같이 가지사슬 아미노산 전달효소에 의해서 케토산을 아미노산으로 전환시키는 반응과, 오메가 트랜스아미나제(ω-transaminase, ωTA)에 의해서 아민 기질의 아민을 전이시키는 반응을 아미노산 조기질에 의해서 커플링시켜 순환 반응시키는 것을 특징으로 한다.

[반응식 1]

상기 양 반응에 공통적으로 반응성을 보이면서 그의 케토 에시드로 전환되며, 순환 반응되는 아미노산 조기질로서는 알라닌, 호모알라닌, 발린, 노르류신 등을 들 수 있으나, 탄소수가 1 내지 2개인 알라닌, 호모알라닌이 바람직하고, 호모알라닌이 더욱 바람직하다.

상기 케토산으로는 파이루베이트, 2-옥소부티레이트, 2-(3-하이드록시-1-아다만틸)-2-옥소에타노익 엑시드, 트리메틸파이루베이트, 3-메틸-2-옥소부티레이트, 3-메틸-2옥소펜타노익 엑시드, 4-메틸-2-옥소펜타노익 엑시드, 2-옥소펜타노익 엑시드 및 2-옥소헥사노익 엑시드 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 아민 기질은 벤질아민, 메틸벤질아민 또는 이소프로필아민일 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 의해서 발효로 생산하기 힘든 다양한 광학 활성 아미노산을 제조할 수 있고, 특히, L-발린, L-노르발린, L-류신, L-이소류신, L-노르류신, L-터트-류신, L-3-하이드록시아다만틸글라이신 등을 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 순환 반응에서 상기 아미노산 조기질은 상기 케토산 기질 농도의 0.2-20%일 수 있는데, 조기질의 농도가 케토산 기질의 5%보다 낮은 경우에는 전환율이 낮으며, 20% 이상인 경우에는 조기질 농도 증가에 따라 전환율의 증가 추세가 낮아서 공정 효율상 20% 미만이 바람직하다.

또한, 상기 순환 반응에 유기 용매, 바람직하게는 헥산을 첨가함으로써 오메가 트랜스아미나제 반응을 저해하는 알데히드나 케톤의 생성을 극복하여 전환율을 보다 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 제조방법에서 가지사슬 아미노산 전달효소(U/mL)와 오메가 트랜스아미나제(U/mL)의 비율을 다양하게 변화시킨 결과, 그 비율이 1 : 1-10에서, 바람직하게는 1 : 8에서 전환율이 가장 우수하게 나타났다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않고, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

<실시예>

실시예 1. E. coli로부터 가지사슬 아미노산 전달효소 DNA 및 벡터 DNA로 이루어진 재조합 DNA의 제조

완전 배지에 배양한 세포를 4 ℃에서 4,000 rpm으로 10 분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 15 mL의 용해완충용액(15% 수크로즈, 25 mM EDTA, 25 mM Tris 완충용액)으로 녹였다. 이것을 4 ℃에서 4,000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 라이소자임(TSB 완충용액 내에 5 mg/mL)을 넣고, 37 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 이후 0.5 M EDTA 1.2 mL를 넣고, 37 ℃에서 5 분간 방치한 후, 10% SDS 1 mL를 넣고, 70 ℃에서 10 분간 얼음물에 방치한 후, 5 M 포타슘아세테이트 2.5 mL를 넣고, 얼음물에 15 분간 방치하였다. 상기 용액의 양과 동일한 양의 페놀-클로로포름 혼합물(50:50)을 넣고, 30 분간 혼합한 후, 4 ℃에서 4000 rpm으로 10 분간 원심분리하여 상층액을 획득하였다. 얻어진 용액의 0.5 배에 달하는 클로로포름을 첨가하여, 서서히 진탕시킨 후, 4 ℃에서 4000 rpm으로 원심분리하고, 다시 상층액을 회수하여, 이를 50 ㎍/mL의 양에 달하도록 RNase 처리로 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이후, 0.8 배에 달하는 아이소프로판올과 2.5 배에 달하는 에탄올을 첨가하고, 서서히 진탕시킨 후, 구멍을 막은 파스퇴르 피펫을 이용하여 genomic DNA를 수집하여 튜브에 넣고 완전히 건조시킨 후, TE 완충용액으로 녹여 사용하였다.

상기 분리한 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR을 통하여 트랜스아미나제를 획득하였다. 이때 사용된 프라이머는 다음과 같다.

포워드 : 5'-ATCATGGAATTCATGACCACGAAGAAAGCT-3' 서열번호 1

리버스 : 5'-AAAAACTCGAGTTATTGATTAACTTGATCTAACCA-3' 서열번호 2

PCR 산물을 NdeI/BamHI 제한효소로 처리하고, 그 분획을 각각 pET24ma 및 pET23b(노바젠)에 각각 라이게이션하여 재조합 플라스미드를 제조하였다.

실시예 2-(1). Paracoccus denitrificans로부터 오메가 트랜스아미나제 DNA 및 벡터 DNA로 이루어진 재조합 DNA의 제조

Paracoccus denitrificans을 LB-브로쓰(펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, pH 7)중에서 37 ℃ 12 시간 배양한 후 싱글 콜로니로부터 오메가 트랜스아미네이스를 발현하는 유전자를 합성 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nde1, Xho1 제한효소와 라이게이즈를 이용하여 삽입하였다.

이때 사용된 프라이머는 다음과 같다.

포워드 : 5'-GATATACATATGAACCAACCGCAAAGC-3' 서열번호 3

리버스 : 5'-GTGGTGCTCGAGGGCCACCTCGGCAAA-3' 서열번호 4

실시예 2-(2) Ochrobactrum anthropi로부터 오메가 트랜스아미나제 DNA 및 벡터 DNA로 이루어진 재조합 DNA의 제조

Ochrobactrum anthropi을 LB-브로쓰(펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, pH 7)중에서 37 ℃ 12 시간 배양한 후 싱글 콜로니로부터 오메가 트랜스아미네이스를 발현하는 유전자를 합성 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nde1, Xho1 제한효소와 라이게이즈를 이용하여 삽입하였다.

이때 사용된 프라이머는 다음과 같다.

