CN111117983B - 一种脂肪酶突变体及其在制备(s)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的应用 - Google Patents
一种脂肪酶突变体及其在制备(s)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种脂肪酶突变体及其在制备(S)‑2‑氯苯甘氨酸甲酯中的应用，该脂肪酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列第157位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸，第189位的异亮氨酸突变为赖氨酸，且第154位的缬氨酸突变为天冬氨酸而获得。本发明通过分子对接和定点饱和突变，筛选获得了可明显缩短不对称水解反应时间且对R型2‑氯苯甘氨酸甲酯方拆分效率高、选择性高的脂肪酶突变体，该突变体在反应12h后(S)‑2‑氯苯甘氨酸甲酯的得率达到了72.81％，ee值为95.24％，相对于野生型来说，实现了活性的提高和选择性的反转，同时缩短了反应时间。
Description
技术领域
本发明涉及酶基因改造技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其在拆分(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯制备单一对映体(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的应用。
背景技术
南极假丝酵母(Candida antarctica)是在南极洲分离得到的一种酵母菌，该菌株可以合成出CALA和CALB两种不同的脂肪酶。早在1994年之前，人们就成功的分离出了这两种脂肪酶，并对其氨基酸序列和三维结构进行了研究，发现南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)总共具有317个氨基酸，分子量为33kDa。
到目前为止，CALB被研究人员大量的在米曲霉、毕赤酵母、酿酒酵母和大肠杆菌中进行克隆表达，成为了商业上应用较为广泛的一种酶。但是，野生型的CALB仍然具有一定的缺陷，如热稳定性较差和产量较低等，对CALB进行修饰和改造使其具有更加良好的性质是较为热门的一个研究。
2-氯苯甘氨酸甲酯(2-Chlorophenylglycine methyl ester)是一种具有生物活性的非天然的氨基酸酯，由2-苯甘氨酸与甲醇经酯化合成得到，其作为一种医药中间体，是目前合成高效抗血小板凝集类药物氯吡格雷(Clopidogrel)的重要途径之一。该药物商品名为“波立维(Plavix)”，主要功能为抑制ADP诱导的血小板凝集，在血栓和心脑血管疾病治疗上有着重要的作用。
氯吡格雷属于手性类药物，从临床实验研究结果中发现，(S)-氯吡格雷具有抗血小板凝集的活性，但(R)-氯吡格雷没有显示出相同的活性，并且有研究证明(S)-氯吡格雷的耐受性比(R)-氯吡格雷高约40倍。
对于手性药物来说，手性与药物的药理活性、毒性和药代动力学有着密切的关联，高纯度单一对映体具有治疗靶点明确，疗效更高、安全性更高等优势。因此，作为合成氯吡格雷的重要原料，获取单一对映体的2-氯苯甘氨酸甲酯对氯吡格雷的生产和使用有着重要的意义。
目前，外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯主要使用化学法进行拆分，主要使用的拆分剂为酒石酸和樟脑磺酸，向溶解于甲醇的外消旋邻氯苯甘氨酸甲酯中加入等体积的拆分剂，随后利用非对映体盐拆分等方法进行拆分，其能获得ee值达到99％以上的产物，产率在31％～45％，但其具有拆分剂添加量大、产废量多、拆分成本高、反应时间长、原料浪费现象严重和操作过程繁琐等缺陷。所以，开发一种高效、低成本且绿色环保的2-氯苯甘氨酸甲酯拆分方法是有着重要意义的。
生物催化制备医药中间体是近年来研究较为热门的一个领域，相对于使用化学法获取2-氯苯甘氨酸甲酯，使用酶催化方法表现得更加环保高效且低成本。目前的专利文献对于利用酶直接拆分2-氯苯甘氨酸甲酯的研究报道还较少，2009年黄淳旭等人研究了使用碱性蛋白酶拆分邻氯苯甘氨酸甲酯，在反应24h后得到了ee值达到99.8％的(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯。2014年薛屏等人使用固定化青霉素G酰化酶拆分30h后得到了ee值为97.1％的产物，但还是存在反应时间长等缺陷。
野生型的南极假丝酵母脂肪酶B对2-氯苯甘氨酸甲酯几乎没有或仅有很低的对映选择性，但是随着对南极假丝酵母的氨基酸序列及晶体结构研究的深入，发现对CALB进行适当地修饰和改进可以提升CALB的选择性，并大大加快反应进程，从而达到快速拆分2-氯苯甘氨酸甲酯的目的。
发明内容
本发明提供了一种脂肪酶突变体及其在拆分(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯制备单一对映体(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的应用，该脂肪酶突变体不仅对2-氯苯甘氨酸甲酯具有较高的拆分效率及选择性，而且可以缩短不对称水解反应时间，有利于氯吡格雷的制备。
具体技术方案如下：
一种脂肪酶突变体，所述脂肪酶突变体所述脂肪酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列第157位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸，第189位的异亮氨酸突变为赖氨酸，且第154位的缬氨酸突变为天冬氨酸而获得。
上述脂肪酶突变体由野生型南极假丝酵母脂肪酶B(Candida Antarctica lipaseB)基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)通过突变得到；该突变体与野生型相比，在拆分2-氯苯甘氨酸甲酯方面具有拆分效率高、选择性高以及水解反应时间短等优点。
本发明还提供了一种所述的脂肪酶突变体的编码基因。
上述脂肪酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列第157位的谷氨酰胺(密码子为CAA)突变为苯丙氨酸(密码子为TTC)，第189位的异亮氨酸(密码子为ATT)突变为赖氨酸(密码子为AAG)，且第154位的缬氨酸(密码子为GTC)突变为天冬氨酸(GAC密码子为)。
本发明还提供了一种包含所述编码基因的重组载体。
本发明还提供了一种包含所述编码基因的基因工程菌。
本发明还提供了所述的脂肪酶突变体在拆分(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯制备单一对映体(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的应用。
