CN111607631B - 一种(s)-邻氯苯甘氨酸甲酯酶法合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种(S)‑邻氯苯甘氨酸甲酯酶法合成方法，所述方法为：以(R,S)‑邻氯苯甘氨酸甲酯为底物，以水解酶为催化剂，以pH 5‑9的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20‑40℃、100‑200rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，获得(S)‑邻氯苯甘氨酸甲酯；所述水解酶包括蛋白酶CES P‑1、蛋白酶6SD、固定化蛋白酶CES P‑1或固定化蛋白酶6SD。本发明固定化酶酶活回收率达95.91％，且可稳定使用15批次；固定化蛋白酶在三相体系中直接一步法不对称拆分(R,S)‑邻氯苯甘氨酸甲酯，底物浓度从2g/L提高至12g/L，最终可以获得29.26％光学纯(S)‑邻氯苯甘氨酸甲酯。

Description

一种(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯酶法合成方法
技术领域
本发明涉及酶固定化、酶催化、生化反应工程领域，具体涉及蛋白酶的固定化技术和固定化蛋白酶在三相体系中对映选择性生物拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的方法。
背景技术
氯吡格雷是一类用于治疗动脉粥样硬化、中风和心脑血管等疾病的药物，能选择性地与血小板表面腺苷酸环化酶偶联的ADP受体结合，不可逆地抑制血小板活化，从而达到抑制血小板聚集的作用。第一代药物以氯吡格雷硫酸氢盐的形式销售。但后续研究发现，仅S-构型的氯吡格雷能有效抑制人体内血小板凝集，R-构型氯吡格雷用药后会导致抽搐副作用。因此，目前氯吡格雷均要求以单一S-构型上市销售。
(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯是氯吡格雷的合成前体，化学名为2-氨基-2-(2-氯苯基)乙酸甲酯。传统的化学拆分工艺以(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯为底物，通过手性试剂如酒石酸或樟脑磺酸与其发生化学反应，将外消旋体的一对对映体转化为非对映异构体，再利用非对映异构体物理性质的差异将其分步结晶分离，从而获得光学纯(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯。该工艺存在手性拆分剂价格昂贵、废盐量大以及生产时间长等问题，是非环境友好型生产方式。
近年来，生物催化由于具有反应条件温和、光学纯度高、环境友好等优点在手性生物合成中的应用越来越广泛，因此，开发生物法选择性拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的技术具有巨大的经济效益和社会效益。目前已有一些专利文献报道利用酶选择性拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备(S)-邻氯苯甘氨酸，但都需要对底物(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯进行复杂的保护和脱保护，过程繁琐，得率低，不利于工业化应用。以(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯为手性源合成(S)-氯吡格雷具有更高的原子经济性，然而，酶法一步直接拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯究报道很少。2014年薛屏等人使用固定化青霉素G酰化酶选择性拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，反应30h后，底物转化率为62.5％，ee值为98％，E值为9.4，该反应反应时间长，且青霉素G酰化酶的立体选择性一般。
碱性蛋白酶在碱性条件下催化蛋白质分子水解为肽和氨基酸，细菌和芽孢杆菌是碱性蛋白酶的重要来源。近年来，研究人员发现，碱性蛋白酶具有与脂肪酶相似的酯水解能力，这可能与碱性蛋白酶与脂肪酶具有相同催化三联体(天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸)有关。
固定化能改善酶的催化性能，相较于游离酶，固定化酶在保持高催化能力的同时，还可以反复利用，这大大提高了酶的使用率、降低了催化剂在生产成本中的比重。近年来，多壁碳纳米管因其尺寸小、表面积大、机械强度好，制备得到的固定化酶具有很高的催化能力和操作稳定性，在酶的固定化方面有巨大的应用潜力。
