CN110358751B - 一种重组脂肪酶突变体、编码基因、重组工程菌及应用 - Google Patents

一种重组脂肪酶突变体、编码基因、重组工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组脂肪酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用，所述突变体是丝孢堆黑粉菌脂肪酶(Sporisoriumreilianum SRZ2lipase，SRL)出发经过突变得到的。本发明中，脂肪酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第145位、194位进行单突变或者组合突变获得的。该突变体相比于野生型酶在转化上述反应时催化活力和底物耐受性大大提高，反应进程耗时明显缩短。相比于化学法制备(S,S)‑2,8‑二氮杂双环[4,3,0]壬烷，本发明提供的技术所得产品立体选择性高，反应条件更加温和，对设备要求低，降低了反应成本，且对环境友好。

Description

一种重组脂肪酶突变体、编码基因、重组工程菌及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种重组脂肪酶突变体及其编码基因，以及含有该突变体编码基因的重组载体、含有该突变体编码基因的重组基因工程菌以及丝孢堆黑粉菌脂肪酶突变体在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用。
(二)背景技术
脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)，系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶(triacylglycerol acylhydrolase)，能够催化水解、酯化、酯交换、醇解、酸解、氨解等一系列反应的进行，是生物技术中最受认可的一类生物催化剂。脂肪酶的多功能性使得其非常适用于各种行业，如食品，制药，洗涤剂，皮革，纺织品，化妆品和纸张。脂肪酶广泛存在于微生物、植物及动物等生物体内，其中，微生物脂肪酶具有种类多、活性高、稳定性较好，选择性和底物特异性优良，反应pH和温度范围广泛等特性，在工业生产中有着重要应用。
(S,S)-2,8-二氮杂双环[4,3,0]壬烷是合成第四代喹诺酮类抗菌药物莫西沙星的重要手性中间体，后者是由德国拜耳公司研制，主要用于治疗治疗急性窦腺炎、慢性支气管炎、社区获得性肺炎，以及皮肤和软组织感染等疾病的广谱抗生素。对于(S,S)-2,8-二氮杂双环[4,3,0]壬烷的制备，传统的合成方法主要有化学拆分法、不对称合成法和手性源法。化学拆分法是目前主要的应用方法，具体是以2,3-二甲酸吡啶为起始原料，经脱水，氨解，环合，还原，化学拆分等步骤获得目的产物。但是该方法存在着拆分收率低，能耗大，污染严重等问题，已不符合当代绿色化学的发展趋势(EP 0550903 A1，US 20080221329 A1)。近年来，利用酶法代替化学法改善反应条件，降低反应成本，提高产物的选择性成为关注的重点。生物拆分法不仅具有高度的化学、区域和立体选择性，并且反应条件温和，对环境友好，有效弥补了化学方法的不足。利用脂肪酶为催化剂，可高效拆分外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯获得光学纯的(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯，并进而用于合成(S,S)-2,8-二氮杂双环[4,3,0]壬烷。相比于化学拆分法，脂肪酶拆分法将拆分步骤提前，原子经济性强，立体选择高，避免了化学拆分剂的使用。目前关于脂肪酶法拆分生产(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯的报道较少，专利US 8680276 B2报道了采用40g/L的固定化南极假丝酵母脂肪酶B在140h内将80g/L的外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯拆分完全。Nitin W.，Fadnavis等人用40g/L的南极假丝酵母脂肪酶B酶液(Addzyme CALB(5000TBU))取代固定化南极假丝酵母脂肪酶B，在16h内将80g/L的外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯拆分完全(ORGANIC PROCESS RESEARCH&DEVELOPMENT卷:19期:1页:296-301)。
然而，目前报道的脂肪酶法拆分生产(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯技术主要存在的问题是拆分过程中底物浓度低，脂肪酶催化活力低，催化剂使用量大，需长时间反应等，尚不能达到规模化工业生产的要求。
(三)发明内容
本发明目的是提供丝孢堆黑粉菌脂肪酶(SRL)突变体、编码基因、含有该突变体基因的重组载体、含有该突变体基因的重组基因工程菌，以及丝孢堆黑粉菌脂肪酶突变体在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用。该突变体对外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯具有较高的底物耐受性、和较高的催化活力，可有效解决目前面临的脂肪酶催化活力低，拆分反应底物浓度低，反应时间长等问题，极大的提高了催化效率，减少了工业生产周期，降低生产成本。
本发明采用的技术方案是：
一种重组脂肪酶突变体，由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸(其编码基因如SEQID NO.1所示)经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或多个：(1)第145位、(2)第194位。所述点突变可以是上述位点中的一位或两位。本发明突变体包括：mut-Ile194Lys，mut-Ile194Lys/Leu145Asp，mut-Ile194Lys/Leu145Pro，mut-Ile194Lys/Leu145Gln，mut-Ile194Lys/Leu145Ser，等。