포워드 : 5'-GATATACCATGGNNACTGCTCAGCCAAACTCT-3' 서열번호 5

리버스 : 5'-CGAGTGCGGCCGTCCTGGTGAGGCTTGC-3' 서열번호 6

실시예 3. 형질 전환 균주로부터의 효소의 과발현 및 정제

상기 실시예 1 및 실시예 2-(1), 2-(2)에서 수득된 플라스미드를 사용하여 E.coli BL21(DE3)를 형질 전환시켰다. 가나마이신을 함유하는 LB-보로쓰 300 mL에서 배양시킨 후, IPTG(최종 농도 1 mM)를 현탁도(OD) 0.5에서 첨가하였다. 이후 6 시간 이상 37 ℃에서 배양한 후 10000×g 4 ℃에서 20 분간 원심분리하여 세균세포를 얻어 15 mL 리서스펜션 버퍼(50 mM Tris-HCl, 50 mM 염화칼슘, 1 mM β-mercaptoethanol, 0.1 mM PMSF, 20 μM PLP, pH 7)로 현탁시켰다. 이를 빙냉시키면서 초음파 처리를 한 다음 17000×g 4 ℃에서 30 분간 원심 분리하여 상층액을 조추출액으로 수득하였다.

이 조추출액을 친화성 크로마토그래피를 이용하여 원하는 가지사슬 아미노산 전달효소와 오메가트랜스아미나제를 정제하여 효소 용액을 얻었다.

하기 서열번호 7의 DNA 서열 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 가지사슬 아미노산 전달효소, 하기 서열번호 9의 DNA 서열 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 Paracoccus denitrificans 유래 오메가 트랜스아미나제(PdwTA), 하기 서열번호 11의 DNA 서열 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 Ochrobactrum anthropi 유래 오메가 트랜스아미나제를 수득하였다.

실시예 4. 가지사슬 아미노산 전달효소의 아미노산에 대한 기질 특이성 및 효소가 포함된 조추출액을 사용한 광학 활성 아미노산으로의 케토산의 전환

상기 실시예 3에서 수득된 가지사슬 아미노산 전달효소가 포함된 조추출액을 사용하여 하기 [표 1]에 나타낸 각종 L-아미노산과 케토산을 기질로 하여 반응을 수행하였다. 20 mM L-아미노산과 20 mM 케토산 및 50 mM 인산칼륨(pH 7.0) 의 200 ㎕에 조추출액 20 ㎕를 첨가하고, 이를 37 ℃에서 30 분간 반응시키고 L-아미노산의 생성량을 측정하였다. 그 결과를 하기 [표 1]에 나타내었다.

아미노산	케토산	L-아미노산 생성량 (mM)
L-Glutamate	2-Oxobutyrate	4.2
L-Homoalanine	α-Ketoglutarate	0.1
L-Valine	α-Ketoglutarate	1.6
L-Isoleucine	α-Ketoglutarate	2.6
L-tert-Leucine	α-Ketoglutarate	0.06

실시예 5. 가지사슬 아미노산 전달효소의 아미노산에 대한 기질특이성 및 효소가 포함된 조추출액을 사용한 L-tert-leucine의 제조

상기 실시예 3에서 수득된 가지사슬 아미노산 전달효소가 포함된 조추출액을 사용하여 각종 L-아미노산과 trimethylpyruvate(L-tert-leucine의 케토산 형태)를 기질로 하여 반응을 수행하였다. 20 mM trimethylpyruvate와 20 mM L-아미노산 및 50 mM 인산칼륨(pH 7.0)의 200 ㎕에, 조추출액 100 ㎕를 첨가하고, 이를 37 ℃에서 2 시간 반응시키고 L-tert-leucine의 생성량을 측정하였다. 그 결과를 하기 [표 2]에 나타내었다.

케토산	아미노산	L-tert-leucine생성량 (mM)
Trimethylpyruvate	Glutamate	6.4
Trimethylpyruvate	Homoalanine	7.2
Trimethylpyruvate	Valine	7.8
Trimethylpyruvate	Isoleucine	9.2
Trimethylpyruvate	Alanine	0.8

실시예 6. 정제한 가지사슬 아미노산 전달효소의 케토산에 대한 기질특이성 및 정제된 효소를 사용한 광학 활성 아미노산으로의 케토산의 전환

상기 실시예 3에서 정제된 가지사슬 아미노산 전달효소를 사용하여 하기 [표 3]에 나타낸 각종 L-아미노산과 케토산을 기질로 하여 반응을 수행한다. 20 mM L-homoalanine과 20 mM 케토산 및 50 mM 인산칼륨(pH 7.0) 의 100 ㎕에, 정제된 1 U/mL 효소 10 ㎕를 첨가하고, 이를 37 ℃에서 7 시간 반응시키고 2-oxobutyrate(L-homoalanine의 케토산 형태)의 생성량을 측정하였다. 그 결과를 하기 [표 3]에 나타내었다.

Trimethylpyruvate와 L-homoalanine을 기질로 하였을 때 가지사슬 아미노산 전달효소에 의한 반응 평형상수가 0.16으로 매우 낮았다.

케토산 (생성 아미노산)	아미노산	2-oxobutyrate의 농도 [mM]
3-methyl-2-oxobutyrate (L-valine)	L-homoalanine	11.93
3-methyl-2-oxoxpentanoic acid (L-isoleucine)	L-homoalanine	8.49
4-methyl-2-oxopentanoic acid (L-leucine)	L-homoalanine	7.27
2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-2-oxoethanoic acid (3-hydroxyadamantyl glycine)	L-homoalanine	5.47
Trimethylpyruvate (L-tert-leucine)	L-homoalanine	5.83

실시예 7. 정제한 가지사슬 아미노산 전달효소의 아미노산에 대한 기질 특이성 및 정제된 효소를 사용한 L-tert-leucine의 제조

상기 실시예 3에서 정제된 가지사슬 아미노산 전달효소를 사용하여 하기 [표 4]에 나타낸 각종 L-아미노산과 trimethylpyruvate를 기질로 하여 반응을 수행한하였다. 20 mM trimethylpyruvate와 20 mM L-아미노산 및 50 mM 인산칼륨(pH 7.0)의 100 ㎕에, 정제된 6 U/mL 효소 10 ㎕를 첨가하고, 이를 37 ℃에서 6 시간 반응시키고 L-tert-leucine의 생성량을 측정하였다. 이 반응을 세 번에 걸쳐 수행하였다. 그 결과를 하기 [표 4]에 나타내었다.