针对邻氯苯甘氨酸甲酯和邻氯苯甘氨酸的溶解性差异(邻氯苯甘氨酸甲酯易溶于有机溶剂，难溶于水且在水溶液中易自发水解；邻氯苯甘氨酸易溶于水溶液)，本发明发明一种由固定化酶、甲基叔丁基醚、磷酸钠缓冲液组成的三相反应体系(固-液-液)，并利用固定化蛋白酶在三相体系中一步法不对称拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备光学纯(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，该方法不仅有效提高了邻氯苯甘氨酸甲酯的溶解度，还有利于产物的下游分离提取。
发明内容
本发明目的是提供一种(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯酶法合成方法，本发明从一系列蛋白酶、脂肪酶中筛选得到对(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯具有高活性和高对映选择性的蛋白酶6SD，并通过戊二醛将蛋白酶6SD与氨基化多壁碳纳米管共价结合进行固定化，利用该固定化蛋白酶6SD在三相反应体系(固定化酶-磷酸盐缓冲液-甲基叔丁基醚)中一步对映选择性拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备光学纯(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，解决了游离酶热稳定性差、操作稳定性不佳、无法重复利用等问题，以及(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯在水溶液中溶解度差和易自发水解的难题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯酶法合成方法，所述方法为：以(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯为底物，以水解酶为催化剂，以pH 5-9的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20-40℃、100-200rpm(优选30℃、200rpm)条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯。所述水解酶包括蛋白酶CES P-1、蛋白酶6SD、固定化蛋白酶CES P-1或固定化蛋白酶6SD；所述转化体系中，底物加入量以缓冲液体积计为2-14g/L(优选6g/L)，催化剂加入量以缓冲液体积计为1-20g/L(优选10g/L)。
进一步，所述反应介质由有机溶剂与缓冲液以体积比1:4-20(v/v)组成，所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、己烷、甲基叔丁基醚或环己烷中的一种，优选甲基叔丁基醚。
更进一步，优选所述反应介质由甲基叔丁基醚与pH 8.0、100mM的磷酸钠缓冲液以体积比1:9(v/v)组成。
进一步，所述催化剂为固定化蛋白酶6SD，所述固定化蛋白酶6SD是通过戊二醛将氨基化多壁碳纳米管与蛋白酶6SD共价结合得到的，制备过程如图2所示，具体按如下方法制备：(1)将戊二醛加入pH 5.0-9.0缓冲液(优选100mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液)并用磷酸氢二钠调节pH至7.8-8.2，制成体积浓度1-5％的戊二醛溶液；将载体加入体积浓度1-5％戊二醛溶液中，于10-35℃、200-300rpm(优选15℃、200rpm)水浴摇床中恒温孵育1h后，12000rpm离心10min，弃滤液，滤饼即为预处理后的载体；所述载体包括氨基树脂、环氧树脂或多壁碳纳米管，优选氨基化多壁碳纳米管，长度为8-15nm，外直径为50μm；所述戊二醛溶液体积用量以载体重量计为100mL/g；
(2)将蛋白酶6SD酶粉溶于pH 5-9缓冲液中(优选100mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液)，再加入预处理后的载体，于10℃-35℃、200-300rpm水浴摇床中恒温孵育12-36h后(优选15℃、200rpm、24h)，12000rpm离心10min弃滤液，沉淀用磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)清洗两次，获得固定化蛋白酶6SD；所述预处理后载体与蛋白酶6SD酶粉质量比为1:0.1-1.0(w/w)，优选1:0.4(w/w)；所述缓冲液体积用量以预处理后载体质量计为100mL/g。