具体的，所述重组脂肪酶突变体由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第145位的亮氨酸突变为天冬氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸；(2)第194位的异亮氨酸突变为赖氨酸。
优选的，所述的重组脂肪酶突变体，其特征在于所述重组脂肪酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示(即突变体mut-Ile194Lys/Leu145Asp)。
本发明还涉及编码所述的重组脂肪酶突变体的基因。本领域普通技术人员在已知突变体氨基酸序列的情况下，可以很容易的获得其编码基因序列。
优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(该基因编码突变体mut-Ile194Lys/Leu145Asp)。
本发明还涉及由所述编码基因构建的重组载体，以及由所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。所述重组载体是用常规方法将本发明的脂肪酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。所述重组工程菌是将包含本发明脂肪酶基因核苷酸序列的表达载体转化到感受态大肠杆菌E.coliRosetta(DE3)中得到的重组脂肪酶酶基因工程菌。
本发明还涉及所述的重组脂肪酶突变体在制备莫西沙星药物中间体(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用。
具体的，所述应用为：将整合有重组脂肪酶突变体编码基因的基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心，以发酵上清或分离纯化后的酶作为催化剂，以外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，以pH值为3.0～10.0的100mM磷酸盐的缓冲液(优选磷酸钠缓冲溶液)为反应介质构成反应体系，在25-50℃转化反应，反应结束后，获得(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯的反应液。
优选的，所述底物初始浓度为1～2mol/L反应体系(即600～5000U/L)，所述酶的用量为0.1～0.8g/L反应体系(即243.26～486.52g/L)，所需的转化时间为12～21h。
本发明有益效果主要体现在：
本发明得到了一系列对外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯具有高立体选择性，高催化活力的脂肪酶突变体，所得脂肪酶突变体用于催化拆分生产(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯具有反应条件温和、底物浓度高、催化剂用量少、反应时间短、光学纯度高的优点。1mol/L(243.26g/L)的外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯在0.1g/L的脂肪酶突变体催化下，12h内其转化率达到49.9％，e.e.s>99％明显优于现有报道的脂肪酶。
(四)附图说明
图1为脂肪酶法拆分外外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯示意图。
图2为Pichia pastoris X-33/SRL表达及纯化脂肪酶SDS-PAGE图。
泳道1为Marker；泳道2为Pichia pastoris X-33/SRL发酵上清样；泳道3为Pichiapastoris X-33/SRL纯化样。
图3为SRL拆分1mol/L底物进程图。
图4为mut-Ile194Lys拆分1mol/L底物进程图。
图5为mut-Ile194Lys/Leu145Asp拆分1mol/L底物进程图。
图6为mut-Ile194Lys/Leu145Asp拆分2mol/L底物进程图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：重组脂肪酶基因工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET22b-SRL的构建
丝孢堆黑粉菌脂肪酶(Sporisoriumreilianum SRZ2lipase，SRL)基因序列经酵母密码子优化后通过全基因合成获得pGEM-T-SRL质粒。设计同源重组引物1(GCGATGGCCACTCCATTGGTTAAGAGA)、引物2(GTGGTGGTGCAAGATAACACCAGAACA)、引物3(GTTATCTTGCACCACCACCACCACCAC)、引物4(CAATGGAGTGGCCATCGCCGGCTGGGC)，利用
Figure BDA0002120651720000051
Max Super-Fidelity DNA聚合酶以pGEM-T-SRL和pET22b质粒为模版进行扩增，获得966bp的脂肪酶基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列SEQ ID NO.2所示)和5427bp的pET22b表达载体基因序列。利用一步克隆试剂盒将脂肪酶基因片段与pET22b表达载体基因片段进行连接，构建表达载体pET22b-SRL。将构建的重组表达载体转化至E.coliRosetta(DE3)感受态细胞中获得重组脂肪酶酶基因工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET22b-SRL。
