KR100496419B1

KR100496419B1 - 형질전환 한세눌라 폴리모파를 이용한 자이모모나스모빌리스 유래 레반슈크라제의 세포외 분비 생산방법

Info

Publication number: KR100496419B1
Application number: KR10-2002-0058771A
Authority: KR
Inventors: 이상기; 김철호; 강현아; 박범식; 김승환; 김인환; 장은경; 김성열
Original assignee: 주식회사 리얼바이오텍; 한국생명공학연구원
Priority date: 2002-09-27
Filing date: 2002-09-27
Publication date: 2005-06-21
Also published as: KR20040027051A

Abstract

본 발명은 형질전환 한세눌라 폴리모파(Hansenular polymorpha)를 이용한 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 유래 레반슈크라제(levansucrase)의 세포외 분비 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 메탄올 자화효모 한세눌라 폴리모파 유래의 프로모터에 레반슈크라제 유전자가 연결된 발현벡터를 제작하고, 이를 한세눌라 폴리모파에 도입한 형질전환 균주를 개발하여 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제를 효율적으로 분비, 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

형질전환 한세눌라 폴리모파를 이용한 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제의 세포외 분비 생산방법{A process for the extra-cellular secretory production of Zymomonas mobilis levansucrase using a transformed Hansenular polymorpha}

레반이 용도가 다양하고 시장잠재력이 큰 새로운 생물소재임에도 불구하고 지금까지 레반 생산에 관한 연구는 주로 미생물을 이용한 발효법이나 정제된 효소를 이용한 소규모적인 생산과 특성조사 위주로 이루어져 왔다. 즉, 1990년대 초까지는 자이모모나스 모빌리스[Beker M.J. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 24/25, 265 (1990)]나 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa)[Han Y.W., Adv. Appl. Microbiol. 35, 171(1990)]와 같은 미생물을 이용한 직접발효에 의한 레반 생산 연구가 주종을 이루었다. 그러나, 미생물을 이용한 발효법의 경우 레반 생합성에 관여하는 레반슈크라제의 발현량이 낮고, 반응생성물에 의한 생합성 저해로 인하여 레반 생성량은 이론수율의 30 ∼ 50% 정도에 지나지 않으며, 레반을 생산하는 대부분의 미생물에는 레반 가수분해 활성을 보이는 효소가 존재하여 발효법에 의한 합성 수율을 저하시키는 요인이 되고 있다. 따라서, 자이모모나스 모빌리스 레반슈크라제 및 그 유전자의 분리[Song KB et al., Biochim. Biophy. Acta 1173, 320(1993), 신규의 레반슈크라제 유전자: 대한민국 특허등록 제 176410호 (1998. 11. 13)]가 보고된 이후 최근에는 재조합 레반슈크라제를 이용한 효소공정개발에 관심이 모아지고 있으며 직접발효공정을 대체할 수 있는 방안으로 제기되고 있다. 하지만, 대장균을 숙주시스템으로 이용하여 재조합 레반슈크라제를 생산할 경우에는 효소 단백질이 세포내에 활성이 없는 불용성(inclusion bodies) 형태로 축적되어 이를 활성형으로 재생하기 위한 계면활성제(detergent) 사용[Sunitha et al., Protein Exp. Puri. 18, 388(2000)] 등 부가적인 공정에 따른 큰 어려움이 있다.