本发明固定化蛋白酶6SD在甲基叔丁基醚-磷酸钠缓冲液三相体系(固相-水相-有机相)中一步法对映选择性拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，有效解决(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯在水溶液中溶解度差和易自发水解的问题，反应式如图1所示。与现已报道的生物手性拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯技术相比，本发明直接采用(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯为底物，革除了保护和脱保护反应，简化了实验步骤，且最终获得光学纯(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，提高了后续制备(S)-氯吡格雷化学反应的原子经济性。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供了氨基化多壁碳纳米管固定蛋白酶6SD的方法，得到的固定化酶酶活回收率达95.91％，且可稳定使用15批次；构建了固定化酶—磷酸钠缓冲液—甲基叔丁基醚三相反应体系，在该三相体系中，底物溶解度从2g/L提高至12g/L；利用开发的固定化蛋白酶在三相体系中直接一步法不对称拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯工艺，最终可以获得29.26％光学纯(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯。该方法不仅反应条件温和、产物光学纯度高、绿色环保，而且革除了邻氯苯甘氨酸甲酯的保护与去保护反应，为生物法合成(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯提供新技术。
附图说明
图1是蛋白酶6SD催化对映选择性拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的反应示意图。
图2是由蛋白酶6SD通过戊二醛与氨基化多壁碳纳米管共价结合制备固定化酶的流程图。
图3是(R,S)-邻氯苯甘氨酸(A)和(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯(B)的标准曲线。
图4是氨基化多壁碳纳米管(A)和固定化蛋白酶6SD(B)的透射电镜图。
图5是氨基化多壁碳纳米管、蛋白酶6SD和固定化蛋白酶6SD样品的红外光谱图。
图6是蛋白酶6SD储存稳定性：A.游离蛋白酶6SD；B.固定化蛋白酶6SD。
图7是固定化蛋白酶6SD的操作稳定性：A.不同反应批次制备的产物ees值；B.不同反应批次固定化酶的相对活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。
本发明实施例中(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯浓度是基于缓冲液体积计算的。本发明游离蛋白酶6SD购自天野酶制剂有限公司，酶活60000U/g(pH 8.0条件下)。本发明所述多壁碳纳米管，长度为8-15nm，外直径为50μm，其中氨基化多壁碳纳米管购自阿拉丁生化科技股份有限公司，长度为8-15nm，外直径为50μm。
实施例1：手性选择性酯水解酶的筛选
将0.1g不同的商品酶(表1)，终浓度6g/L(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，加入10mL磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)中构成转化体系，于30℃、200rpm下反应1.5h后，取200μL的反应液，加入800μL的体积浓度50％甲醇水溶液灭活脂肪酶后，用0.22μm膜进行过滤，取滤液采用高效液相色谱检测底物和产物峰面积，根据标准曲线计算底物和产物浓度。在考察商品酶催化底物水解能力的同时，设置不添加酶的空白对照组，结果见表1，蛋白酶6SD具有较高的催化能力及较好的对映选择性。
液相检测方法：采用Agilent 1260Infinity II高效液相色谱仪器，液相色谱柱为手性柱Daicel Crownpack CR(+)(0.4×15cm)，流动相为10mM高氯酸水溶液(pH为1.0-2.0)，流速为0.8mL·min-1，柱温为25℃，紫外检测波长为220nm，(R)-邻氯苯甘氨酸、(S)-邻氯苯甘氨酸、(R)-邻氯苯甘氨酸甲酯和(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的保留时间分别为4.279min，8.150min，17.626min和31.518min。