本发明还提供了所述的基因工程菌在拆分(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯制备单一对映体(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的应用。
本发明还提供了一种拆分(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯制备单一对映体(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯的方法，包括：在缓冲溶液中，以(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯为底物，所述脂肪酶突变体或所述基因工程菌为生物催化剂，进行不对称水解反应，得到单一对映体(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯。
进一步地，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液的pH值为6～9，浓度为0.05～0.2M。
更优选，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7，浓度为0.1M。
进一步地，反应体系中，反应温度为25～35℃，反应时间为10～16h。
更优选，反应温度为30℃，反应时间为12h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过分子对接和定点饱和突变，筛选获得了可明显缩短不对称水解反应时间且对外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯拆分效率高、选择性高的脂肪酶突变体，该突变体在反应12h后(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯的得率达到了72.81％，ee值为95.24％，相对于野生型来说，实现了活性的提高和选择性的反转，同时缩短了反应时间。
(2)本发明提供的制备方法操作简单，拆分速度快，反应条件温和，避免使用大量的有毒有害试剂，三废产量低，是环保绿色的一种制备方法。
附图说明
图1为本发明利用脂肪酶突变体拆分(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯制备单一对映体(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯的反应方程式示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例涉及的培养基配方如下：
a.YPD培养基：10g酵母提取物、20g蛋白胨，20g葡萄糖溶于1L蒸馏水中(配置固体培养基可在灭菌前加入15g琼脂)，115℃高温高压灭菌30min。
b.LB培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl溶于1L蒸馏水中120℃高温高压灭菌20min。
下列实施例涉及的液相检测条件及方法如下：
反应液中2-氯苯甘氨酸甲酯及2-氯苯甘氨酸由HPLC(Agilent,US)进行检测，柱子为购买于大赛璐的手性柱Daicel Crownpack CR(+)0.4×15cm，流动相为10mM高氯酸，流速为0.8mL/min，柱温为25℃。
(R)-2-氯苯甘氨酸甲酯和(S)-邻氯苯甘氨酸的对映体过量值分别用ees(％)和eep(％)来表示，反应总转化率用C(％)表示，其计算如下：
eeS＝(cSR-cSS)/(cSR+cSS)
eeP＝cRp-cSp)/(cRp+cSp)
得率(％)＝cSS/cS
式中，cSR表示(R)-2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度，单位为mol/L；cSS表示为(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度，单位为mol/L；cPR为(R)-2-氯苯甘氨酸的浓度，单位为mol/L，cPR为2-氯苯甘氨酸的浓度，cS为(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯理论浓度，单位为mol/L。
下列实施例涉及的酶活测定方法如下：
酶活单位(U)定义为：在3℃条件下，每分钟转化1微摩尔(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯所需的酶量定义为一个酶活单位，U。
酶活检测标准条件：10mM(R,S)-2氯苯甘氨酸甲酯，适量酶液，30℃、pH 7,600rpm条件下反应2h，样品处理并进行HPLC分析。
实施例中获得的野生型南极假丝酵母脂肪酶B工程菌(E.coli Rosetta(DE3)/pET22b(+)-CALB-WT)及其突变体E.coli Rosetta(DE3)/pET22b(+)-CALB-Q157F、E.coliRosetta(DE3)/pET22b(+)-CALB-Q157F/I189K、E.coli Rosetta(DE3)/pET22b(+)-CALB-Q157F/I189K/V154D按实施例2中方法诱导培养后，在冰水混合物上超声破碎6min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停1s，获得粗酶液，随后用镍亲和柱(1.6×10cm,Bio-Rad公司，美国)纯化蛋白。最后使用二喹啉甲酸蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定浓度。
实施例1野生型南极假丝酵母脂肪酶B工程菌(E.coli Rosetta(DE3)/pET22b(+)-CALB-WT)的构建
1、野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因的克隆
将包含有南极假丝酵母脂肪酶B基因的毕赤酵母(Z.Liu.Cloning,expressionand characterization of a lipase gene from the Candida antarctica ZJB09193and its application in biosynthesis of vitamin A esters.Microbiol.Res.,2012,167,452～460)接种于YPD液体培养基中培养过夜，发酵液用2mL离心管3000rpm/min离心5min，弃上清，收集菌体；使用真菌提取试剂盒提取出基因组。
根据CALB基因(SEQ ID NO.1)设计引物1：TTACCTAGTGGTTCCGACCC和引物2：AGGAGTAACAATTCCTGAACAGG，以提取出的基因组为模板进行PCR反应，克隆出野生型CALB基因，反应体系如下：
PCR扩增程序为：
