KR101071274B1

KR101071274B1 - 미생물 유래의 사슬형 트랜스아미나제를 이용한 Ｌ-6-ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ의 생산방법

Info

Publication number: KR101071274B1
Application number: KR1020090104556A
Authority: KR
Inventors: 윤형돈; 이상협; 김아란
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2011-10-07
Also published as: KR20110047789A

Abstract

본 발명은 미생물 유래의 사슬형 트랜스아미나제를 이용한 L-6-hydroxynorleucine의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1) 대장균 유래의 사슬형 트랜스아미나제를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 3) 상기 형질전환체를 배양하여 사슬형 트랜스아미나제의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계; 및 4) 수득한 배양물을 2-keto 6-hydroxyhexanoic acid와 혼합하는 단계를 포함하는 L-6-hydroxynorleucine의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 고가의 조효소를 필요로 하지 않으며, 다단계 반응을 통하지 않고도 높은 광학순도의 L-6-hydroxynorleucine를 제조할 수 있다.

L-6-hydroxynorleucine, 트랜스아미나제, 대장균

Description

미생물 유래의 사슬형 트랜스아미나제를 이용한 Ｌ-6-ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ의 생산방법{Process for preparing L-6-hydroxynorleucine by using a branched-chain aminotransferase from microorganism}

본 발명은 L-6-hydroxynorleucine의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미생물 유래의 사슬형 트랜스아미나제를 이용하여 L-6-hydroxynorleucine을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 고가의 조효소를 필요로 하지 않으며, 다단계 반응을 통하지 않고도 높은 광학순도의 L-6-hydroxynorleucine를 제조할 수 있다.

L-6-hydroxynorleucine는 임상치료에서 사용되는 vasopeptide 저해제 합성과 항고혈압제로서 메탈단백질 분해효소의 저해제로 사용되는 C-7 azepinone의 전구체로 이용되고 있는 광학활성 아미노산이다. 또한, siderophore, indospicine, 그리고 펩타이드 호르몬 유사체 합성에도 이용되고 있다.

L-6-hydroxynorleucine을 생산하는 대표적인 방법은 탈수소효소를 이용하거 나 또는 탈수소효소와 디아미노산 산화효소를 함께 이용하는 방법이 알려져 있다. 탈수소효소를 이용하는 방법의 경우, 고가의 조효소의 재생산을 위해서 다른 탈수소효소가 함께 사용되어야 하며, 이때 또 다른 기질이 첨가되어야 하기 때문에 반응이 복잡한 단점이 있다. 또한, 디아아미노산 산화효소를 이용하는 방법의 경우, 반응 중 과산화수소가 생성되며, 생성된 과산화수소의 독성으로 인해서 효소가 불활성화 되는 단점이 있다.

따라서, 광학활성 아미노산인 L-6-hydroxynorleucine을 제조함에 있어서, 복잡한 단계를 거치지 않고 과산화수소와 같은 부산물이 생성되지 않는 방법이 요구되고 있으며, 이렇게 제조된 L-6-hydroxynorleucine은 다양한 의약품의 합성에 활용될 수 있다.

본 발명은 대장균 유래의 트랜스아미나제를 이용하여 L-6-hydroxynorleucine를 생산함으로써, 종래의 방법에 비하여 간단한 공정만으로 과산화수소와 같은 부산물의 생성되지 않으면서 순수한 L-6-hydroxynorleucine을 생산할 수 있는 생산방법을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.

본 발명은 1) 대장균 유래의 사슬형 트랜스아미나제를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 3) 상기 형질전환체를 배양하여 사슬형 트랜스아미나제의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계; 및 4) 수득한 배양물을 2-keto-6-hydroxyhexanoic acid와 혼합하는 단계를 포함하는 L-6-hydroxynorleucine의 생산방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 대장균 유래의 사슬형 트랜스아미나제를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균에 관한 것이다.

앞서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 따르면 대장균 유래의 사슬형 트랜스아미나제를 이용함으로써 종래의 생산방법에 비하여 간단한 공정만으로 과산화수소와 같은 부산물의 생성되지 않으면서 L-6-hydroxynorleucine을 고순도로 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적 의미로 한정되어 해석되지 아니하며, 본 발명의 기술적 사항에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.