实施例2：理性设计和构建重组脂肪酶突变体mut-Ile194Lys
以含有表达载体pET22b-SRL的重组菌(E.coli Rosetta(DE3)/pET22b-SRL)为出发菌株，通过定点突变技术在SRL氨基酸序列第194位点引入突变(SEQ IN NO.2所示氨基酸序列的194位Ile突变为Lys)，提高脂肪酶对底物外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯的催化活力。设计定点突变引物如下：
Ile194Lys：
上游引物5：5’-CTCTGCTACTGACGACAAGGTTCAACCACAAAC-3’
下游引物6：5’-GTTTGTGGTTGAACCTTGTCGTCAGTAGCAGAG-3’
以pET22b-SRL质粒为模板，通过PCR引入突变，PCR反应程序如下：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃6min，重复25个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中，涂布于含终浓度100mg/L氨苄抗性和20mg/L氯霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h后，挑取单菌落进行诱导表达培养。然后比较脂肪酶突变体mut-Ile194Lys和野生型SRL在催化底物(外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯)时的转化率高低。转化反应在10mL的转化瓶中进行，底物浓度为40g/L，突变体湿菌体20g/L，35℃，150rpm反应3h，反应液通过HPLC分析来确定反应的转化率从而确定mut-Ile194Lys是否为正向突变体。
结果表明，突变体mut-Ile194Lys为正向突变，酶活力明显提高。以此突变体为出发菌株继续进行脂肪酶改造。
实施例3：重组脂肪酶突变体mut-Ile194Lys的继续改造及筛选
以突变体mut-Ile194Lys为出发菌株，通过定点饱和突变技术，进一步提高脂肪酶对底物外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯的催化活力。设计引物如下：
Leu(L)145：
上游引物7：
5’-ACTACAAGGGTACTGTTNNKGCTGCTTTCTTGACTAC-3’
下游引物8：
5’-GTAGTCAAGAAAGCAGCMNNAACAGTACCCTTGTAGT-3’
Ala(A)146：
上游引物9：
5’-ACAAGGGTACTGTTTTGNNKGCTTTCTTGACTACTCC-3’
下游引物10：
5’-GGAGTAGTCAAGAAAGCMNNCAAAACAGTACCCTTGT-3’
Leu(L)149：
上游引物11：
5’-CTGTTTTGGCTGCTTTCNNKACTACTCCAGGTTTGGC-3’
下游引物12：
5’-GCCAAACCTGGAGTAGTMNNGAAAGCAGCCAAAACAG-3’
Leu/Ser(L/S)154/156组合：
上游引物13：
5’-TTGACTACTCCAGGTNDTGCTNDTGAGTCTGTATGGCAA-3’
下游引物14：5’-CAGTAGCAGAGTACAAGTTAGTAGTTGG-3’
Val(V)159：
上游引物15：
5’-GGTTTGGCTTCGGAGTCTNNKTGGCAACAGCAAGCTGG-3’
下游引物16：
5’-CCAGCTTGCTGTTGCCAMNNAGACTCCGAAGCCAAACC-3’
重组质粒基因突变及转化至感受态细胞的操作过程按照实施例2进行，获得了一系列的突变体单菌落。阳性克隆子的筛选：随机挑选平板上的单菌落于96孔板中，加入1mL含100μg/mL Amp(氨苄霉素)+20μg/mL Cm(氯霉素)的液体LB培养基，37℃，150rpm下培养过夜。转接200μL种子液于另一块新的加有1mL含100μg/mL Amp(氨苄霉素)+20μg/mL Cm(氯霉素)的液体LB培养基的96孔板中，37℃，150rpm培养4h后加入IPTG(终浓度0.1mM)在22℃下进行诱导表达培养12h。所得的菌液通过96孔板离心机离心30min得到湿菌体，湿菌体经pH7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤一次后，保存至-80℃冰箱，反复冻融3次，再加入200μL 2g/L的溶菌酶酶液于22℃处理2h，离心除去细胞碎片，得到粗酶液。突变体酶活通过pH指示剂溴百里香酚蓝的颜色变化来判断，具体地，96孔板220μL酶活测定体系包含：20μL pH指示剂，100μL底物(40g/L的外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯)，100μL经溶菌酶破胞处理所得的酶液，观察反应液颜色变化。相应地，突变体酶活越高，颜色由蓝色变为黄色的速度越快，从而筛选出活力相对较高的突变体。
通过对Leu145，Ala146，Leu149，Leu154/Ser156和Val159位点的饱和突变分析，获得一系列不同的脂肪酶突变体。通过比较不同脂肪酶突变体在催化底物(外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯)时的转化率高低来确定最优突变体。转化反应在10mL的转化瓶中进行，底物浓度为40g/L，突变体湿菌体20g/L，35℃，150rpm反应1h，反应液通过HPLC分析来确定反应的转化率从而确定最优的突变体。