分别用10mL容量瓶配制0.5、1.0、1.5、2.0g/L的(R,S)-邻氯苯甘氨酸和1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L的(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯标准溶液，经高效液相色谱检测，得到(R,S)-邻氯苯甘氨酸的标准曲线，示于图3中A，标准曲线方程为：y＝4756.8x-236.2(R2>0.99)；(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的标准曲线示于图3中B，标准曲线方程为：y＝2999.4x+231.5(R2>0.99)。
底物的对映体过量值(ees)，底物总转化率(C)的计算分别见等式(1)和(2)。底物的对映选择性表示为E值，并通过总转化率和对映体过量来计算，如公式(3)所示。(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的收率(y)计算公式见(4)。所有实验操作至少进行3次，取3次实验的平均值，标准偏差小于2.0％。
ees＝{([S]-[R])/([S]+[R])}×100％ (1)
Figure BDA0002571464640000052
E＝ln[(1-C)(1-ees)]/ln[(1-C)(1+ees)] (3)
y＝{[S]/([R]0+[S]0)}×100％ (4)
其中，ees代表底物的对映体过量值(％)；[R]和[S]分别是(R)-邻氯苯甘氨酸甲酯和(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的浓度；[R]0和[S]0是(R)-邻氯苯甘氨酸甲酯和(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的初始浓度；C为(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的总转化率；y是(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的收率(％)。
表1蛋白酶/脂肪酶筛选
Figure BDA0002571464640000051
Figure BDA0002571464640000061
注：a表示通过高效液相检测确定构型。
实施例2：游离蛋白酶6SD在水相中对映选择性拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯
1、反应温度对生物拆分效率的影响
取0.2g的蛋白酶6SD粉末，终浓度6g/L的(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，加入10mL磷酸钠缓冲液(pH 8.0，100mM)中构成转化体系，20-40℃、180rpm恒温水浴反应1.5h，采用实施例1方法检测，结果示于表2，游离蛋白酶6SD催化该反应的最适温度为30℃。
表2温度对蛋白酶6SD不对称拆分反应的影响
Figure BDA0002571464640000062
2、反应pH值对生物拆分效率的影响
缓冲液采用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(100mM，pH 5.0-6.0)、磷酸钠缓冲液(100mM，pH 6.0-8.0)和Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 9.0)。取0.2g的蛋白酶6SD粉末，终浓度6g/L的(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，加入10mL不同pH缓冲液中构成转化体系，30℃、180rpm恒温水浴反应1.5h，采用实施例1方法检测，结果示于表3，游离蛋白酶6SD催化该反应的最适pH为8.0。
表3 pH对游离蛋白酶6SD不对称拆分反应的影响
Figure BDA0002571464640000063
3、底物浓度对生物拆分效率的影响
取0.2g的蛋白酶6SD粉末，不同终浓度的(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，加入10mL磷酸钠缓冲液(pH 8.0，100mM)中构成转化体系，30℃、180rpm恒温水浴反应1.5h，采用实施例1方法检测，结果示于表4，(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯在水相中的最大溶解度为6g/L，最适底物浓度为2g/L。
表4底物浓度对蛋白酶6SD不对称拆分反应的影响