본 발명은 대장균 유래의 트랜스아미나제를 이용한 L-6-hydroxynorleucine의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 L-6-hydroxynorleucine의 생산방법은, 1) 대장균으로부터 분리된 사슬형 트랜스아미나제를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 3) 상기 형질전환체를 배양하여 사슬형 트랜스아미나제의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계; 및 4) 수득한 배양물을 2-keto-6-hydroxyhexanoic acid와 혼합하는 단계를 포함한다.

본 발명의 생산방법 1)의 발현벡터 제조단계에서, PCR을 이용하여 대장균의 사슬형 트랜스아미나제의 유전자를 증폭한다. 본 발명에서 트랜스아미나제는 아미노기를 한 분자에서 다른 분자로 옮기는 반응을 촉매하는 효소로, 그람음성간균 미생물로부터 유래할 수 있다. 이때 대장균으로부터 유래한 트랜스아미나제(ilvE)를 이용하는 것이 바람직하며, 다른 미생물 유래의 사슬형 트랜스아미나제도 유사한 반응을 수행할 수 있다. 트랜스아미나제(ilvE)는 루신, 아이소루신, 발린 등과 같은 사슬형 아미노산(aliphatic amino acids)에 활성이 있다고 알려져 있다.

트랜스아미나제는 1) 기질특이성이 넓어 타 효소에 비해 다양한 기질에 대해 반응성이 있으며, 2) 광학선택성이 뛰어나 광학적으로 순수한 화합물을 얻을 수 있고, 3) 반응 기질 및 생성물의 물에 대한 높은 용해도로 인해 유기용매를 사용할 필요가 없으며, 4) 조효소를 필요로 하지 않고, 5) 효소의 안정성이 뛰어나 반응기 운전이 용이한 특징을 가지고 있다.

트랜스아미나제 중 가장 광범위하게 연구되고 이용되는 효소는 알파-트랜스아미나제이며, 이에 해당되는 것은 아스파테이트 트랜스아미나제(E.C. 2.6.1.1, aspC), 타이로신 트랜스아미나제(E.C. 2.6.2.5, tyrB), 사슬형 트랜스아미나제(E.C. 2.6.1.42, ilvE) 등이다(Christen and Metzler, 1985; Foth eringham et al., 1986; wang et al., 1987).

본 발명에서 발현 벡터는 pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a, pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균에 형질전환 가능한 다양한 벡터 등이 이용될 수 있지만, 특별히 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 발현 벡터는 pET24ma 및 pET23b 일 수 있다.

본 발명의 생산방법 2)의 형질전환체 제조단계에서는, 대장균 균주로서 XL1-Blue, Top10, BL21(DE3), DH5α 및 DH10B 등이 이용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 BL21(DE3)이 이용될 수 있다. 또한, 대장균의 형질전환은 열충격법 (heat shock) 또는 전기충격법 (electroporation)을 사용하여 이루어진다.

본 발명의 생산방법 3)의 사슬형 트랜스아미나제 수득단계에서는, 형질전환된 대장균을 각각 카나마이신 또는 엠피실린을 함유한 배지에서 37℃ 에서 5시간 내지 24시간 배양하여, 세포 현탁도가 0.75 및 0.6이 되었을 때, IPTG를 첨가하고, 추가로 5시간 더 배양함으로써 사슬형 트랜스아미나제의 발현을 유도한다.

본 발명의 생산방법 4)의 2-keto-6-hydroxyhexanoic acid와 혼합단계에서는, 대장균 유래의 사슬형 트랜스아미나제를 L-글루탐산과 2-keto-6-hydroxyhexanoic acid용액에 혼합한다. 대장균 유래의 사슬형 트랜스아미나제는 대장균에서 사슬형 트랜스아미나제를 과발현해서 세포를 파괴한 뒤 그 수액을 그대로 사용하거나(세포추출물 형태), 세포 추출물 중에서 사슬형 트랜스아미나제만 분리하여 사용하거나(분리된 단백질 형태), 효소를 과발현하고 있는 세포 자체를 파괴하지 않고 이용할 수 있다(전세포 반응).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 보호범위가 제한되는 것은 결코 아니다.

<실시예 1> 대장균으로부터 genomic DNA 분리

완전배지에 배양한 세포를 4℃에서 4,000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 15mL의 용해완충용액(15% 수크로즈, 25mM EDTA, 25mM Tris 완충용액)으로 녹였다. 이것을 4℃에서 4,000rpm으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 라이소자임(TSB 완충용액 내에 5mg/mL)을 넣고, 37℃에서 10분간 반응시켰다.