结果表明，不同突变位点获得的较优突变体为mut-Ile194Lys/Leu145Asp(SEQ INNO.2所示氨基酸序列的194位Ile突变为Lys，且145位Leu突变为Asp)、mut-Ile194Lys/Leu145Pro(SEQ IN NO.2所示氨基酸序列的194位Ile突变为Lys，且145位Leu突变为Pro)、mut-Ile194Lys/Leu145Gln(SEQ IN NO.2所示氨基酸序列的194位Ile突变为Lys，且145位Leu突变为Gln)、mut-Ile194Lys/Leu145Ser(SEQ IN NO.2所示氨基酸序列的194位Ile突变为Lys，且145位Leu突变为Ser)其中最优的突变体为mut-Ile194Lys/Leu145Asp。
实施例4：野生型及突变体重组脂肪酶基因工程菌Pichia pastoris X-33/SRL和Pichia pastoris X-33/SRL-muts的构建
以pET22b-SRL、pET22b-SRL-muts、pPiczα-A质粒为PCR模板，设计表达引物17(GCTGAAGCTACTCCATTGGTTAAGAGA)、引物18(ATGATGATGCAAGATAACACCAGAACA)、引物19(GTTATCTTGCATCATCATCATCATCAT)、引物20(CAATGGAGTAGCTTCAGCCTCTCTTTT)利用
Figure BDA0002120651720000091
Max Super-Fidelity DNA聚合酶进行扩增，获得966bp的脂肪酶野生型及突变体基因序列和3321bp的pPiczα-A穿梭载体基因序列。利用一步克隆试剂盒将脂肪酶基因片段与pPiczα-A穿梭载体基因片段进行连接，构建表达载体pPiczα-A-SRL及pPiczα-A-SRL-muts。将构建的重组质粒用Sca I线性化，通过电击转化法将线性化的质粒导入Pichia pastoris X-33，整合到基因组后获得重组脂肪酶基因工程菌Pichia pastoris X-33/SRL及Pichiapastoris X-33/SRL-muts。
实施例5：野生型及突变体重组脂肪酶的分离纯化
将实施例4构建的野生型及突变体重组脂肪酶基因工程菌，接种至BMGY培养基，在30℃培养12h后，离心转接至BMMY培养基，在30℃下用甲醇诱导72h。离心获得含有目标蛋白的发酵上清液。上清液经超滤膜超滤浓缩后，获得浓缩的酶液。将浓缩酶液与经结合缓冲液平衡过的Ni亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mMNaCl，15mM咪唑)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mMNaCl，500mM咪唑)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液(20mM，pH7.0磷酸钠缓冲液)透析24h，取截留液用BCA试剂盒测定蛋白含量，并冻存于-80℃冰箱中(图2)，获得野生型及突变体脂肪酶SRL-WT、mut-Ile194Lys/Leu145Asp、mut-Ile194Lys/Leu145Pro、mut-Ile194Lys/Leu145Gln、mut-Ile194Lys/Leu145Ser纯酶。
实施例6：脂肪酶酶活力测定
将实施例5中分离纯化得到的野生型及突变体脂肪酶SRL-WT、mut-Ile194Lys/Leu145Asp、mut-Ile194Lys/Leu145Pro、mut-Ile194Lys/Leu145Gln、mut-Ile194Lys/Leu145Ser纯酶用于催化底物(外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯)
酶催化体系组成及催化条件如下：1mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0，)中含有50mM的外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯，加入用相同缓冲溶液稀释的野生型及突变体纯酶(1mL反应体系中SRL及突变体酶的终浓度为50mg/L)，于35℃，800rpm条件下反应。反应一定时间后加入30μL 6M的HCl终止反应，混合均匀后取样萃取，样品处理检测酶活。
表1：SRL野生型及突变体脂肪酶酶活
Figure BDA0002120651720000111
酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 7.0条件下，1min内消耗1μmol(2R,3S)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯所需的酶量定义为1U。
实施例7：重组野生型脂肪酶SRL在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用
以实施例5中获得的野生型SRL纯酶为生物催化剂，以外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，进行酶法拆分反应制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯。
催化反应体系及催化条件如下：30mL磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)中加入SRL纯酶至终浓度为0.1g/L，初始底物浓度(外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物)为1mol/L(243.26g/L)，35℃水浴，磁力搅拌800rpm，通过自动流加2M NaOH溶液的方式控制pH为7.0，反应定时取样，并通过HPLC分析。催化进程(图3)结果表明催化24h转化率为1.87％。
实施例8：重组脂肪酶突变体mut-Ile194Lys在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用
以实施例5中获得的脂肪酶突变体mut-Ile194Lys纯酶为生物催化剂，以外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，进行酶法拆分反应制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯。