Figure BDA0002571464640000071
实施例3：固定化载体筛选
氨基树脂预处理：每10g氨基树脂加入100mL的磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)，25℃、300rpm恒温震荡15min后，测pH，维持pH 7.8-8.2，1h后滤干，加入50mL，含质量浓度2％的戊二醛的磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)中，25℃、300rpm恒温震荡1h，抽滤，用去离子水洗涤至水清为止，获得预处理后的氨基树脂。
环氧树脂预处理：每10g环氧树脂，用50mL蒸馏水浸泡12h，抽滤，取滤饼，即为预处理的树脂，4℃保存备用。
阴离子交换树脂预处理：阴离子交换树脂先用蒸馏水洗涤浸泡12h以上；接着用NaOH(1M)浸泡2h以上，用去离子水洗涤，直至pH达到7.0，抽滤；进一步用HCl(1M)浸泡2h以上，用去离子水洗涤，直至pH达到7.0，抽滤；最后用NaOH(1M)浸泡2h以上，用去离子水洗涤，直至pH达到7.0，抽滤，即为预处理后阴离子交换树脂，4℃保存备用。
多壁碳纳米管的预处理：每0.1g多壁碳纳米管加入10mL的磷酸钠缓冲液(100mMpH 8.0)，25℃、200rpm恒温震荡1h后，12000rpm离心10min后弃滤液，加入5mL、含质量浓度2％的戊二醛的磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)，25℃、300rpm恒温震荡1h，12000rpm离心10min后弃滤液，即为预处理后多壁碳纳米管，4℃保存备用。
称取0.1g的蛋白酶6SD酶粉溶于10mL磷酸钠缓冲液中(100mM，pH 8.0)，再加入经过预处理的载体0.1g(表5)，25℃、300rpm恒温水浴固定24h后，12000rpm离心10min，弃滤液，沉淀用磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)清洗两次，即获得固定化蛋白酶6SD，检测酶活，并计算固定化酶活力与相对酶活回收率，结果见表5，氨基化多壁碳纳米管的固定化效率最高。
酶活测定催化体系：0.1g固定化蛋白酶6SD，6g/L(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，10mL磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)，于30℃、200rpm的水浴摇床中反应5min后，取样200μL，并加入800μL的体积浓度50％甲醇水溶液终止反应，12000rpm离心10min后，采用实施例1方法进行液相检测。
酶活定义：在30℃、pH 8.0下，每分钟每生成1微摩尔(R,S)-邻氯苯甘氨酸所需的酶量，用U表示。
酶活回收率和单位酶活定义如下：
Figure BDA0002571464640000081
Figure BDA0002571464640000082
相对酶活基于相同酶量的游离酶的活性，指定为100％。
表5不同载体对蛋白酶6SD的固定化效果
Figure BDA0002571464640000083
注：-表示没有检测到酶活。
实施例4：固定化蛋白酶的表征
1、预处理后的氨基化多壁碳纳米管：将戊二醛加入磷酸钠缓冲液(100mM，pH8.0)并用磷酸氢二钠调节pH至8.0，制成体积浓度2.5％的戊二醛溶液。称取0.1g氨基化多壁碳纳米管加入体积浓度2.5％戊二醛溶液10mL中，于15℃、200rpm水浴摇床中恒温震荡1h后，12000rpm离心10min，弃滤液，滤饼即为预处理后的氨基化多壁碳纳米管0.1g。
2、称取0.1g的蛋白酶6SD酶粉溶于10mL磷酸钠缓冲液中(100mM，pH 8.0)，再加入0.1g预处理后的氨基化多壁碳纳米管，置于15℃、200rpm水浴摇床中恒温孵育24h后，12000rpm离心10min弃滤液，沉淀用磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)清洗两次，制得固定化蛋白酶6SD。
3、透射电子显微镜观察：为了验证蛋白酶成功固定于氨基化多壁碳纳米管，采用日本日立公司的HF-3300型透射电子显微镜，对步骤2制备的固定化蛋白酶6SD进行了包括形态和形状在内的表面形态分析，结果示于图4，固定酶后的氨基化多壁碳纳米管直径明显变粗，推测酶与载体通过戊二醛交联后附着在管壁外侧，导致固定化后直径变大，也说明酶并没有交联到载体空隙内部。