케토산	L-아미노산	L-tert-leucine의농도 (mM)
Trimethylpyruvate	L-alanine	2.24	2.07	2.23
Trimethylpyruvate	L-homoalanine	5.57	4.43	5.71
Trimethylpyruvate	L-valine	6.31	5.04	6.23
Trimethylpyruvate	L-norvaline	6.31	5.34	6.06
Trimethylpyruvate	L-norleucine	5.90	5.48	5.55
Trimethylpyruvate	L-leucine	6.71	6.32	7.06
Trimethylpyruvate	L-Isoleucine	7.79	7.48	6.51

실시예 8. 정제한 오메가 트랜스아미나제 효소의 아미노산에 대한 기질 특이성 및 정제된 오메가 트랜스아미나제 효소를 사용한 L-glycine의 제조

상기 실시예 3에서 정제된 오메가 트랜스아미나제 효소를 사용하여 하기 [표 5]에 나타낸 각종 L-아미노산과 trimethylpyruvate를 기질로 하여 반응을 수행하였다. 20 mM glyoxylate와 20 mM L-아미노산 및 50 mM 인산칼륨(pH 7.0)의 100 ㎕에, 정제된 5 U/mL 효소 10 ㎕를 첨가하고, 이를 37 ℃에서 6 시간 동안 반응시키고 L-glycine의 생성량을 측정하였다. 이 반응을 세 번에 걸쳐 수행하고 Ochrobactrum anthropi 유래의 오메가트랜스아미나제 효소의 반응과 비교하였다. 그 결과를 하기 [표 5]에 나타내었다.

Aminoacceptor	Aminodonor	L-glycine의 농도 (mM)
Aminoacceptor	Aminodonor	PdwTA			OawTA
Glyoxylate	L-alanine	13.92	13.31	11.61	11.73
Glyoxylate	L-homoalanine	12.56	13.31	11.26	4.97
Glyoxylate	L-valine	0.18	0.20	0.17	0.00
Glyoxylate	L-norvaline	13.43	14.29	14.12	0.36
Glyoxylate	L-norleucine	13.41	12.97	12.59	0.28
Glyoxylate	L-leucine	7.93	7.95	5.71	0.00
Glyoxylate	L-Isoleucine	0.00	0.00	0.00	0.00

실시예 9. 정제한 오메가트랜스아미나제 효소의 케토산에 대한 기질 특이성 및 정제된 오메가트랜스아미나제 효소를 사용한 광학 활성 아미노산으로의 전환

상기 실시예 3에서 정제된 오메가트랜스아미나제 효소를 사용하여 하기 [표 6]에 나타낸 각종 케토산과 아민을 기질로 하여 반응을 수행하였다. 20 mM 케토산과 20 mM (S)-α-methylbenzylamine 및 50 mM 인산칼륨 (pH 7.0)의 100 ㎕에, 정제된 6 U/mL 효소 10 ㎕를 첨가하고, 이를 37 ℃에서 6 시간 반응시키고 acetophenone((S)-α-methylbenzylamine의 디아미네이션된 케톤)의 생성량을 측정하였다. 이 반응을 Ochrobactrum anthropi 유래의 오메가트랜스아미나제 효소의 반응과 비교하였다. 그 결과를 하기 [표 6]에 나타내었다.

케토산	생성 아미노산	아민	Acetophenone의 농도 (mM)
케토산	생성 아미노산	아민	PdwTA	OawTA
Pyruvate	(L-alanine)	(S)-α-MBA	5.18	4.84
2-oxobutyrate	(L-homoalanine)	(S)-α-MBA	5.03	5.05
3-methyl-2-oxobutyrate	(L-valine)	(S)-α-MBA	0.00	0.00
2-oxopentanoic acid	(L-norvaline)	(S)-α-MBA	5.24	3.45
2-oxohexanoic acid	(L-norleucine)	(S)-α-MBA	5.22	3.07
4-methyl-2-oxopentanoic acid	(L-leucine)	(S)-α-MBA	4.99	0.03
3-methyl-2-oxopentanoic aicd	(L-Isoleucine)	(S)-α-MBA	0.00	0.00

실시예 10. 정제한 오메가 트랜스아미나제 효소의 케토산에 대한 초기 반응속도 구간에서의 기질 특이성 및 정제된 오메가트랜스아미나제 효소를 사용한 광학 활성 아미노산으로의 전환

상기 실시예 3에서 정제된 오메가 트랜스아미나제 효소를 사용하여 하기 [표 7]에 나타낸 각종 케토산과 아민을 기질로 하여 반응을 수행하였다. 20 mM 케토산과 20 mM (S)-α-methylbenzylamine 및 50 mM 인산칼륨 (pH 7.0)의 100 ㎕에 정제된 1 U/mL 효소 10 ㎕를 첨가하고, 이를 37 ℃에서 10 분간 반응시키고 acetophenone((S)-α-methylbenzylamine의 디아미네이션된 케톤)의 생성량을 측정하였다. 이 반응을 Ochrobactrum anthropi 유래의 오메가 트랜스아미나제 효소의 반응과 비교하였다. 그 결과를 [표 7]에 나타내었다.

케토산	OawTA	PdwTA
gyloxylate	1.733	1.076
pyruvate	1.284	1.216
2-oxobutyrate	0.173	0.821
β-hydroxypyruvate	0.183	0.066
mercaptopyruvate	0.012	0.008
Fluoropyruvate	0.554	0.339
Bromopyruvate	0.010	-0.001
2-oxopentanoic acid	0.378	1.332
4-methyl-2-oxopentanoic acid	0.005	0.175
2-ketohexanoic acid	0.006	0.713

실시예 11. 가지사슬 아미노산 전달효소와 오메가 트랜스아미나제의 기질특이성 비교를 통하여 순환시킬 조기질의 선택

상기 실시예 4 내지 10에서 얻은 두 효소의 기질 특이성 비교를 통하여 가지사슬 아미노산 전달효소의 경우 아미노산의 곁사슬의 탄소수가 증가할수록 활성이 높아지고 오메가 트랜스아마나제의 경우 아미노산의 곁사슬의 탄소수가 증가할수록 활성이 감소함을 확인하였다.