이후 0.5M EDTA 1.2mL를 넣고, 37℃에서 5분간 방치한 후, 10% SDS 1mL를 넣고, 70℃에서 10분간 얼음물에 방치한 후, 5M 포타슘아세테이트 2.5mL를 넣고, 얼음물에 15분간 방치하였다. 상기 용액의 양과 동일한 양의 페놀-클로로포름 혼합물(50:50)을 넣고, 30분간 혼합한 후, 4℃에서 4000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 획득하였다.

얻어진 용액의 0.5배에 달하는 클로로포름을 첨가하여, 서서히 진탕시킨 후, 4℃ 에서 4000rpm으로 원심분리하고, 다시 상층액을 회수하여, 이를 50㎍/mL의 양에 달하도록 RNase처리로 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

이후, 0.8배에 달하는 아이소프로판올과 2.5배에 달하는 에탄올을 첨가하고, 서서히 진탕시킨 후, 구멍을 막은 파스퇴르 피펫을 이용하여 genomic DNA를 수집하여 튜브에 넣고 완전히 건조 시킨 후, TE 완충용액으로 녹여 사용하였다.

<실시예 2> 발현 벡터 및 대장균 형질전환체 제조

실시예 1에서 분리한 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR을 통하여 트랜스아미나제를 획득하였다. 이때 사용된 프라이머는 다음과 같다.

포워드: 5'-ATCATGGAATTCATGACCACGAAGAAAGCT-3'---서열번호 1

리버스: 5'-AAAAACTCGAGTTATTGATTAACTTGATCTAACCA-3'---서열번호 2

PCR 산물을 NdeI/BamHI 제한효소로 처리하고, 그 분획을 각각 pET24ma(히로시 사카모토로부터 증여받음, 파리) 및 pET23b(노바젠)에 각각 라이게이션하여 재조합 플라스미드를 제조하고, 이 재조합 플라스미드를 발현용 대장균 균주인 BL21(DE3)에 형질전환시켰다.

수득된 형질전환 대장균은 각각 카나마이신 또는 엠피실린을 함유한 배지에서 37℃ 에서 5시간 내지 24시간 배양 하였으며, 세포 현탁도가 0.75 및 0.6이 되었을 때, IPTG를 첨가하고, 추가로 5 시간 더 배양함으로써 효소의 발현을 유도하였다.

<실시예 3> 사슬형 트랜스아미나제를 함유하는 세포 추출물의 제조

사슬형 트랜스아미나제를 과발현하는 대장균 세포를 PBS 완충용액(pH 7)으로 3회 세척하여 회수된 세포외부의 배지성분을 제거하였다. 배지성분이 제거된 세포를 3배 내지 5배(부피비)의 10mM 인산완충용액, 20mM 피리독살 5-인산, 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 1mM 페닐메틸설포닐플로라이드, 0.01%(w/w) 2-메르캅토에탄올, 10% 글리세롤로 구성된 완충용액에 혼탁한 후, 음파파쇄기를 이용하여 파쇄하였다.

5% 내지 15% 바람직하게는 8% 내지 12%의 글리세롤을 음파파쇄시 사용되는 완충용액에 첨가하여 주면 음파파쇄에 의한 트랜스아미나제의 실활을 감소시킬 수 있다. 상기 파쇄 용액을 12,000rpm에서 30분간 원심분리 후, 상층액을 회수하고 투석하여 서열번호 3의 DNA 서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 최종 사슬형 트랜스아미나제를 획득하였다(도 1).

<실시예 4> 반응의 최적 pH선별

반응이 가능한 효소의 pH를 알아내기 위하여 10 mM 2-keto-6-hydroxyhexanoic acid, 10 mM 글루탐산 및 세포추출물 5 micro-liter 구성된 500 micro-liter 반응용액을 37℃에서 15분간 반응시켰다. pH 6.0 에서 9.0범위에서 효소 활성을 나타냈으며, 최적 pH는 7.5였다(도 2).