4、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析：在ThermoFisher Nicolet 6700FT-IR光谱仪上采集蛋白酶6SD，氨基化多壁碳纳米管和固定化蛋白酶6SD的特征峰，测量范围为4000-400cm-1，结果示于图5，酶、戊二醛、载体之间形成的酰胺键C＝O拉伸振动的特征谱带出现在1654.6cm-1。大约在3200-3400cm-1会出现的酰胺官能团的N-H拉伸振动，固定化酶在3400.8cm-1处出现，而游离蛋白酶6SD在3451.3cm-1处出现，两者略有偏移，从而证实了酰胺的形成，表明蛋白酶6SD、戊二醛、载体之间共价结合，酶被成功地固定于氨基化多壁碳纳米管上。
实施例5：固定化条件优化
将实施例3筛选得到的氨基化多壁碳纳米管(长度为8-15nm，外直径为50μm)作为载体用于蛋白酶6SD的固定化。
1、固定化温度的优化
分别称取0.1g的蛋白酶6SD酶粉溶于10mL磷酸钠缓冲液中(100mM，pH 8.0)，再加入0.1g预处理后的氨基化多壁碳纳米管(同实施例4方法制备)，分别置于不同温度(10℃-35℃)下，于200rpm水浴摇床中恒温孵育24h后，12000rpm离心10min弃滤液，沉淀用磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)清洗两次，即获得不同温度下的固定化蛋白酶。采用实施例4方法检测蛋白酶6SD固定化情况，采用实施例3方法测定固定化蛋白酶6SD的酶活和酶活回收率，结果如表6所示，最适固定化温度为15℃。
表6温度对固定化效率的影响
Figure BDA0002571464640000101
2、固定化pH的优化
分别称取0.1g的蛋白酶6SD酶粉溶于10mL不同pH(5.0-9.0)缓冲液中，再加入0.1g预处理后的氨基化多壁碳纳米管(同实施例4方法制备)，分别置于15℃、200rpm水浴摇床中恒温孵育24h后，12000rpm离心10min弃滤液，沉淀用磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)清洗两次，获得不同pH下的固定化蛋白酶。采用实施例4方法检测蛋白酶6SD固定化情况，采用实施例3方法测定固定化蛋白酶6SD的酶活和酶活回收率，结果如表7所示，最适固定化pH为8.0。
缓冲溶液分别为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(100mM，pH 5.0-6.0)、磷酸钠缓冲液(100mM，pH 6.0-8.0)和Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 9.0)。
表7 pH对固定化效率的影响
Figure BDA0002571464640000102
3、酶投加量的优化
分别称取不同量(0.030g、0.035g、0.040g、0.045g、0.050g)的蛋白酶6SD酶粉溶于10mL磷酸钠缓冲液中(100mM，pH 8.0)，再加入0.1g预处理后的氨基化多壁碳纳米管(同实施例4方法制备)，分别置于15℃、200rpm水浴摇床中恒温孵育24h后，12000rpm离心10min弃滤液，沉淀用磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)清洗两次，获得不同载酶量下的固定化蛋白酶。采用实施例4方法检测蛋白酶6SD固定化情况，采用实施例3方法测定固定化蛋白酶6SD的酶活和酶活回收率，结果如表8所示，最适酶投加量为400mg/g载体。
表8酶基于载体的投加量对固定化效率的影响
Figure BDA0002571464640000111
4、戊二醛浓度的优化
预处理后的氨基化多壁碳纳米管：戊二醛加入磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)，并用磷酸氢二钠调节pH至8.0，配置体积浓度1-5％的戊二醛溶液。称取0.1g氨基化多壁碳纳米管分别加入到以上不同浓度的戊二醛溶液10mL中，于15℃、200rpm水浴摇床中恒温孵育1h后，12000rpm离心10min，弃滤液，滤饼即为预处理后的氨基化多壁碳纳米管0.1g。
称取0.1g的蛋白酶6SD酶粉溶于10mL磷酸钠缓冲液中(100mM，pH 8.0)，再加入0.1g不同浓度的戊二醛溶液处理过的氨基化多壁碳纳米管，于15℃、200rpm水浴摇床中恒温孵育24h后，12000rpm离心10min，弃滤液，沉淀用磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)清洗两次，获得固定化蛋白酶。采用实施例4方法检测蛋白酶6SD酶固定化情况，采用实施例3方法测定固定化蛋白酶6SD的酶活和酶活回收率，采用实施例1方法测定E值，结果如表9所示，最适戊二醛浓度为2.5％。
表9戊二醛浓度对固定化效率的影响
Figure BDA0002571464640000112