따라서, 두 가지 효소가 공통적으로 좋은 활성을 가진 유일한 기질인 L-homoalanine을 두 개의 트랜스아미나제의 반응 사이에서 순환시킬 조기질로써 선정하였다. 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다.

실시예 12. 가지사슬 아미노산 전달효소와 오메가 트랜스아미나제의 coupled 효소 반응에서의 조기질의 적정 농도 확인 및 coupled 효소 반응을 이용한 L-tert-leucine의 생산

가지사슬 아미노산 전달효소의 기질인 trimethylpyruvate와 오메가 트랜스아미나제의 기질인 benzylamine의 농도를 고정하고 상기 실시예 11에서 결정한 두 효소의 조기질인 L-homoalanine의 농도를 증가시키면서 조기질의 비율에 따른 L-tert-leucine의 생성량의 변화를 확인하였다.

5 mM trimethylpyruvate, 5 mM benzylamine, 5 mM pyridoxal 5'-phosphate(PLP), 50 mM 인산칼륨 및 0.1 U/mL 가지사슬 아미노산 전달효소 와 0.1 U/mL 오메가트랜스아미네이스의 100 ㎕에서 조기질 L-homoalanine 의 농도를 0 mM 에서부터 5 mM 까지 변화시키면서 이를 37 ℃에서 7 시간 반응시키고 trimethylpyruvate으로부터 L-tert-leucine로의 전환율을 측정한다. 기질 농도의 10%인 0.5 mM 이상의 조기질 농도에서는 전환율의 증가 추세가 조기질의 농도증가에 비하여 약하므로 조기질의 농도를 기질 케토산의 농도의 10%으로 결정하였다. 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

실시예 13. 가지사슬 아미노산 전달효소의 농도를 고정하고 오메가 트랜스아미나제의 농도의 변화에 따른 coupled 효소 반응을 이용한 L-tert-leucine의 생산

Coupled 효소 반응 내에서의 오메가 트랜스아미나제의 농도에 따른 전환율의 변화를 가지사슬 아미노산 전달효소의 농도를 고정하고 확인하였다. 20 mM trimethylpyruvate, 2 mM L-homoalanine, 30 mM benzylamine, 0.1 mM PLP, 50 mM 인산칼륨 (pH 7) 및 0.6 U/mL 가지사슬 아미노산 전달 효소에서 오메가 트랜스아미나제의 농도를 5, 50, 500 mU/mL로 변화시키면서 시간에 따른 L-tert-leucine으로의 전환율을 확인하였다.

5% 전환율, 즉 1 mM의 조기질이 소모될 때 까지는 오메가 트랜스아미나제 농도에 따른 전환율의 차이가 없지만 그 이후로는 전환율의 차이가 오메가 트랜스아미나제의 농도에 따라 차이가 매우 크게 관찰되었다. 이는 오메가 트랜스아미나제에 의한 조기질의 순환 효과가 가지사슬 아미노산 전달효소 반응의 낮은 평형상수를 극복하는데 매우 효과적이다는 것을 의미한다. 그 결과를 하기 도 3에 나타내었다.

실시예 14. 오메가 트랜스아미나제의 농도를 고정하고 가지사슬 아미노산 전달효소의 농도의 변화에 따른 coupled 효소 반응을 이용한 L-tert-eucine의 생산

Coupled 효소 반응 내에서의 가지사슬 아미노산 전달효소의 농도에 따른 전환율의 변화를 오메가 트랜스아미나제의 농도를 고정하고 확인하였다. 20 mM trimethylpyruvate, 2 mM L-homoalanine, 30 mM benzylamine, 0.1 mM PLP, 50 mM 인산칼륨 (pH 7) 및 0.5 U/mL 오메가 트랜스아미나제에서 가지사슬 아미노산 전달효소의 농도를 6, 60, 600 mU/mL로 변화시키면서 시간에 따른 L-tert-leucine으로의 전환율을 확인하였다. 오메가 트랜스아미나제에 의해서 조기질이 다시 순환되어 공급되는 정도가 같으므로 전환율의 변화가 반응초기부터 가지사슬 아미노산 전달효소의 농도에 따라 차이가 크게 관찰되었다. 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.

실시예 15. 오메가 트랜스아미나제 반응 저해를 극복하기 위한 유기 용매의 첨가와 라세믹 조기질의 사용에 따른 Coupled 효소 반응을 이용한 L-tert-leucine의 생산

오메가 트랜스아미나제의 효소 반응에 의하여 생성되는 생성물에 의한 저해를 극복하기 위하여 헥산을 첨가하고 조기질을 라세메이트로 하여 L-tert-leucine로의 전환율 변화를 확인하였다. 20 mM trimethylpyruvate, 2 mM L-homoalanine, 30 mM benzylamine, 0.1 mM PLP, 50 mM 인산칼륨 (pH 7) 및 1.4 U/mL 가지사슬 아미노산 전달효소와 1.9 U/mL 오메가트랜스아미나제 1 mL에서 헥산을 3 mL 첨가하여 biphase system을 이용하여 L-tert-leucine을 생산하였다. 또한, 조기질 2 mM를 라세믹 조기질 4 mM로 변화하여 L-tert-leucine으로의 전환율 변화를 확인하였다.

헥산을 첨가함으로써 반응을 저해하는 알데히드의 생성을 극복하여 전환율이 증가함을 확인하였으며, 라세믹 조기질을 사용하여도 coupled 효소 반응에 의한 L-tert-leucine으로의 전환이 영향받지 않음을 확인하였다. 그 결과를 하기 도 5에 나타내었다.