재조합 단백질 분비 생산 시스템으로 널리 사용되고 있는 여러 효모 중 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 더불어 한세눌라 폴리모파 발현시스템은 메탄올 자화 효모로서 값싼 원료물질인 메탄올을 에너지원과 탄소원으로 이용할 수 있어 전통 효모 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)에 비해 경제성이 높고, 메탄올 대사에 관련되는 메탄올 옥시다제(Methonol oxidase: MOX) 프로모터와 같이 비교적 조절이 용이하면서도 매우 강력한 프로모터를 갖고 있어 산업적으로 응용성이 매우 크다. 또한, 고농도 배양(100 ∼ 130 g DCW/L)이 용이하고, 한세눌라 폴리모파의 경우 형질 전환시 발현 목표유전자가 숙주의 염색체상으로 다중 도입되어 비선택 배지에서 도입된 발현벡터의 안정성이 뛰어난 장점이 있다 [Hollenberg C.P. and Gellissen G., Curr. Opin. Biotechnol. 8, 554(1997)]. 많은 경우 사카로마이세스 세레비제에서 성공적이지 못했던 재조합 단백질들이 이들 메탄올 자화효모 발현 시스템에서는 높은 수준으로 발현되곤 한다. 실례로 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 유래 레반슈크라제의 경우 사카로마이세스 세레비제에서는 분비 효율이 낮았으나 메탄올 자화효모인 피키아 시스템에서는 효율적으로 분비되었으며, 이를 이용하여 약 70% 수율로 프럭토-올리고사카라이드(1-kestose)를 생성할 수 있었다[Trujillo L.E. et al., Enzy. Microb. Technol. 28, 139(2001)]. 그러나, 지금까지 고초균 유래 레반슈크라제는 전구체(precursor) 형태로 효모에서 발현되었으나 분비는 되지 않았으며[Scotti P.A. et al., FEBS Lett. 10, 29(1994)], 자이모모나스 유래 레반슈크라제의 경우에도 모균주의 변이주에서 분비 발현율이 증가된 보고는 있지만[Ananthalakshmy V.K and Gunasekaran P., Enzyme Micrbiol. Technol. 25, 109 (1999)], 비교적 분비 발현율이 높은 대장균, 고초균 또는 효모에서는 발현 분비가 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 메탄올 자화효모 한세눌라 폴리모파를 숙주 균주로 사용하여 재조합 레반슈크라제의 분비생산 효율이 우수한 발현 벡터를 개발하고, 상기 벡터가 숙주 염색체에 삽입된 형질전환체를 제작하고 이로부터 고효율로 재조합 레반슈크라제를 생산하는 균주를 선별하여 유가배양으로 레반슈크라제를 생산하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 한세눌라 폴리모파 유래의 메탄올로 발현 유도되어지는 MOX 프로모터를 사용하고 이눌리나제 분비 시그날 서열에 연결된 레반슈크라제 유전자(levU)를 이용하여 레반슈크라제 발현벡터를 제작하고, 이를 효모 한세눌라 폴리모파에 도입하여 선택적 영양배지에서 레반슈크라제를 고효율로 발현하는 균주를 선별하고 이를 유가배양함으로써 레반슈크라제를 세포외 분비, 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 유래 레반슈크라제 유전자(levU)와 이눌리나제 분비 시그날 서열을 연결하고 이를 pDLMOX벡터에 삽입하여 제작된 발현벡터 pDLMOX-Lev 및 이를 효모 한세눌라 폴리모파(Hansenular polymorpha)에 도입하여 형질전환된 한세눌라 폴리모파 A16/pDLMOX-lev[KCTC 10284BP]을 그 특징으로 한다.

또한, 상기 형질전환된 한세눌라 폴리모파를 메탄올을 이용하여 유가배양하여 레반슈크라제를 발현, 분비하여 생산하는 방법을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 한세눌라 폴리모파 유래의 메탄올 유도 프로모터인 MOX 프로모터와 자이모모나스 모빌리스 유래의 레반슈크라제(levU) 유전자에 효모 클루이베로마이세스 마시아너스(Kluyveromyces marxianus)의 이눌리나제 유래의 분비 시그날을 조합하여 분비 발현벡터를 제작하고, 이를 한세눌라 폴리모파에 도입한 후 선택적 루이신 아미노산 영양배지에서 배양하여 형질 전환된 레반슈크라제 발현주를 선별하고 발현 유도원 및 탄소원으로 메탄올을 사용하는 유가배양을 통하여 효율적으로 레반슈크라제의 분비 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은 메탄올 자화효모 한세눌라 폴리모파에서의 레반슈크라제 발현 벡터를 제작하는 과정과 상기의 발현 벡터를 함유한 메탄올 자화 효모 형질전환체의 선별, 이로부터 유가 배양을 통하여 레반슈크라제를 분비 생산하는 공정으로 구성된다.

특히, 선행기술과는 달리 본 발명에서는 기존에 문제시되어 왔던 레반슈크라제 효소생산기술에서 균체내 발현시 불용성 효소의 생성 및 그에 따른 공정상 비용이 증대되는 점을 극복하기 위하여 레반슈크라제를 한세눌라 폴리모파에 발현함으로써 균체외로 활성형 재조합 레반슈크라제가 발현, 분비되는 효과를 가지는 발현벡터를 제작하는데 그 특징이 있다.

자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 유래 레반슈크라제 유전자(levU)와 효모 유래 이눌리나제 분비 시그날 서열을 연결하고 이를 pDLMOX벡터에 삽입하여 제작된 발현벡터 pDLMOX-lev라 명명하고. 이를 메탄올 자화효모 한세눌라 폴리모파에 도입하여 형질전환된 균주인 한세룰라 폴리모파 A16 pDLMOX-lev균주를 2002년 6월 18일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였으며, 수탁번호는 KCTC 10284BP이다.

또한, 상기 선별된 메탄올 자화 효모 형질전환체로부터 메탄올을 탄소원 및 발현유도원으로 사용하여 유가배양법으로 배양하는데 있어 용존산소량에 따른 분비 효율 제한성을 극복하기 위하여 용존산소량을 저가의 탄소원인 메탄올로 정확히 조절함으로써 활성형 재조합 레반슈크라제를 분비 생산시 효율적인 공정을 개발하였다.