注：E值根据实施例1公式(3)计算。
5、固定化时间的优化
分别称取0.1g的蛋白酶6SD酶粉溶于10mL磷酸钠缓冲液中(100mM，pH 8.0)，再加入0.1g预处理后的氨基化多壁碳纳米管(同实施例4方法制备)，于15℃、200rpm水浴摇床中分别恒温孵育12-36h后，12000rpm离心10min，弃滤液，沉淀用磷酸钠缓冲液(100mM，pH8.0)清洗两次，获得不同固定化时间下的固定化蛋白酶。采用实施例4方法检测蛋白酶6SD酶固定化情况，采用实施例3方法测定固定化蛋白酶6SD的酶活和酶活回收率，结果如表10所示，最适固定化时间为24h。
表10固定化时间对固定化效率的影响
Figure BDA0002571464640000121
综上所述，最佳固定化条件为：酶投加量为400mg·g-1，缓冲液为100mM,pH 8.0的磷酸钠缓冲液，戊二醛浓度为2.5％，在15℃的水浴摇床中以200rpm的转速固定24h，得到的固定化蛋白酶6SD，具体为：称取0.04g的蛋白酶6SD酶粉溶于10mL磷酸钠缓冲液中(100mM，pH 8.0)，再加入0.1g预处理后的氨基化多壁碳纳米管(同实施例4方法制备)，于15℃、200rpm水浴摇床中分别恒温孵育24h后，12000rpm离心10min，弃滤液，沉淀用磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)清洗两次，获得固定化蛋白酶6SD，回收率为95.91％，单位酶活为69.47U·g-1。
实施例6：固定化蛋白酶6SD的温度稳定性研究
分别将0.2g游离蛋白酶6SD和实施例5中最佳固定化条件下制备的固定化蛋白酶6SD 0.5g，溶于50mL磷酸钠缓冲液中(pH 8.0，100mM)，分别置于温度4℃(低温)、25℃(常温)、30℃(最适反应温度)、45℃(高温)下保温40天，每隔2天取样，采用实施例3方法检测酶活，以未经保温处理的初始游离蛋白酶6SD所测得的酶活为100％。将相对酶活力取对数后和时间拟合，根据公式计算酶的半衰期(t1/2)，计算公式如下：
Figure BDA0002571464640000122
Figure BDA0002571464640000123
其中，[E]代表t时刻酶的活力，[E]0是初始酶活力，Ki为失活常数，t为时间(天)。结果如图6所示，固定化蛋白酶6SD在4℃、25℃、30℃、45℃下半衰期t1/2分别为86.32d、26.08d、15.36d和3.53d，相较于游离酶的14.37d、5.75d、4.12d、0.46d，固定化显著提升蛋白酶6SD的热稳定性。
实施例7：固定化蛋白酶6SD在三相体系中对映选择性拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯
1、三相体系的构建：将1mL不同的有机溶剂(二氯甲烷、乙酸乙酯、己烷、甲基叔丁基醚和环己烷)分别与9mL的磷酸钠缓冲液(pH 8.0，100mM)混合形成两相体系，加入终浓度为6g/L的(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，再加入0.1g的实施例5中最佳固定化条件下制备的固定化蛋白酶6SD，混合后在30℃、200rpm的水浴摇床中开始反应2h后，分别取180μL水相液体和20μL有机相液体，有机相液体通过氮气流除去有机溶剂后与180μL水相液体混合，加入800μL的体积浓度50％甲醇水溶液稀释后进行HPLC检测(检测条件同实施例3)，计算底物转化率和ees值，结果如表11所示，甲基叔丁基醚作为有机相时催化效果最佳。
表11有机相溶剂对底物转化率及ees的影响
Figure BDA0002571464640000131
2、优化两相体系中有机相/水相的比例：将甲基叔丁基醚与磷酸钠缓冲液(pH8.0，100mM)分别以体积比1:20、1:10、1:6、1:5、1:4混合形成两相体系10mL。向10mL两相体系中加入终浓度为6g/L的(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，0.1g的实施例5中最佳固定化条件下制备的固定化蛋白酶6SD，混合后在30℃、200rpm的水浴摇床中开始反应2h后，取样，采用液相检测底物转化率和ees值(同步骤1)，结果如表12所示，当有机相/水相比例为1:10(v/v)时，ees>96％，(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯收率>29％。
表12有机相/水相体积比对底物转化率及ees的影响
Figure BDA0002571464640000132
Figure BDA0002571464640000141