실시예 16. 제한된 부피 내에서의 오메가 트랜스아미나제와 가지사슬 아미노산 전달효소간의 비율에 따른 L-tert-leucine의 생산

제한된 효소 반응 부피 내에서의 가지사슬 아미노산 전달효소와 오메가트랜스아미나제의 비율에 따른 L-tert-leucine의 전환율 변화를 확인하였다. 20 mM trimethylpyruvate, 4 mM DL-homoalanine, 30 mM benzylamine, 0.1 mM PLP 및 50 mM 인산칼륨 (pH 7) 1 mL에 가지사슬 아미노산 전달효소와 오메가 트랜스아미나제 비율을 달리하고 이를 37 ℃에서 19 시간 반응시킨 후 L-tert-leucine으로의 전환율 변화를 확인하였다. 가지사슬 아미노산 전달효소 대 오메가 트랜스아미나제의 비율이 1 : 8(U/mL)인 경우에 전환율이 가장 우수하게 나타났다. 그 결과를 하기 도 6에 나타내었다.

실시예 17. 유기용매 첨가에 따른 coupled 효소 반응의 L-tert-leucine생산

상기 실시예 16에서 가장 좋은 전환율을 보인 효소 비율을 이용하여 유기용매의 첨가에 따른 coupled 효소반응(bi-phase 반응)에 의한 L-tert-leucine 생산 전환율을 비교하였다. 20 mM trimethylpyruvate, 4 mM DL-homoalanine, 30 mM benzylamine, 0.1 mM PLP, 50 mM 인산칼륨 (pH 7) 및 0.6 U/mL 가지사슬 아미노산 전달효소와 4.8 U/mL 오메가 트랜스아미나제 1 mL에 헥산을 3 mL 첨가하여 첨가하지 않은 반응(mono-phase 반응)의 전환율과 비교하였다.

유기용매를 첨가함으로써 L-tert-leucine으로의 전환율이 200% 가까이 증가함을 확인하였다. 또한, 반응 혼합물내의 조기질의 농도와 그 케토산(2-oxobutyrate)의 농도를 확인하여 유기용매 첨가에 따른 조기질이 가지사슬 아미노산 전달효소의 초기 기질 농도에 가까운 농도를 계속 유지함에 의한 L-tert-leucine 생산 반응의 낮은 평형상수에 의한 낮은 전환율을 향상시킴을 확인하였다. 그 결과를 하기 도 7 및 도 8에 나타내었다.

실시예 18. 오메가 트랜스아미나제의 아민 기질에 따른 coupled 효소 반응에 의한 L-tert-leucine생산

오메가 트랜스아미나제의 아민 기질을 benzylamine과 (S)-α-methyl benzylamine으로 하여 coupled 효소반응의 의한 L-tert-leucine으로의 전환율 변화를 확인하였다. 20 mM trimethylpyruvate, 4 mM DL-homoalanine, 30 mM 아민 기질, 0.1 mM PLP, 50 mM 인산칼륨 (pH 7) 및 0.6 U/mL 가지사슬 아미노산 전달효소와 0.5 U/mL 오메가 트랜스아미나제 1 mL을 37 ℃에서 반응시키면서 전환율의 변화를 확인하였다.

(S)-α-methylbenzylamine를 오메가 트랜스아미나제의 아민 기질로 사용하였을 때 benzylamine을 아민 기질로 사용하였을 때에 비하여 150% 향상된 전환율을 확인하였다. 그 결과를 하기 도 9에 나타내었다.

실시예 19. 라세믹 아민 기질을 사용하여 coupled 효소 반응에 의한 L-tert-leucine의 생산

라세믹 아민 기질을 사용하여 coupled 효소 반응으로 L-tert-leucine을 생산하였다. 20 mM trimethylpyruvate, 4 mM DL-homoalanine, 60 mM rac-α-methylbenzylamine, 0.1 mM PLP, 50 mM 인산칼륨 (pH 7) 및 0.6 U/mL 가지사슬 아미노산 전달효소와 4.8 U/mL 오메가 트랜스아미나제 1 mL에 6 mL 헥산을 첨가하여 37 ℃에서 반응시키면서 L-tert-leucine을 생산하였다.

95.4%의 전환율로 coupled 효소 반응에 의하여 광학 활성 L-tert-leucine을 생산하였다. 또한, coupled 효소 반응내의 조기질과 그 케토산 분석을 통하여 조기질의 순환에 의한 trimethylpyruvate로부터의 L-tert-leucine전환을 확인하고, 오메가 트랜스아미나제의 라세믹 아민에 대한 선택적 반응에 의한 (R)-α-methylbenzylamine의 kinetic resolution 반응을 확인하였다. 그 결과를 하기 도 10, 도 11 및 도 12에 나타내었다.

실시예 20. coupled 효소 반응에 의한 L-3-hydroxyadamantylglycine의 생산

라세믹 아민 기질을 사용하여 coupled 효소 반응으로 L-3-hydroxy adamantylglycine을 생산하였다.

20 mM 2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-2-oxoethanoic acid, 4 mM DL- homoalanine, 60 mM rac-α-methylbenzylamine, 0.1 mM PLP, 50 mM 인산칼륨 (pH 7) 및 0.6 U/mL 가지사슬 아미노산 전달효소와 4.8 U/mL 오메가 트랜스아미나제 1 mL에 6 mL 헥산을 첨가하여 37 ℃에서 반응시키면서 L-3-hydroxyadamantylglycine을 생산하였다.

98.15%의 전환율로 coupled 효소 반응에 의하여 광학 활성 L-3-hydroxyadamantylglycine을 생산하였다. 또한 coupled 효소 반응내의 조기질과 그 케토산 분석을 통하여 조기질의 순환에 의한 2-(3-hydroxy-1-adamantyl) -2-oxoethanoic acid로부터의 L-3-hydroxyadamantylglycine 전환을 확인하고, 오메가 트랜스아미나제의 라세믹 아민에 대한 선택적 반응에 의한 (R)-α-methylbenzylamine의 kinetic resolution 반응을 확인하였다. 그 결과를 하기 도 13, 도 14 및 도 15에 나타내었다.

실시예 21. coupled 효소 반응에 의한 다양한 비천연 아미노산과 가지사슬 아미노산의 생산

coupled 효소 반응으로 다양한 비천연 아미노산과 가지사슬 아미노산을 생산하였다. 20 mM 케토산, 4 mM DL-homoalanine, 60 mM rac-α-methylbenzylamine, 0.1 mM PLP, 50 mM 인산칼륨 (pH 7) 및 0.6 U/mL 가지사슬 아미노산 전달효소와 4.8 U/mL 오메가 트랜스아미나제 1 mL에 6 mL 헥산을 첨가하여 37 ℃에서 반응시키면서 비천연 아미노산과 가지사슬 아미노산을 생산하였다.