PCR反应结束后获得的产物即为野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的基因。
2、构建带有野生型南极假丝酵母脂肪酶B基因的质粒pET22b(+)-CALB-WT
设计引物3：TTCAGGAATTGTTACTCCTCACCACCACCACCACCACTGA和引物4：TCGGAACCACTAGGTAAGCCATCGCCGGCT，其中下划线处是质粒与野生型南极假丝酵母脂肪酶B基因进行一步克隆时所需的同源臂。以pET22b(+)质粒(Novagen,Darmstadt,Germany)为模板，使用反向PCR技术对质粒进行线性化处理，反应体系如下：
PCR扩增程序为：
PCR反应结束后，获得的产物即为线性化的pET22b(+)质粒。
利用一步克隆试剂盒将线性化的质粒与本实施例第1部分中获得的野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因进行连接，获得的连接产物即为带有野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因的质粒pET22b(+)-CALB-WT。
3、构建带有野生型南极假丝酵母脂肪酶B基因的工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET22b(+)-CALB-WT
具体步骤如下：
(a)从甘油管中接种E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞于LB试管中，37℃，200rpm过夜培养；
(b)从过夜培养试管中吸取500μL菌液接种于50mL LB培养基上，37℃，200rpm培养2h，培养完成后冰浴静置30min，4000rpm/min离心菌体10min，弃上清；
(c)加入20mL预冷处理的0.1M CaCl2溶液，重悬菌体，随后4000rpm/min离心10min，弃上清，重复一次该步骤；
(d)加入1.5mL含有10％甘油的0.1MCaCl2溶液，重悬菌体，按照100μL/管的量将制备好的感受态分装至无菌EP管中；
(e)取连接产物pET22b(+)-CALB-WT10μL加入分装好的感受态中，冰浴30min，随后42℃热激90s，完成热激后加入1mL预冷的LB培养基，置于37℃摇床中培养2h，涂布于带有浓度为100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上37℃过夜培养，挑取单菌落送至杭州擎科生物技术有限公司测序验证，其中阳性克隆即为带有野生型南极假丝酵母脂肪酶B基因的工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET22b(+)-CALB-WT。
实施例2野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CALB-WT)的诱导表达
将实施例1第3部分得到的工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET22b(+)-CALB-WT接种于含有100μg/mL氨苄青霉素和20μg/mL氯霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，以体积浓度1％(v/v)的接种量接种于新鲜的含有终浓度为100μg/mL氨苄和20μg/mL的LB培养基中，37℃、180rpm培养3h，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，22℃培养12h，4℃、10000g离心10min，获得相应的菌体细胞。
以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于制备粗酶液，并不对称水解外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯。
实施例3野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CALB-WT)不对成水解2-氯苯甘氨酸甲酯
在反应瓶中加入0.5g外消旋的2-氯苯甘氨酸甲酯和50mL pH 7.0、0.2M磷酸钠缓冲液，随后加入由实施例2中获得的菌体细胞10g并混匀，此时外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为10g/L，在30℃条件下控制转速为600rpm/min反应24h，结束反应。
取反应结束后的反应液用HPLC进行分析，结果如表1所示。
实施例4野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CALB-WT)第Q157位点处突变文库的构建
第一步：将实施例1第3部分得到的工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET22b(+)-CALB-WT接种于含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和20μg/mL氯霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，提取质粒pET22b(+)-CALB-WT，并保存于-20℃。
第二步：根据从PDB中下载报道的南极假丝酵母脂肪酶B的晶体结构(PDB ID:1TCA)，并进行分子对接，在活性中心及活性口袋附近选择合适的突变位点，设计了Q157位点的突变引物Lib1 F：CTTCCNNSTGGCAACAAACCACGG和Lib1-R：GTTGCCANNSGGAAGGAGCGG，以pET22b(+)-CALB-WT为质粒模板进行定点饱和突变，其反应体系为：
PCR扩增程序为：
PCR结束后获得的产物即为突变质粒，按照实施例1中3部分第e步进行转化，挑选单菌落并测序，获得Q157位点突变体。
实施例5野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CALB-WT)第Q157位点突变体(第157位由谷氨酰胺突变为苯丙氨酸)的诱导表达和阳性突变体的筛选
将实施例4中获得的Q157位突变体参照实施例2中的诱导表达方法对突变体进行诱导表达，获得产生相应蛋白的菌体。随后，在反应瓶中加入0.5g外消旋的2-氯苯甘氨酸甲酯和50mL pH 7.0、0.2M磷酸钠缓冲液，随后诱导表达后获得的菌体细胞10g并混匀，此时外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为10g/L，在30℃条件下控制转速为600rpm/min反应12h，结束反应。
取反应结束后的反应液用HPLC进行分析，结果如表1所示。
实施例6 pET22b(+)-CALB-Q157F第I189位突变文库的构建