催化反应体系及催化条件如下：30mL磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)中加入mut-Ile194Lys纯酶至终浓度为0.1g/L，初始底物浓度(外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物)为1mol/L(243.26g/L)，35℃水浴，磁力搅拌800rpm，通过自动流加2M NaOH溶液的方式控制pH为7.0，反应定时取样，并通过HPLC分析。催化进程结果(图4)表明催化24h转化率为44.20％，e.e.s为79.19％。
实施例9：重组脂肪酶突变体mut-Ile194Lys/Leu145Asp在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用
以实施例5中获得的脂肪酶突变体mut-Ile194Lys/Leu145Asp纯酶为生物催化剂，以外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，进行酶法拆分反应制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯。
催化反应体系及催化条件如下：30mL磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)中加入mut-Ile194Lys/Leu145Asp纯酶至终浓度为0.1g/L，初始底物浓度(外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物)为1mol/L(243.26g/L)，35℃水浴，磁力搅拌800rpm，通过自动流加2MNaOH溶液的方式控制pH为7.0，反应定时取样，并通过HPLC分析。催化进程结果(图5)表明催化12h转化率为49.9％，e.e.s>99％。将初始底物浓度提高至2mol/L(486.52g/L)，同时提高mut-Ile194Lys/Leu145Asp纯酶至终浓度为0.8g/L，35℃水浴，磁力搅拌800rpm，通过自动流加2M NaOH溶液的方式控制pH为7.0，反应定时取样，并通过HPLC分析。催化进程结果(图6)表明催化21h转化率为49.9％，e.e.s>99％。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种重组脂肪酶突变体、编码基因、重组工程菌及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 966
<212> DNA
<213> Sporisoriumreilianum
<400> 1
actccattgg ttaagagatt gccatctggt tctgacccag cttacacttt gtctaaggct 60
caattggact ctgttttggc ttgtcaaaac ggttctccat cttctcaaaa gaacccaatc 120
ttgttggttc caggtactgg tactactggt ccacaatctt tcgactctaa ctggatccca 180
ttgtctactc aattgggtta ctctccatgt tgggtttctc caccaccatt catgttgaac 240
gacactcaag ttaacgctga atacatcgtt aatgctgtta aggtgctgtc ttctgcttcg 300
ggtgctaagg ttccagtgct aacttggtcg cagggtggtc tcgctgcgca atgggcgttg 360
actttcttcc catctatcag aactcaagtt gacagattga tggctttcgc tccagactac 420
aagggtactg ttttggctgc tttcttgact actccaggtt tggcttcgga gtctgtatgg 480
caacagcaag ctggcagtgc tctcactact gctctcgcta acgctggtgg tttgactaag 540
atcgttccaa ctactaactt gtactctgct actgacgaca tcgttcaacc acaaactttc 600
aacggtccat tggactctgg ttacttgaac ggtggtgcta agaacatcca agctcaatct 660
gtttgtggtc cattgttcgt tgttgaccac gctggtactt tgacttctca attctctttc 720
gttgttggta gatctgcttt gagatctact actggtcaag ctcaatctaa ggactacggt 780
gttactgact gtaacccatt gccagctgac tctttgactc cagaccaaaa gttgagagct 840
gaaggtttgt tgttggttgc tggtgctaac gttgctgctg gtccaaagca aaactgtgaa 900
ccagacttga tgccatacgc tagacaatac gctgttggta agagaacttg ttctggtgtt 960
atcttg 966
<210> 2
<211> 322
<212> PRT
<213> Sporisoriumreilianum
<400> 2
Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Ser Lys Ala Gln Leu Asp Ser Val Leu Ala Cys Gln Asn Gly Ser
20 25 30
Pro Ser Ser Gln Lys Asn Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr
35 40 45
Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln
50 55 60
Leu Gly Tyr Ser Pro Cys Trp Val Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gln Val Asn Ala Glu Tyr Ile Val Asn Ala Val Lys Val Leu
85 90 95
Ser Ser Ala Ser Gly Ala Lys Val Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly
100 105 110
Gly Leu Ala Ala Gln Trp Ala Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Thr
115 120 125
Gln Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val
130 135 140
Leu Ala Ala Phe Leu Thr Thr Pro Gly Leu Ala Ser Glu Ser Val Trp
145 150 155 160
Gln Gln Gln Ala Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Ala Asn Ala Gly
165 170 175
Gly Leu Thr Lys Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp
180 185 190
Asp Ile Val Gln Pro Gln Thr Phe Asn Gly Pro Leu Asp Ser Gly Tyr
195 200 205
Leu Asn Gly Gly Ala Lys Asn Ile Gln Ala Gln Ser Val Cys Gly Pro
210 215 220
Leu Phe Val Val Asp His Ala Gly Thr Leu Thr Ser Gln Phe Ser Phe
225 230 235 240
Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Gln Ser
245 250 255
Lys Asp Tyr Gly Val Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asp Ser Leu
260 265 270
Thr Pro Asp Gln Lys Leu Arg Ala Glu Gly Leu Leu Leu Val Ala Gly
275 280 285
Ala Asn Val Ala Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met
290 295 300
Pro Tyr Ala Arg Gln Tyr Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Val
305 310 315 320
Ile Leu
<210> 3
<211> 966
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
actccattgg ttaagagatt gccatctggt tctgacccag cttacacttt gtctaaggct 60
caattggact ctgttttggc ttgtcaaaac ggttctccat cttctcaaaa gaacccaatc 120
ttgttggttc caggtactgg tactactggt ccacaatctt tcgactctaa ctggatccca 180
ttgtctactc aattgggtta ctctccatgt tgggtttctc caccaccatt catgttgaac 240
gacactcaag ttaacgctga atacatcgtt aatgctgtta aggtgctgtc ttctgcttcg 300
ggtgctaagg ttccagtgct aacttggtcg cagggtggtc tcgctgcgca atgggcgttg 360
actttcttcc catctatcag aactcaagtt gacagattga tggctttcgc tccagactac 420
aagggtactg ttgacgctgc tttcttgact actccaggtt tggcttcgga gtctgtatgg 480
caacagcaag ctggcagtgc tctcactact gctctcgcta acgctggtgg tttgactaag 540
atcgttccaa ctactaactt gtactctgct actgacgaca aggttcaacc acaaactttc 600
aacggtccat tggactctgg ttacttgaac ggtggtgcta agaacatcca agctcaatct 660
gtttgtggtc cattgttcgt tgttgaccac gctggtactt tgacttctca attctctttc 720
gttgttggta gatctgcttt gagatctact actggtcaag ctcaatctaa ggactacggt 780
gttactgact gtaacccatt gccagctgac tctttgactc cagaccaaaa gttgagagct 840
gaaggtttgt tgttggttgc tggtgctaac gttgctgctg gtccaaagca aaactgtgaa 900
ccagacttga tgccatacgc tagacaatac gctgttggta agagaacttg ttctggtgtt 960
atcttg 966
<210> 4
<211> 322