각 광학 활성 아미노산 생산을 위하여 케토산으로 L-norvaline의 경우 2-oxopentanoate, L-valine의 경우 2-oxo-3-methylbutyrate, L-norleucine의 경우 2-oxohexanoate, L-leucine의 경우 2-oxo-4-pentanoate를 사용하였다. 다양한 비천연 아미노산과 가지사슬 아미노산을 coupled 효소 반응을 통하여 90% 이상의 전환율로 생산하였다. 그 결과를 하기 [표 8]에 나타내었다

	케토산 (mM)	L-아미노산 (mM)	D-아미노산 (mM)	S-MBA (mM)	R-MBA (mM)	MBA ee (%)	반응시간 (h)
Norvaline	0	19.93	0.00	4.60	21.61	64.89	76
Valine	1.58	21.25	0.02	3.56	21.10	72.02	40
Norleucine	0	19.57	0.01	3.35	20.98	72.46	40
leucine	0	19.73	0.02	3.94	20.72	68.06	53

실시예 22. Ochrobactrum anthropi 유래의 오메가 트랜스아미나제와isopropylamine을 오메가 트랜스아미나제의 아민 기질로 사용하여 Coupled 효소 반응을 통해 L-tert-leucine 생산

Ochrobactrum anthropi 유래의 오메가 트랜스아미나제는 isopropylamine에 대한 활성이 Paracoccus denitrificans에 비하여 강하므로 Ochrobactrum anthropi 유래의 오메가 트랜스아미나제와 isopropylamine을 사용하여 coupled 효소 반응을 통해 L-tert-leucine을 생산하였다.

20 mM trimethylpyruvate, 4 mM DL-homoalanine, 25 mM isopropylamine, 0.1 mM PLP, 50 mM 인산칼륨 (pH 7) 및 0.6 U/mL 가지사슬 아미노산 전달효소와 4.8 U/mL 오메가트랜스아미네이스 1 mL을 37 ℃에서 30, 40 시간 반응하여 L-tert-leucine을 생산하였다. 그 결과를 하기 [표 9]에 나타내었다.

	농도 (mM)
reaction time (h)	30	40
trimethylpyruvate	3.621
L-homoalanine	1.907	1.615
2-oxobutyrate	0.008
L-tert-leucine	14.912	18.225
isopropylamine	11.213	10.600

실시예 23. 고농도의 trimethylpyruvate를 이용하여 coupled 효소 반응을 통해 고농도의 L-tert-leucine 생산

고농도의 trimethylpyruvate를 사용하고 Ochrobactrum anthropi 유래의 오메가 트랜스아미나제와 isopropylamine을 사용하여 coupled 효소 반응을 통해 고농도의 L-tert-leucine을 생산하였다. 100 mM trimethylpyruvate, 4, 10, 20 mM DL-homoalanine, 125 mM isopropylamine, 0.1 mM PLP, 50 mM 인산칼륨 (pH 7) 및 0.6 U/mL 가지사슬 아미노산 전달효소와 20 U/mL 오메가 트랜스아미나제를 37 에서 반응시켜 trimethylpyruvate로부터의 L-tert-leucine으로 전환이 진행됨을 확인하였다. 그 결과를 하기 도 16과 [표 10]에 나타내었다.

20 mM 조기질 사용, 10 시간 반응 후 농도 (mM)
L- tert-leucine	trimethylpyruvate	L-homoalanine	2-oxobutyrate	isopropylamine
39.963	67.331	10.548	0.350	106.357