이렇게 생산된 레반슈크라제의 레반 형성능을 분석한 결과, 전형적으로 레반 형성시에 나타나는 탁도가 증가하는 현상을 나타났으며, HPLC 분석에서도 대조구로 사용한 정제된 형태의 레반슈크라제와 동일한 분자량을 갖는 레반이 검출되었다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 레반슈크라제 발현벡터 제작 및 형질 전환주 선별

1) 레반슈크라제 발현벡터 제작

자이모모나스 모빌리스 레반슈크라제는 분비 시그날이 없는 상태로 분비 [Beker M.J. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 24/25, 265 (1990)]되므로 일차적으로 효모 유래의 분비시그날을 사용하지 않고 레반슈크라제 유전자(levU)[pZL8 (Song KB et al., Biochim. Biophy. Acta 1173, 320(1993))에서 PCR로 증폭하여 사용]를 직접 한세눌라 폴리모파 발현벡터 pDLMOX에 삽입하여 발현시킨 경우 효소측정법에 의해서 약 4.0 ∼ 16.4 U/㎖ 정도의 효소활성을 나타내었으나 SDS-폴리아크릴 아마이드 전기영동 젤상에서는 그 발현정도를 확인할 수 없을 정도로 낮았다. 따라서, 효모 클루이베로마이세스 마시아너스 (Kluyveromyces marxianus) 유래의 이눌리나제 분비 시그날 서열이 접합된 상태로 levU를 발현하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다

먼저 이눌리나제 분비 시그날 서열[서열번호 1: ATG AAG TTA GCA TAC TCC CTC TTG CTT CCA TTG GCA GGA GTC AGT GCT TCA GTT]과 levU 유전자[GenBank Accession No. AF081588, 신규의 레반슈크라제 유전자: 대한민국 특허등록 제 176410호(1998. 11. 13)]를 정확한 구조(in-frame)로 합성 및 연결하기 위하여, pfu 중합효소[Stratagene, La Jolla, CA, USA]를 이용하였으며, 2 세트의 PCR 프라이머(INU 5'-프라이머; CCC AAG CTT AAA ATG AAG TTA GCA TAC[서열번호 2], INU 3'-프라이머; CCC ATT AAT AAC TGA AGC ACT GAC[서열번호 3], LEV 5'-프라이머; CCC ATT AAT TAC AAG AGA ATG TTG AAT[서열번호 4], LEV 3'-프라이머; CCC AAG CTT TTA TTT ATT CAA TAA AG[서열번호 5])를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응용액(20 ㎕)은 pfu 중합효소(2.5 U), pfu 중합효소 버퍼, dNTP 혼합물(1 mM each), 1 ㎕ 씩의 상기 두 가지 프라이머(각 100 pmol), 주형 플라스미드 DNA(template plasmid DNA) 500 ng와 나머지를 멸균 증류수로 보충한 후 유전자 증폭기(thermal cycler)[Perkin Elmer]로 35 회 반복 수행하였다(94 ℃-30초, 48 ℃-30초, 72 ℃-1분). levU DNA 절편 5'말단에 KEX2 엔도펩티다제(endopeptidase)에 의해 인식되어 정확한 프로세싱(processing)이 일어날 수 있도록 Lys-Arg에 해당되는 DNA 서열을 연결시키고 5'에 AseI, 3'에 HindIII의 인식부위를 도입한 후, levU 5' 말단에 이눌리나제 분비 시그날 서열이 AseI 제한효소 인식부위를 통하여 접합하였다. 합성된 올리고머들의 어닐링(annealing)과 접합(ligation)이 정확히 이루어졌는지와 PCR을 이용하여 제조된 이눌리나제 분비 시그날 서열과 levU 유전자가 정확한 구조(in-frame)로 연결되었는지 여부를 확인하기 위하여 각각의 DAN 절편을 pBluescript Ⅱ KS(+) 플라즈미드[Stratagene, La Jolla, CA, USA]에 삽입(subcloning)하여 유전자 염기서열을 확인하였다. 메탄올 유도 프로모터(methanol inducible promoter)인 MOX 프로모터(P_MOX), LEU2 유전자, HARS(Hansenular Autonomous Replicating Sequence)와 미지의 터미네이터(unknown terminator)를 함유하는 pDLMOX[Kang HA et al., Yeast 14, 371(1998)]을 사용하였다. 벡터 pDLMOX-lev는 pDLMOX를 HindⅢ로 절단하여 얻은 7 kb 벡터 절편에 상기에서 얻어진 레반슈크라제 유전자(levU)와 분비 시그날이 연결된 1.4 kb를 연결하여 완성하였다[도 1].