在实施例5筛选出的最优突变体pET22b(+)-CALB-Q157F基础上，通过结合分子对接结果分析，选定I189位做定点饱和突变，设计引物Lib2-F：CAGACGAANNSGTTCAGCCTCAAGTTAG和Lib2-R：GCTGAACNNSTTCGTCTGTAGCTGAGTA，以pET22b(+)-CALB-Q157F为模板质粒进行定点饱和突变，其反应体系参照实施例4，
PCR扩增程序为：
PCR结束后获得的产物即为突变质粒，按照实施例1中3部分第e步进行转化，挑选单菌落并测序，获得I189位点突变体。
实施例7 pET22b(+)-CALB-Q157F第I189位点突变体(第157位由谷氨酰胺突变为苯丙氨酸，且第189位由异亮氨酸突变为赖氨酸)的诱导表达和阳性突变体的筛选
将实施例6中获得的I189位点突变体参照实施例5的诱导表达方式和测定突变体对外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯不对称水解能力的方法，对突变体进行诱导表达并测定水解外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯活力进行检测，筛选出了最优突变体pET22b(+)-CALB-Q157F/I189K。
实施例8 pET22b(+)-CALB-Q157F/I18K第V154位点突变文库的构建
在实施例5筛选出的最优突变体pET22b(+)-CALB-Q157F基础上，通过结合分子对接结果分析，选定I189位做定点饱和突变，设计引物Lib3-F：TCTGGCAANNSACCACGGGTTCAGCT和Lib3-R：CGTGGTNNSTTGCCAGACGGAAGGAG，以pET22b(+)-CALB-Q157F/I189为模板质粒进行定点饱和突变，其反应体系参照实施例4。
PCR扩增程序为：
PCR结束后获得的产物即为突变质粒，按照实施例1中3部分第e步进行转化，挑选单菌落并测序，获得V154位点突变体。
实施例9 pET22b(+)-CALB-Q157F/I189K第V154位点突变体(第157位由谷氨酰胺突变为苯丙氨酸，第189位由异亮氨酸突变为赖氨酸，且第154位由缬氨酸突变为天冬氨酸)的诱导表达和阳性突变体的筛选
将实施例8中获得的V154位点突变体参照实施例5的诱导表达方式和测定突变体对外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯不对称水解能力的方法，对突变体进行诱导表达并测定水解外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯活力进行检测，筛选出了最优突变体pET22b(+)-CALB-Q157F/I189K/V154D。
经HPLC的检测分析，结果如表1所示。表1展示了野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CALB-WT)及其突变体(CALB-Q157F、CALB-Q157F/I189K和CALB-Q157F/I189K/V154D)对外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的水解活力及选择性情况。
表1
| 酶 | 相对酶活(％) | 反应时间(h) | 得率(％) | ee<sub>s</sub>(％) |
| WT-CALB | 100 | 24 | 54.15 | -9.00 |
| CALB-Q157F | 101.36 | 24 | 71.32 | 20.97 |
| CALB-Q157F/I189K | 328.03 | 12 | 62.33 | 85.57 |
| CALB-Q157F/I189K/V154D | 309.75 | 12 | 72.81 | 95.24 |
从表1中可以看出，本发明使用的CALB突变体能有效的对2-氯苯甘氨酸甲酯进行水解拆分。本发明相对于传统的化学法拆分来说能够高效绿色的拆分2-氯苯甘氨酸甲酯，在缩短反应时间，降低拆分成本、使拆分条件温和化的同时达到了绿色环保的要求，具有巨大的优势。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种脂肪酶突变体及其在制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 951
<212> DNA
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
<400> 1
ttacctagtg gttccgaccc tgctttctct cagcctaaga gtgtgctgga tgcaggtctt 60
acatgtcaag gtgcatcccc atcttccgtt agtaaaccta ttttactggt tccaggaact 120
ggtactactg gaccacaaag tttcgattct aattggatcc ctctgtccac ccaactagga 180
tatacgccat gttggatttc tcctccacca ttcatgttaa acgatactca agttaacact 240
gagtacatgg ttaacgctat taccgcactt tacgctggtt caggaaacaa taaattgcct 300
gtcttgacct ggtctcaggg tggcttagtc gcccaatggg gactgacatt cttcccttca 360
atcagatcaa aggtcgacag acttatggcc tttgctcctg actacaaagg taccgtgttg 420
gctggtccac ttgacgcctt ggcagtgtcc gctccttccg tctggcaaca aaccacgggt 480
tcagctttga cgactgccct gcgaaatgct ggaggattga ctcaaatagt gcccactact 540
aacctatact cagctacaga cgaaattgtt cagcctcaag ttagtaacag tccactagat 600
tcatcctatc tatttaacgg caagaatgtt caagcacagg cagtctgtgg tcctcttttc 660
gttatcgatc atgcaggatc tttgacatca cagttctcat acgtagtggg tcgatccgcc 720
ttgaggtcaa caacgggtca agccagatct gccgactacg gtatcaccga ttgtaaccct 780
ctgcctgcaa acgatctgac ccctgaacaa aaggtcgctg ccgcagccct gctggctcca 840
gcagctgccg ctatcgttgc tggtccaaaa caaaattgcg aacctgattt aatgccttac 900
gcaagacctt tcgctgtcgg aaagagaacc tgttcaggaa ttgttactcc t 951
<210> 2
<211> 317
<212> PRT