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Ser Lys Ala Gln Leu Asp Ser Val Leu Ala Cys Gln Asn Gly Ser
20 25 30
Pro Ser Ser Gln Lys Asn Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr
35 40 45
Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln
50 55 60
Leu Gly Tyr Ser Pro Cys Trp Val Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Val Gln Pro Gln Thr Phe Asn Gly Pro Leu Asp Ser Gly Tyr
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Gln Ser
245 250 255
Lys Asp Tyr Gly Val Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asp Ser Leu
260 265 270
Thr Pro Asp Gln Lys Leu Arg Ala Glu Gly Leu Leu Leu Val Ala Gly
275 280 285
Ala Asn Val Ala Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met
290 295 300
Pro Tyr Ala Arg Gln Tyr Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Val
305 310 315 320
Ile Leu

Claims (9)

1.一种重组脂肪酶突变体，由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第145位的亮氨酸突变为天冬氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸；(2)第194位的异亮氨酸突变为赖氨酸。
2.如权利要求1所述的重组脂肪酶突变体，其特征在于所述重组脂肪酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.编码权利要求1所述的重组脂肪酶突变体的基因。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
5.由权利要求4所述编码基因构建的重组载体。
6.由权利要求5所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
7.权利要求或2所述的重组脂肪酶突变体在制备莫西沙星药物中间体(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用为：将整合有重组脂肪酶突变体编码基因的基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心，以发酵上清或分离纯化后的酶作为催化剂，以外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，以pH值为3.0～10.0的100mM磷酸盐的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25～50℃转化反应，反应结束后，获得(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯的反应液。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述底物初始浓度为1～2mol/L反应体系，所述酶的用量为0.1～0.8g/L反应体系。
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Exploration and functional expression of homologous lipases of Candida antarctica lipase B;Seongsoon Park 等;《Korean Journal of Microbiology》;20150331;第51卷(第3期);摘要、第189页右栏第2段-第191页右栏第1段、表1和图1 *
Expression and characterization of a CALB-type lipase from Sporisorium reilianum SRZ2 and its potential in short-chain flavor ester synthesis;Jiang-Wei Shen 等;《Front. Chem. Sci. Eng.》;20200312;第14卷(第5期);868–879 *
Seongsoon Park 等.Exploration and functional expression of homologous lipases of Candida antarctica lipase B.《Korean Journal of Microbiology》.2015,第51卷(第3期),187-193. *
Surveying Enantioselectivity of Two Candida Antarctica-lipase-B Homologs Towards Chiral sec‐Alcohols;Young-Hyun Kim 等;《BULLETIN OF THE KOREAN CHEMICAL SOCIETY》;20171011;第38卷;1358-1361 *

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