<실시예 5> 반응의 시간에 따른 생성물의 양변화 측정 및 생성물의 광학순도 확인

10 mM 2-keto 6-hydroxyhexanoic acid, 10 mM 글루탐산 및 세포추출물 5 micro-liter, 100 mM phosphate 버퍼(pH 7.5)로 구성된 5ml 반응용액을 37℃에서 반응시키면서 생성물의 양을 측정하였다.

그 결과, 3시간 동안 약 40%의 수율로 L-6-hydroxynorleucine이 생겼음을 확인하였다(도 3). 또한, GITC (2,3,4-tetra-O-acetyl-β-d-glucopyranosyl isothiocyanate)을 유도체로 사용하여 HPLC로 분석한 결과 광학적으로 순수한 생성물이 생겼음을 확인하였다(도 4).

<실시예 6> 아미노제공기인 글루탐산과 아미노수용기인 2-keto-6-hydroxyhexanoic acid의 기질농도에 따른 반응속도 확인

아민수용기인 2-keto-6-hydroxyhexanoic acid의 농도를 10 mM로 고정하고 아민제공기인 글루탐산의 농도를 변화시키면서 세포추출물 5 ㎕ 첨가하고 1mL의 100mM 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에서 그 반응속도를 측정하였다. 글루탐산의 농도가 40mM일 때 최대의 반응속도를 얻을 수 있었다(도 5).

또한, 아미노제공기인 글루탐산의 농도를 10 mM로 고정하고 아민수용기인 2-keto-6-hydroxyhexanoic acid의 농도를 변화시키면서 세포추출물 5㎕ 첨가하고 1mL 의 100mM 포스페이트 버퍼(pH7.5)에서 37℃에서 그 반응속도를 측정한 결과 20 mM농도에서 최대 반응속도를 얻을 수 있었다(도 6).

<실시예 7> 아미노제공기인 글루탐산과 아미노수용기인 2-keto-6-hydroxyhexanoic acid의 최대 반응기질비 측정

아미노수용기의 농도를 10 mM로 고정하고 글루탐산의 농도를 각각 10, 20, 30 mM로 변경하며 실험한 결과 30 mM의 글루탐산을 사용했을 때 가장 높은 수율을 얻을 수 있었다. 즉, 아민수용기인 2-keto-6-hydroxyhexanoic acid와 아민제공기인 글루탐산의 농도비를 증가시킬수록 생성 수율이 증대됨을 확인하였다.

또한, 100 mM의 2-keto-6-hydroxyhexanoic acid와 300mM의 글루탐산으로 반응을 수행했을 경우 89mM의 L-6-hydroxynorleucine을 생산하였다(도 7).

도 1은 대장균에서 과발현된 사슬형 트랜스아미나제를 나타낸 것이다 [레인 1: 사슬형 트랜스아미나제가 과발현된 대장균 추출물, 레인 2: 과발현되지 않은 대장균 추출물, 레인 3: 단백질 마커(25, 35,50, 75, 100, 150, 225 KDa)에서 전기영동 결과].

도 2는 pH에 따른 트랜스아미나제의 활성을 측정한 결과이다.

도 3은 시간에 따른 L-6-hydroxynorleucine의 생산량을 측정한 결과이다.

도 4는 생산된 L-6-hydroxynorleucine의 광학순도를 분석한 결과이다.

도 5는 아민제공기의 농도변화에 따른 반응속도를 측정한 결과이다.

도 6은 아민수용기의 농도변화에 따른 반응속도를 측정한 결과이다.

도 7은 아미노제공기인 글루탐산과 아미노수용기인 2-keto 6-hydroxyhexanoic acid의 반응기질 비를 3 대 1로 한 L-6-hydroxynorleucine 생산 결과이다.

도 8은 사슬형 트랜스아미나제의 서열번호 3의 DNA 서열을 나타낸다.