2) 메탄올 자화 효모의 형질전환

한세눌라 폴리모파를 YPD에 접종한 후 37 ℃에서 배양하여 얻은 균체를 TE-Li 아세테이트[100 mM Tric-Cl, pH 7.5, 10 mM EDTA, 1 M Lithium acetate, pH 7.5] 0.5 ㎖로 씻은 다음, 다시 TE-Li 아세테이트 0.5 ㎖에 현탁하고 30 ℃에서 30분간 배양하였다. 현탁된 세포 100 ㎕와 10 ㎕(5 ㎍)의 플라즈미드 DNA와 10 ㎕(75 ㎍)의 캐리어 DNA(salmon sperm DNA)를 0.6 ㎖ PEG 4000(40% in TE/Li acetate)에 혼합한 다음 30 ℃에서 30분간 배양하였다. 70 ㎕의 DMSO를 첨가한 후에 42 ℃에서 15분간 열처리(heat-shock)를 행한 후 얼음에서 식히고(1분), 원심 분리하여 얻어진 세포침전물을 1 ㎖ 증류수로 세척 후 다시 150 ㎕의 증류수에 현탁한 다음 선택배지에 도말하여 37 ℃에서 5일간 배양하였다.

3) 레반슈크라제 발현 균주 선별

발현 벡터 pDLMOX-Lev를 한세눌라 폴리모파 DL-1-L[Sohn et al., J. Bacteriol 178, 4420(1996)]과 A16[Veale et al., Yeast 8, 361(1992)]에 형질전환시켜 5일 후 선택배지 상에 나타난 콜로니(colony)들 중에서 선별된 균주들을 배양하였다. 한편 형질 전환시킨 후 도말하여 선택배지에서 나타난 콜로니들은 작은 콜로니와 큰 콜로니로 나누어 졌다. 이들을 취합하여 선택배지 상에서 계대배양하여 플라즈미드의 크로모조말(chromosomal) DNA로의 융합(integration) 정도를 증가시켰다. 형질전환 효율을 보면 한세눌라 폴리모파 DL-1-L의 경우 한세눌라 폴리모파 A16보다 형질전환율이 월등히 높았다. 도입된 플라즈미드가 안정화되어 배지상에서 일정한 크기의 콜로니 형태를 가지는 형질전환 균주들을 일차적으로 선별한 후 각 균주들을 한세눌라 폴리모파 DL-1-L 유래 형질전환 균주 12개와 한세눌라 폴리모파 A16 유래 형질전환 균주 13개를 선별하였다. 선별된 25개의 한세눌라 폴리모파 형질전환 균주들을 초기에 2% 메탄올을 함유한 YPD 배지에서 배양하였으며, 균체의 증식 정도는 한세눌라 폴리모파 A16-levU의 경우 한세눌라 폴리모파 DL-1-L-levU보다 균체증식속도가 훨씬 높았다[표 1]. 발현유도배지에서 발현시킨 각 형질전환 균주들의 레반슈크라제 활성은 글루코스 옥시다제 효소활성 측정법을 통하여 레반슈크라제 생성 균주를 선별하였다. 균체내에서 발현된 레반슈크라제는 24 시간 배양시에는 그 활성이 검출되지 않았으나, 36 시간째부터 효소 활성이 나타났으며 48 시간에 이르러 최고 24.3 U/㎖로 나타났다.

콜로니	번호	생장*(OD600)	효소활성(U/㎖)
DL-1-L	LD1	23.9	1.0
	LD2	34.9	0.9
	LD3	34.4	1.1
	LD4	35.1	0.8
	MD2	35.4	0.7
	MD6	33.6	0.8
	MD12	28.8	1.8
	SD2	32.1	20
	SD6	33.9	0.9
	SD8	22.7	-
	SD9	37.2	0.5
	SD10	26.1	0.6
A16	A1	41.8	0.6
	A2	42.0	-
	A3	32.4	-
	A5	45.2	11.5
	A6	46.0	24.3
	A7	39.6	0.3
	A8	38.3	-
	A10	40.8	3.2
	A11	39.6	-
	A12	38.3	0.6
	A13	36.2	1.0
	A14	43.4	2.9
	A15	35.6	4.5
*형질전환 세포주들은 48시간 배양한 후 수확하여 세포파쇄액의 레반슈크라제 효소 활성을 분석하였다.