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
<400> 2
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys
20 25 30
Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe
35 40 45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys
50 55 60
Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr
65 70 75 80
Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn
85 90 95
Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln
100 105 110
Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu
115 120 125
Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu
130 135 140
Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro
180 185 190
Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys
195 200 205
Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His
210 215 220
Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
225 230 235 240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr
245 250 255
Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly
275 280 285
Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe
290 295 300
Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
305 310 315
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttacctagtg gttccgaccc 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggagtaaca attcctgaac agg 23
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcaggaatt gttactcctc accaccacca ccaccactga 40
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcggaaccac taggtaagcc atcgccggct 30
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
cttccnnstg gcaacaaacc acgg 24
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
gttgccanns ggaaggagcg g 21
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 9
cagacgaann sgttcagcct caagttag 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 10
gctgaacnns ttcgtctgta gctgagta 28
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 11
tctggcaann saccacgggt tcagct 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 12
cgtggtnnst tgccagacgg aaggag 26
Claims (9)
1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述脂肪酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列第157位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸，第189位的异亮氨酸突变为赖氨酸，且第154位的缬氨酸突变为天冬氨酸而获得。
2.一种如权利要求1所述的脂肪酶突变体的编码基因。
3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组载体。
4.一种包含权利要求2所述编码基因的基因工程菌。
5.如权利要求1所述的脂肪酶突变体在拆分(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯制备单一对映体(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的应用。
6.如权利要求4所述的基因工程菌在拆分(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯制备单一对映体(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的应用。
7.一种拆分(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯制备单一对映体(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯的方法，其特征在于，包括：在缓冲溶液中，以(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯为底物，权利要求1所述脂肪酶突变体或权利要求4所述基因工程菌为生物催化剂，进行不对称水解反应，得到单一对映体(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液的pH值为6～9，浓度为0.05～0.2M。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，反应体系中，反应温度为25～35℃，反应时间为10～16h。
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