도 9는 사슬형 트랜스아미나제의 서열번호 4의 단백질 서열을 나타낸다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Process for preparing L-6-hydroxynorleucine by using a branched-chain aminotransferase from microoorganism <130> DP090844KR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atcatggaat tcatgaccac gaagaaagct 30 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aaaaactcga gttattgatt aacttgatct aacca 35 <210> 3 <211> 930 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atgaccacga agaaagctga ttacatttgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60 gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg cactatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120 cgttgctacg actcgcacaa aggaccggtt gtattccgcc atcgtgagca tatgcagcgt 180 ctgcatgact ccgccaaaat ctatcgcttc ccggtttcgc agagcattga tgagctgatg 240 gaagcttgtc gtgacgtgat ccgcaaaaac aatctcacca gcgcctatat ccgtccgctg 300 atcttcgtcg gtgatgttgg catgggagta aacccgccag cgggatactc aaccgacgtg 360 attatcgctg ctttcccgtg gggagcgtat ctgggcgcag aagcgctgga gcaggggatc 420 gatgcgatgg tttcctcctg gaaccgcgca gcaccaaaca ccatcccgac ggcggcaaaa 480 gccggtggta actacctctc ttccctgctg gtgggtagcg aagcgcgccg ccacggttat 540 caggaaggta tcgcgctgga tgtgaacggt tatatctctg aaggcgcagg cgaaaacctg 600 tttgaagtga aagatggtgt gctgttcacc ccaccgttca cctcctccgc gctgccgggt 660 attacccgtg atgccatcat caaactggcg aaagagctgg gaattgaagt acgtgagcag 720 gtgctgtcgc gcgaatccct gtacctggcg gatgaagtgt ttatgtccgg tacggcggca 780 gaaatcacgc cagtgcgcag cgtagacggt attcaggttg gcgaaggccg ttgtggcccg 840 gttaccaaac gcattcagca agccttcttc ggcctcttca ctggcgaaac cgaagataaa 900 tggggctggt tagatcaagt taatcaataa 930 <210> 4 <211> 309 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Thr Thr Lys Lys Ala Asp Tyr Ile Trp Phe Asn Gly Glu Met Val 1 5 10 15 Arg Trp Glu Asp Ala Lys Val His Val Met Ser His Ala Leu His Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Val Phe Glu Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Ser His Lys Gly 35 40 45 Pro Val Val Phe Arg His Arg Glu His Met Gln Arg Leu His Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Ile Tyr Arg Phe Pro Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Leu Met 65 70 75 80 Glu Ala Cys Arg Asp Val Ile Arg Lys Asn Asn Leu Thr Ser Ala Tyr 85 90 95 Ile Arg Pro Leu Ile Phe Val Gly Asp Val Gly Met Gly Val Asn Pro 100 105 110 Pro Ala Gly Tyr Ser Thr Asp Val Ile Ile Ala Ala Phe Pro Trp Gly 115 120 125 Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu Gln Gly Ile Asp Ala Met Val 130 135 140 Ser Ser Trp Asn Arg Ala Ala Pro Asn Thr Ile Pro Thr Ala Ala Lys 145 150 155 160 Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Val Gly Ser Glu Ala Arg 165 170 175 Arg His Gly Tyr Gln Glu Gly Ile Ala Leu Asp Val Asn Gly Tyr Ile 180 185 190 Ser Glu Gly Ala Gly Glu Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Gly Val Leu 195 200 205 Phe Thr Pro Pro Phe Thr Ser Ser Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Asp 210 215 220 Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ile Glu Val Arg Glu Gln 225 230 235 240 Val Leu Ser Arg Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Asp Glu Val Phe Met Ser 245 250 255 Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Val Arg Ser Val Asp Gly Ile Gln 260 265 270 Val Gly Glu Gly Arg Cys Gly Pro Val Thr Lys Arg Ile Gln Gln Ala 275 280 285 Phe Phe Gly Leu Phe Thr Gly Glu Thr Glu Asp Lys Trp Gly Trp Leu 290 295 300 Asp Gln Val Asn Gln 305

Claims

1) 대장균 유래의 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 구성되는 사슬형 트랜스아미나제 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

3) 상기 형질전환체를 배양하여 사슬형 트랜스아미나제의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계; 및

4) 수득한 배양물을 2-keto 6-hydroxyhexanoic acid와 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는 L-6-hydroxynorleucine의 생산방법.

삭제

제 1 항에 있어서,

상기 형질전환체를 4 내지 40℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 L-6-hydroxynorleucine의 생산방법

제 1 항에 있어서,

상기 형질전환체의 현탁도가 0.1 내지 0.6이 되었을 때, IPTG를 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 L-6-hydroxynorleucine의 생산방법.

제 1 항에 있어서,

수득한 배양물을 pH 6.0 내지 9.0에서 2-keto 6-hydroxyhexanoic acid와 혼합하는 것을 특징으로 하는 L-6-hydroxynorleucine의 생산방법.

삭제