4) 레반슈크라제의 발현 및 활성 분석

레반슈크라제를 발현하는 한세눌라 폴리모파 A16-levU의 형질전환 균주들 중에서 상대적으로 효소활성이 높은 A5, A6, A10을 선별하였으며, 한세눌라 폴리모파 DL-1-L-levU에서 나타난 형질전환 균주들은 효소활성 측정 결과 그 활성이 거의 검출되지 않았으나 일차 선별과정인 웨스턴 블럿 분석에서 레반슈크라제 폴리 클로날 항체와 반응성을 보인 SD2, MD2 및 MD12를 선발하였다. 각기 선별된 균주들을 1% 메탄올이 함유된 YPD(2% 글루코스)와 YPG(2% 글리세롤)를 사용하여 37 ℃에서 48 시간동안 배양하였다. 레반슈크라제 효소 단백질의 발현정도를 확인하기 위하여 대조구로 모균주인 한세눌라 폴리모파 A16과 DL-1-L을 사용하였으며, 발현된 단백질의 분자량 확인은 정제된 레반슈크라제를 사용하여 비교하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 A5와 A6 형질전환 균주들은 SDS-폴리아크릴 아마이드 전기영동상에서 약 52 kDa에 해당되는 새로운 단백질을 발현하였는데, 이는 레반슈크라제 폴리 클로날 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석을 통하여 레반슈크라제가 발현된 것으로 확인되었다. 선별된 균주들은 글루코스를 탄소원으로 사용하여 배양하였을 경우 글리세롤을 탄소원으로 사용한 것보다 효소활성이 약 2배정도 높았다. 특히 조효소액의 단백질 양을 단백질 정량 키트(Bio-rad protein assay kit)로 정량하여 동일한 양의 단백질을 사용하여 효소활성을 측정하였을 때, A5는 글루코스를 함유한 배지에서 67.6 U/㎖의 활성이 검출되었으며 글리세롤 함유 배지에서는 35.2 U/㎖을 나타내었다. 이러한 발현양상과 효소활성 경향은 YPD와 YPG 배지에 2% 메탄올을 사용하였을 때에도 비슷한 양상을 나타내었다.

5) 웨스턴 블럿을 통한 레반슈크라제 발현의 면역학적 분석

레반슈크라제의 발현을 확인하기 위하여 형질전환 한세눌라 폴리모파를 배양하여 얻은 균체내 및 균체외 단백질을 12% SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동을 행하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 균체외 단백질 시료는 배양 상등액 10 ∼ 20 ㎕ 또는 0.5 ㎖에 20% TCA(trichloroacetic acid in acetone)를 동량 첨가한 다음 -20 ℃에서 2시간동안 방치하여 얻은 시료를 10000 rpm으로 10 분간 원심분리한 후 침전물에 남아 있는 TCA를 아세톤으로 씻어내고 이를 실온에서 건조시켜 준비하였으며 또는 발효상등액을 직접 균체외 단백질 시료로 그리고, 세포파쇄 후 얻어진 조효소액을 균체내 단백질시료로 하여 각각 램리[Laemmli, Nature 227, 680(1970)]의 방법에 따라 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동을 한 후 Towbin[Towbin, Proc. Natl. Acad. USA, 76, 4350(1979)] 방법으로 나일론 셀루로즈 막에 전이한 후 레반슈크라제에 대해 만들어진 항체[Kwak J.W., et al., Biotecnol. Techniq. 10, 127(1996)]로 반응시켰다. 알칼린 포스파타제가 붙어 있는 항토끼 Ig에 대한 항체[Sigma]로 부차적인 반응을 진행한 후 포스파타제에 의한 발색반응으로 분석하였다.

플라스크 배양에서는 한세눌라 폴리모파 DL-1-L-levU들의 경우에는 A16-levU들과는 달리 효소활성측정, SDS-폴리아크릴 아마이드 전기영동과 웨스턴 분석에서도 그 균체내 발현정도가 확인되지 않았다. 하지만, 1% 메탄올을 유도배지에 사용하였을 때, DL-1-L-levU의 경우 웨스턴 블럿에서 소량의 분비된 레반슈크라제가 희미한 밴드형태로 검출되었다. 또한, 2% 메탄올을 YPD에서 유도원으로 사용하여 배양액을 TCA로 침전하였을 경우에도 웨스턴 블럿에서 그 발현정도를 감지할 수 있었다[도 3]. 한편 선발된 한세눌라 폴리모파 A16-levU 형질전환 균주에서는 균체내에서의 발현과는 달리 균체외의 경우에서는 그 발현정도가 플라스크 배양에서는 매우 미약하였다. 한세눌라 폴리모파 DL-1-L-levU 형질전환체에서 선발된 균주는 그 발현정도가 미약하거나 불활성화되어 효소활성 측정법으로 측정하여도 그 효소활성을 나타내지 못한 것으로 사료된다. 따라서, 추후 한세눌라 폴리모파 DL-1-L 균주의 경우 융합(integrative) 발현 벡터의 복제 수를 증가시킬 경우 그 분비 발현정도가 증가할 것으로 사료된다.