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University <120> Method for production enantiopure amino acids using w-transaminase with cosubstrate recycling <130> HPC3406 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atcatggaat tcatgaccac gaagaaagct 30 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 aaaaactcga gttattgatt aacttgatct aacca 35 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Paracoccus denitrificans <400> 3 gatatacata tgaaccaacc gcaaagc 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Paracoccus denitrificans <400> 4 gtggtgctcg agggccacct cggcaaa 27 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Ochrobactrum anthropi <400> 5 gatataccat ggnnactgct cagccaaact ct 32 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Ochrobactrum anthropi <400> 6 cgagtgcggc cgtcctggtg aggcttgc 28 <210> 7 <211> 930 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 atgaccacga agaaagctga ttacatttgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60 gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg cactatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120 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<400> 8 Met Thr Thr Lys Lys Ala Asp Tyr Ile Trp Phe Asn Gly Glu Met Val 1 5 10 15 Arg Trp Glu Asp Ala Lys Val His Val Met Ser His Ala Leu His Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Val Phe Glu Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Ser His Lys Gly 35 40 45 Pro Val Val Phe Arg His Arg Glu His Met Gln Arg Leu His Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Ile Tyr Arg Phe Pro Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Leu Met 65 70 75 80 Glu Ala Cys Arg Asp Val Ile Arg Lys Asn Asn Leu Thr Ser Ala Tyr 85 90 95 Ile Arg Pro Leu Ile Phe Val Gly Asp Val Gly Met Gly Val Asn Pro 100 105 110 Pro Ala Gly Tyr Ser Thr Asp Val Ile Ile Ala Ala Phe Pro Trp Gly 115 120 125 Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu Gln Gly Ile Asp Ala Met Val 130 135 140 Ser Ser Trp Asn Arg Ala Ala Pro Asn Thr Ile Pro Thr Ala Ala Lys 145 150 155 160 Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Val Gly Ser Glu Ala Arg 165 170 175 Arg His Gly Tyr Gln Glu Gly Ile Ala Leu Asp Val Asn Gly Tyr Ile 180 185 190 Ser Glu Gly Ala Gly Glu Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Gly Val Leu 195 200 205 Phe Thr Pro Pro Phe Thr Ser Ser Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Asp 210 215 220 Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ile Glu Val Arg Glu Gln 225 230 235 240 Val Leu Ser Arg Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Asp Glu Val Phe Met Ser 245 250 255 Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Val Arg Ser Val Asp Gly Ile Gln 260 265 270 Val Gly Glu Gly Arg Cys Gly Pro Val Thr Lys Arg Ile Gln Gln Ala 275 280 285 Phe Phe Gly Leu Phe Thr Gly Glu Thr Glu Asp Lys Trp Gly Trp Leu 290 295 300 Asp Gln Val Asn Gln *** 305 310 <210> 9 <211> 1362 <212> DNA <213> Paracoccus denitrificans <400> 9 atgaaccaac cgcaaagctg ggaagcccgg gccgagacct attcgctcta cggtttcacc 60 gacatgccct cggtccatca gcggggcacg gtcgtcgtga cccatggcga ggggccctat 120 atcgtcgatg tccatggccg ccgctatctg gatgccaatt cgggcctgtg gaacatggtc 180 gcgggcttcg accacaaggg cctgatcgag gccgccaagg cgcaatacga ccgctttccc 240 ggctatcacg cctttttcgg ccgcatgtcc gaccagaccg tgatgctgtc ggaaaagctg 300 gtcgaggtct cgccattcga caacggccgg gtcttctata ccaattccgg ctccgaggcg 360 aacgacacca tggtcaagat gctgtggttc ctgcatgccg ccgagggcaa gccgcaaaag 420 cgcaagatcc tgacgcgctg gaacgcctat cacggcgtga ccgcggtttc ggcctcgatg 480 accggcaagc cctacaactc ggtcttcggc ctgccgctgc ccggcttcat ccacctgacc 540 tgcccgcatt actggcgcta tggcgaggaa ggcgagaccg aggcgcaatt cgtcgcccgc 600 ctggcacgcg agcttgagga taccatcacc cgcgagggcg ccgacaccat cgccggcttc 660 ttcgccgagc cggtgatggg cgcggggggg gtgatcccgc cggcgaaggg ttatttccag 720 gccatcctgc cgatcttgcg caagtatgac atcccgatga tctcggacga ggtgatctgc 780 ggcttcgggc gcaccggcaa cacctggggc tgcctgacct acgacttcat gcccgatgcg 840 atcatctcgt ccaagaacct gactgcgggc ttcttcccga tgggcgccgt catcctcggg 900 cccgacctcg ccaagcgggt cgaggccgcg gtcgaggcga tcgaggagtt cccgcacggc 960 ttcaccgcct cgggccatcc ggtcggctgc gccatcgcgc tgaaggccat cgacgtggtg 1020 atgaacgagg ggctggccga gaatgtccgc cgcctcgcac cccgcttcga ggcggggctg 1080 aagcgcatcg ccgaccgccc gaacatcggc gaataccgcg gcatcggctt catgtgggcg 1140 ctggaggcgg tcaaggacaa gccgaccaag acccccttcg acgccaatct ttcggtcagc 1200 gagcgcatcg ccaatacctg caccgatctg gggctgatct gccggccgct gggccagtcc 1260 atcgtgctgt gcccgccctt catcctgacc gaggcgcaga tggacgagat gttcgaaaag 1320 ctggaaaagg cgctcgacaa ggtctttgcc gaggtggcct ga 1362 <210> 10 <211> 453 <212> PRT <213> Paracoccus denitrificans <400> 10 Met Asn Gln Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Val His Gln Arg Gly Thr Val Val 20 25 30 Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val His Gly Arg Arg 35 40 45 Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly Phe Asp 50 55 60 His Lys Gly Leu Ile Glu Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Asp Arg Phe Pro 65 70 75 80 Gly Tyr His Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu 85 90 95 Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Asp Asn Gly Arg Val Phe 100 105 110 Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys Met Leu 115 120 125 Trp Phe Leu His Ala Ala Glu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu 130 135 140 Thr Arg Trp Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met 145 150 155 160 Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe 165 170 175 Ile His Leu Thr Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu 180 185 190 Thr Glu Ala Gln Phe Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu Asp Thr 195 200 205 Ile Thr Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala Glu Pro 210 215 220 Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ala Lys Gly Tyr Phe Gln 225 230 235 240 Ala Ile Leu Pro Ile Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Pro Met Ile Ser Asp 245 250 255 Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly Cys Leu 260 265 270 Thr Tyr Asp Phe Met Pro Asp Ala Ile Ile Ser Ser Lys Asn Leu Thr 275 280 285 Ala Gly Phe Phe Pro Met Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Asp Leu Ala 290 295 300 Lys Arg Val Glu Ala Ala Val Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro His Gly 305 310 315 320 Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu Lys Ala 325 330 335 Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu 340 345 350 Ala Pro Arg Phe Glu Ala Gly Leu Lys Arg Ile Ala Asp Arg Pro Asn 355 360 365 Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu Glu Ala Val 370 375 380 Lys Asp Lys Pro Thr Lys Thr Pro Phe Asp Ala Asn Leu Ser Val Ser 385 390 395 400 Glu Arg Ile Ala Asn Thr Cys Thr Asp Leu Gly Leu Ile Cys Arg Pro 405 410 415 Leu Gly Gln Ser Ile Val Leu Cys Pro Pro Phe Ile Leu Thr Glu Ala 420 425 430 Gln Met Asp Glu Met Phe Glu Lys Leu Glu Lys Ala Leu Asp Lys Val 435 440 445 Phe Ala Glu Val Ala 450 <210> 11 <211> 1371 <212> DNA <213> Ochrobactrum anthropi <400> 11 atgactgctc agccaaactc tcttgaagct cgcgatatcc gttatcatct ccattcttat 60 accgatgctg tccgcctcga agcggaaggt ccgctcgtca tcgagcgtgg cgatggcatt 120 tacgtcgaag atgtatcggg caagcgctat atcgaagcga tgtcaggact gtggagtgtt 180 ggcgtgggct tttccgaacc gcgtctggcc gaagcagctg cacgacagat gaagaagctg 240 cctttctacc atacattctc ctaccgttcg catggtcctg tcattgatct ggcagaaaag 300 cttgtctcaa tggctcctgt tccgatgagc aaggcctact tcaccaattc aggttccgaa 360 gccaacgata cggtcgtcaa gttgatctgg tatcgctcca atgcgctggg tgaaccggag 420 cgcaagaaaa tcatctcacg caagcgcggc tatcacggtg tgacgattgc ctctgccagc 480 ctgaccggct tgcccaacaa tcaccgttct ttcgatctgc cgatcgatcg tatcctgcat 540 acgggctgcc cgcattttta tcgcgaagga caggctggcg agagtgagga acaattcgca 600 acgcggctgg cggatgagct ggaacagttg atcatcgcgg aaggtcctca caccatcgct 660 gctttcattg gcgagccggt gatgggggct ggcggcgtag tcgtgccgcc caaaacctat 720 tgggaaaaag tgcaggctgt tctcaagcgc tacgatattc tgctgatcgc cgacgaggtt 780 atttgcggct tcggacggac aggcaatctg ttcggcagcc agactttcga tatgaaaccg 840 gacattctgg tgatgtcgaa gcagctttcg tcatcctatc tgccgatttc ggccttcctc 900 atcaacgagc gtgtgtacgc gccaattgcc gaagaaagcc acaagatcgg cacgcttggc 960 acgggcttca cggcatctgg ccatccggtg gcggcagcgg tagcgctgga aaacctcgcc 1020 attattgaag agcgtgatct ggtcgccaat gcgcgcgacc gcggcaccta tatgcagaag 1080 cgcctgcgtg agttgcagga tcatcctctg gtcggcgaag tgcgtggcgt tggtctcata 1140 gccggtgtcg agcttgtcac cgacaagcag gccaagacgg gccttgaacc aaccggcgct 1200 ctgggcgcaa aggcaaacgc cgttcttcag gagcgcggcg tcatttcccg cgcaatgggc 1260 gatacgcttg ccttctgccc gccgctcatc atcaacgatc agcaggttga tacgatggtg 1320 tccgcgctcg aggcgacgct gaacgatgtt caggcaagcc tcaccaggta a 1371 <210> 12 <211> 456 <212> PRT <213> Ochrobactrum anthropi <400> 12 Met Thr Ala Gln Pro Asn Ser Leu Glu Ala Arg Asp Ile Arg Tyr His 1 5 10 15 Leu His Ser Tyr Thr Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Leu 20 25 30 Val Ile Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Leu Trp Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Val Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr Arg Leu Ala Asp Glu Leu Glu 195 200 205 Gln Leu Ile Ile Ala Glu Gly Pro His Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly 210 215 220 Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Val Val Pro Pro Lys Thr Tyr 225 230 235 240 Trp Glu Lys Val Gln Ala Val Leu Lys Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Ile 245 250 255 Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Leu Phe Gly 260 265 270 Ser Gln Thr Phe Asp Met Lys Pro Asp Ile Leu Val Met Ser Lys Gln 275 280 285 Leu Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Ile Ser Ala Phe Leu Ile Asn Glu Arg 290 295 300 Val Tyr Ala Pro Ile Ala Glu Glu Ser His Lys Ile Gly Thr Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gly Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu 325 330 335 Glu Asn Leu Ala Ile Ile Glu Glu Arg Asp Leu Val Ala Asn Ala Arg 340 345 350 Asp Arg Gly Thr Tyr Met Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gln Asp His 355 360 365 Pro Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Ile Ala Gly Val Glu 370 375 380 Leu Val Thr Asp Lys Gln Ala Lys Thr Gly Leu Glu Pro Thr Gly Ala 385 390 395 400 Leu Gly Ala Lys Ala Asn Ala Val Leu Gln Glu Arg Gly Val Ile Ser 405 410 415 Arg Ala Met Gly Asp Thr Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Ile Asn 420 425 430 Asp Gln Gln Val Asp Thr Met Val Ser Ala Leu Glu Ala Thr Leu Asn 435 440 445 Asp Val Gln Ala Ser Leu Thr Arg 450 455