6) pDLMOX-Lev의 발현 수 및 부위 추정

숙주로 융합(integration)된 pDLMOX-Lev의 복제 수를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석에서 시그날이 검출된 한세눌라 폴리모파 A16-levU과 DL-1-L-levU 각각 10균주의 전체 DNA를 분리하기 위하여 형질전환 균주를 YPD 배지에 접종하여 37 ℃에서 하룻밤동안 배양한 후 12000 rpm에서 2분 동안 원심 분리하여 수확하였다. 침전된 세포를 30 ㎕의 STES(0.5 M NaCl, 0.2 M Tris-Cl, pH 7.6, 10 mM EDTA, 1% SDS)로 세척한 후, STES에 현탁된 세포 30 ㎕을 취하여 1.5 ㎖ 튜브에 옮기고 0.4 mm 글라스 비드(glass bead) 100 ㎕을 튜브에 첨가하여 세포파쇄기(multiple microtube mixer, TOMY)로 15분 동안 파쇄하였다. 이 튜브에 200 ㎕ TE(pH 8.0)와 동량의 페놀/클로로포름을 넣고 현탁한 후(2분간 vortex) 5분 동안 원심분리 하였다. 분리된 수층을 3 M 소디움 아세테이트(pH 5.2, 1/100 volume)와 1 ㎖의 에탄올로 처리한 후 원심분리하여 침전물을 얻고 이를 다시 70% 에탄올로 세척한 다음 건조하여 RNase로 처리된 멸균수로 현탁하여 용해시킨 것을 전체 한세눌라 폴리모파 DNA로 사용하였다.

분리된 한세눌라 폴리모파 전체 DNA를 제한효소(ClaI, EcoRI)로 처리하고 이를 0.9% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 전기영동한 다음 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH로 15분씩 두 번 처리하여 변성(denaturation)시키고 1.0 M Tris(pH 7.4), 1.5 M NaCl로 30분 동안 중화하였다. 이를 블로팅(blotting) 완충용액인 20 ×SSC를 사용하여 나이트로셀룰로스 막(nytrocellulose membrane)으로 하룻밤동안 전이하였다. pDLMOX를 XhoI/BamHI으로 제한효소 처리하여 LEU2 단편과 HindIII/BamHI으로 처리하여 P_MOX 단편(fragment)을 얻었으며, 이를 DIG 레이블링 키트(labeling kit)[Boehringer manheim]을 이용하여 설명서에 따라 DIG로 표지하였다. 전이된 DNA를 가지고 있는 나이트로셀룰로스 막은 프리하이브리다이제이션(prehybridization) 용액(5 ×SSC, blocking reagent 5%, N-lauroylsarcosine Na-salt 0.1%, SDS 0.02%, formamide 50%)으로 42 ℃에서 2시간 동안 반응시키고 프리하이브리다이제이션 용액을 제거한 후 프로브와 하이브리다이제이션(hybridization) 용액으로 12 ∼ 24시간동안 하이브리다이제이션하였다. 다음으로 나이트로셀룰로스 막을 2 × SSC, SDS 0.1%로 5분간 두 번 실온에서 세척하고 0.1 ×SSC, SDS 0.1%로 두 번 10분씩 실온에서 세척하였다. 이를 Tris-HCl 100 mmol, NaCl 150 mmol, pH 7.5로 1분간 처리하고 항-콘주게이트 (antibody-conjugate)로 30분간 반응시킨 후 다시 세척하여 NBT와 BCIP(Bio-rad)로 37 ℃에서 15분간 또는 상온에서 발색시켰다.

도 4에서 나타난 바와 같이 대조구의 P_MOX 단편은 A16-levU과 DL-1-L-levU 모두 2.0kb 근처에 나타나 있고, LEU2 단편은 3.4kb 근처에 나타났다. 이는 pDLMOX-Lev가 숙주 염색체의 LEU2나 P_MOX 부위로 삽입되지 않고 다른 지역, 아마도 텔로미어(telomere) 유래의 HARS 존재로 인해서 숙주 염색체의 텔로미어 부근으로 융합(integration)된 것으로 사료된다[Sohn JH. et al., J. Bacteriol. 181, 1005 (1999)]. 한편 병렬융합(tandem integration) 양상을 보이는 클론(clone) A5와 A6에는 복제 수 약 5 ∼ 6개 이상의 발현벡터가 삽입된 것으로 사료되며, 또한 같은 양상을 보이는 A9, A11, A12, A15은 같은 부위로 2 ∼ 3 개정도 삽입된 것으로 보인다. A10은 이들과 다른 부위로의 다중 융합(multiple integration) 양상을 보였으며, A3은 단일복제융합(single copy integration) 양상을 보였다. 대체적으로 A16 형질전환체에 삽입된 벡터 수가 DL-1-L 균주보다 높게 나타났으며, 삽입된 벡터수와 발현량과의 상관관계를 보였다.

상기의 방법으로 제조된 재조합 발현 벡터가 융합(integration)된 형질전환주 중 분비 발현율이 가장 우수한 한세룰라 폴리모파 A16 유래의 A5 pDLMOX-lev 형질전환주를 한세룰라 폴리모파 A16 pDLMOX-lev균주로 2002년 6월 18일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 10284BP).

실시예 2 : 한세눌라 폴리모파 A16 유래 형질 전환주의 유가배양

메탄올 자화효모 한세눌라 폴리모파 발현 시스템을 이용하여 레반 생합성 효소를 발현 및 분비시키고자 자이모모나스 모빌리스 유래의 레반슈크라제 유전자를 메탄올 옥시다제 프로모터(P_MOX)와 분비인자인 이눌리나제 분비 시그널 서열에 연결시켰을 때, 한세눌라 폴리모파 A16유래의 A5 pDLMOX-lev의 경우 발현벡터 pDLMOX-Lev가 6 카피 정도로 염색체로 삽입된 형질전환체에서 균체내 발현 레반슈크라제 효소활성이 가장 높게 나타났다. 발현벡터의 융합(integration) 양상은 다중병렬도입 양상을 보였고, 복제수가 높을 수록 레반슈크라제의 균체내 발현율이 높았다. 그러나, 플라스크 배양에서는 한세눌라 폴리모파 A16 형질전환균주의 경우 균체내 발현율은 높았으나 분비되지 못하는 경향을 보인 반면 한세눌라 폴리모파 DL-1-L 형질전환체들의 경우에는 균체내 발현양은 극히 적으나 단일 밴드 (band)와 동일한 분자량을 갖는 균체외 레반슈크라제를 웨스턴 블럿 분석으로 확인할 수 있어 두 균주간의 분비효율이 상당히 다름을 보여주고 있다.

하지만, 두 균주의 분비효율은 5L 스케일로 유가배양을 하였을 때 다른 양상을 보였는데 플라스크 배양에서와는 달리 한세눌라 폴리모파 A16 유래의 형질전환 선별주 한세눌라 폴리모파 A5 pDLMOX-lev는 레반슈크라제가 메탄올에 의하여 유도 분비되는 반면[도 5], 일반적으로 분비효율이 높게 알려진 한세눌라 폴리모파 DL-1-L유래의 형질 전환주에서는 균체내에서는 레반슈크라제가 발현되었지만 메탄올에 의한 분비발현은 되지 않았다. 메탄올을 유도원 및 탄소원으로 사용한 유가배양시 한세눌라 폴리모파 A5 pDLMOX-lev는 세포성장기 말기인 약 90 g/L 일 때 레반슈크라제가 최대로 분비되는 것이 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 상에서 확인되었다. 레반슈크라제 단백질의 균체외 발현량은 그 이후 감소하는 경향을 보였으나 서당 가수분해정도는 12 U/㎖ 정도로 세포 정지기인 110 g/L일 때 최대로 나타났다.

실시예 3: 한세눌라 폴리모파에서 분비 생산된 재조합 단백질의 분석

1) 레반 형성능 분석

형질전환 한세눌라 폴리모파를 초기에 메탄올 2%가 첨가된 배지에서 24, 36, 48시간 배양한 다음 원심분리하여 균체내 및 균체외 단백질을 각기 수확하였다. 레반슈크라제의 효소 활성측정 및 분석은 글루코스 어세이 키트(glucose assay kit, Sigma)를 사용하여 시행하였다. 조효소액(10 ㎕)에 50 mM 소디움 아세테이트(pH 6.0)에 용해시킨 1% 자당용액 990 ㎕를 넣어 37 ℃에서 30분간 효소반응 시킨 후 반응액 중 유리된 환원당의 양을 정량하였다. 효소활성은 1분간에 1 ㎛ol의 포도당을 생성하는 효소활성을 1 unit(U)로 정하였다. 레반(levan) 형성활성은 조효소액 100 ㎕에 50 mM 소디움 아세테이트(pH 6.0) 완충액에 용해시킨 10% 자당용액 900 ㎕를 넣어 4 ℃에서 10 ∼ 12시간동안 효소 반응시킨 후 반응액 중 생성된 레반의 양을 RI 검출기[Waters 2410]가 부착된 HPLC[Waters]로 측정하여 결정하였다. 이때 사용된 표준 레반슈크라제 시료는 pRZ-his 플라즈미드를 함유한 대장균을 배양하여 얻은 히스티딘 태그된(his-tagged) 레반슈크라제를 Ni-NTA 레진[Qiagene]을 사용하여 분리 정제한 것이었다.