Claims

(a) 가지사슬 아미노산 전달효소(branched-chain aminotransferase, BCAT) 및 아미노산 조기질을 이용하여 케토산(keto-acid)을 아미노산으로 전환시키고 상기 아미노산 조기질은 아미노산 조기질의 케토산으로 전환되는 반응; 및
(b) 오메가 트랜스아미나제(ω-transaminase, ωTA)에 의해서 아민 기질의 아민을 상기 아미노산 조기질의 케토산에 전이시켜 아미노산 조기질을 생성시키는 반응;을 포함하고,
상기 아미노산 조기질과 아미노산 조기질의 케토산은 상기 (a) 반응과 (b) 반응에 각각 순환 반응되면서 상기 (a) 반응과 (b) 반응을 커플링시키는 것을 특징으로 하고,
상기 아미노산 조기질은 상기 케토산 농도의 0.2 내지 20%이고,
상기 가지사슬 아미노산 전달효소(U/mL)와 오메가 트랜스아미나제(U/mL)의 농도 비율이 1:1-10인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아미노산의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 아미노산 조기질은 가지사슬 아미노산 전달효소와 오메가 트랜스아미나제에 모두 반응성을 보이는 아미노산으로서, 알라닌, 호모 알라닌, 노르발린 및 노르류신 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아미노산의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 케토산은 파이루베이트, 2-옥소부티레이트, 2-(3-하이드록시-1-아다만틸)-2-옥소에타노익 엑시드, 트리메틸파이루베이트, 3-메틸-2-옥소부티레이트, 3-메틸-2옥소펜타노익 엑시드, 4-메틸-2-옥소펜타노익 엑시드, 2-옥소펜타노익 엑시드 및 2-옥소헥사노익 엑시드 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아미노산의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 아민 기질은 벤질아민, 메틸벤질아민 또는 이소프로필아민인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아미노산의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 광학 활성 아미노산은 L-발린, L-노르발린, L-류신, L-이소류신, L-노르류신, L-터트-류신 및 L-3-하이드록시아다만틸글라이신 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아미노산의 제조방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 순환 반응은 케톤이나 알데히드에 의한 오메가 트랜스아미나제의 반응성 저해가 있는 경우에 유기 용매를 더 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 광학 활성 아미노산의 제조방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 가지사슬 아미노산 전달효소는 대장균으로부터 분리한 것으로서, 서열번호 7의 DNA 서열 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 광학 활성 아미노산의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 오메가 트랜스아미나제는 파라코쿠스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans)균으로부터 분리한 것으로서, 서열번호 9의 DNA 서열 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 광학 활성 아미노산의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 오메가 트랜스아미나제는 오크로박트룸 안트로피(Ochrobactrum anthropi)균으로부터 분리한 것으로서, 서열번호 11의 DNA 서열 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 광학 활성 아미노산의 제조방법.