선별된 형질전환 균주 중 효소활성을 보이는 한세눌라 폴리모파 A5 pDLMOX-lev로부터 얻은 조효소액을 사용하여 10% 자당용액에서 레반 형성율을 측정하였는데 전형적으로 레반 형성시에 나타나는 탁도가 증가하는 현상을 나타냈으며, HPLC 분석에서도 대조구로 사용한 정제된 형태의 레반슈크라제와 동일한 분자량을 갖는 레반이 검출되는 것으로 나타났다[도 6].

2) 재조합 레반슈크라제 단백질의 당쇄부가여부 분석

상기 도 5에서 제시된 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동상에서 한세눌라 폴리모파 A5 pDLMOX-levU에서 발현된 레반슈크라제는 대조구보다 약간 높은 분자량을 가진 것으로 나타났다. 자이모모나스 모빌리스 레반슈크라제의 아미노산 서열에서 3개의 당쇄부가 부위(glycosylation site)가 추정되므로 이를 Endo H로 처리하여 분자량의 변화를 8% SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동상에서 살펴보았으나 그 변화를 인지하지 못하였다[도 7]. 이는 한세눌라 폴리모파에서 발현된 레반슈크라제의 분자량 증가는 당쇄부가에 의한 것이 아님을 시사한다. 따라서, 발현된 재조합 레반슈크라제 분자량이 대조구보다 약 2 kD정도 증가된 것은 균체내에서 시그날 펩타이드(signal pepetide)로 사용한 이눌리나제 분비 시그날이 프로세싱(processing)되지 않은 것에 의한 것이다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 신규 레반슈크라제 발현벡터로 형질전환된 메탄올 자화 효모 한세눌라 폴리모파 균주를 사용한 활성형 재조합 레반슈크라제 생산기술에 관한 것으로서, 메탄올을 기질로 사용한 유가배양으로 재조합 레반슈크라제를 고효율로 발현 분비 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다. 따라서, 형질전환효모를 사용하여 유용한 생물소재인 레반을 생산하기 위한 공정에 매우 중요한 발명이다.

도 1은 레반슈크라제 발현 벡터 pDLMOX-Lev에 대한 도식이다.

도 2는 형질전환 한세눌라 폴리모파의 세포파쇄액을 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동(위) 및 웨스턴 블럿(아래)한 결과이다.

도 3은 형질전환 한세눌라 폴리모파의 배양 상등액을 농축하여 웨스턴 블럿(좌) 및 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동(우)한 결과이다.

도 4는 형질전환 한세눌라 폴리모파의 서던 블럿한 결과이다.

도 5는 형질전환주 한세눌라 폴리모파 A5 pDLMOX-lev를 유가배양하여 발현된 레반슈크라제 효소의 활성 및 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동 결과이다.

도 6은 유가배양을 통해 수확한 재조합 단백질의 레반 형성능을 HPLC로 분석한 결과이다.

도 7은 유가배양을 통해 분비된 재조합 단백질의 당쇄부가 여부를 웨스턴 블럿(좌) 및 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동(우)으로 발색 확인한 것이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Real BioTech Co., Ltd <120> A process for the extra-cellular secretory production of Zymomonas mobilis levansucrase using a transformed Hansenular polymorpha <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 54 <212> DNA <213> Kluyveromyces marxianus <400> 1 atgaagttag catactccct cttgcttcca ttggcaggag tcagtgcttc agtt 54 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INULINASE SIGNAL SEQUENCE 5'-PRIMER <400> 2 cccaagctta aaatgaagtt agcatac 27 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INULINASE SIGNAL SEQUENCE 3'-PRIMER <400> 3 cccattaata actgaagcac tgac 24 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> levU 5'-PRIMER <400> 4 cccattaatt acaagagaat gttgaat 27 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> levU 3'-PRIMER <400> 5 cccaagcttt tatttattca ataaag 26

Claims

자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 유래 레반슈크라제 유전자(levU)와 이눌리나제 분비 시그날 서열을 연결하고 이를 pDLMOX 벡터에 삽입하여 제작된, 도 1의 개열지도로 표시되는 레반슈크라제 발현벡터 pDLMOX-Lev.
청구항 1의 발현벡터 pDLMOX-Lev을 효모 한세눌라 폴리모파(Hansenular polymorpha)에 도입하여 형질전환된 한세눌라 폴리모파 A16/pDLMOX-lev[KCTC 10284BP].
청구항 2의 형질전환된 한세눌라 폴리모파 A16/pDLMOX-lev[KCTC 10284BP]를 메탄올을 이용하여 유가배양하여 레반슈크라제를 발현, 분비하는 것을 특징으로 하는 레반슈크라제의 생산방법.