3、水相pH的优化：将1mL甲基叔丁基醚与9mL不同pH缓冲液(pH5.0-9.0)混合形成两相体系10mL。向10mL两相体系中，分别加入终浓度为6g/L的(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，0.1g的实施例5中最佳固定化条件下制备的固定化蛋白酶6SD，混合后在30℃、200rpm的水浴摇床中开始反应2h后，取样，采用液相检测底物转化率和ees值(同步骤1)，结果如表13所示，当水相pH为8.0时，催化效果最佳。
缓冲液包括柠檬酸缓冲液(pH 5.0，100mM)，磷酸钠缓冲液(pH 6.0-8.0，100mM)和Tris-HCl缓冲液(pH 9.0，100mM)。
表13水相pH对固定化酶不对称拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的影响
Figure BDA0002571464640000142
4、反应温度的优化：将1mL甲基叔丁基醚与9mL磷酸钠缓冲液(pH 8.0，100mM)混合形成两相体系10mL。向10mL两相体系中，加入终浓度为6g/L的(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，0.1g的实施例5中最佳固定化条件下制备的固定化蛋白酶6SD，混合后在20-40℃、200rpm的水浴摇床中开始反应2h后，取样，采用液相检测底物转化率和ees值(同步骤1)，结果如表14所示，当反应温度为30℃时，催化效果最佳。
表14温度对固定化酶不对称拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的影响
Figure BDA0002571464640000143
5、固定化酶添加量的优化：将1mL甲基叔丁基醚与9mL磷酸钠缓冲液(pH 8.0，100mM)混合形成两相体系10mL。向10mL两相体系中加入终浓度为6g/L的(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，不同量(0.04g、0.06g、0.08g、0.1g、0.12g)的实施例5中最佳固定化条件下制备的固定化蛋白酶6SD，混合后在30℃、200rpm的水浴摇床中开始反应2h后，取样进行液相检测底物转化率和ees值(同步骤1)，结果如表15所示，当固定化酶添加量为10g·L-1时，催化效果最佳。
表15固定化酶添加量对不对称拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的影响
Figure BDA0002571464640000151
6、底物浓度的优化：将1mL甲基叔丁基醚与9mL磷酸钠缓冲液(pH 8.0，100mM)混合形成两相体系10mL。向10mL两相体系中加入终浓度为2-14g/L的(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，0.1g的实施例5中最佳固定化条件下制备的固定化蛋白酶6SD，混合后在30℃、200rpm的水浴摇床中开始反应2h后，取样，采用液相检测底物转化率和ees值(同步骤1)，结果如表16所示，当底物浓度为2g/L时，催化效果最佳，(R)-邻氯苯甘氨酸甲酯在2小时内几乎被完全转化为(R)-邻氯苯甘氨酸，ees值>99.0％，得到光学纯(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，收率29.26％。
表16底物浓度对固定化酶不对称拆分反应的影响
Figure BDA0002571464640000152
实施例7：固定化蛋白酶不对称拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯操作稳定性研究
根据实施例6的描述，在优化后的三相反应体系中采用多批式反应考察固定化蛋白酶的操作稳定性。
将1mL甲基叔丁基醚与9mL磷酸钠缓冲液(pH 8.0，100mM)混合形成两相体系10mL。向10mL两相体系中加入终浓度为6g/L的(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，0.1g的实施例5中最佳固定化条件下制备的固定化蛋白酶6SD，混合后在30℃、200rpm的水浴摇床中开始反应2h后，12000rpm离心10min回收固定化酶并用10mL磷酸钠缓冲液(pH 8.0,100mM)洗涤3次，用于除去脱落的酶分子及固定化蛋白酶上粘附的底物和产物，然后进行下一批次反应。每批次反应后，取样进行液相检测底物转化率和ees值(同步骤1)，如图7所示。该图显示，固定化蛋白酶在前15批次的使用中表现出很好的催化性能，每批次(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的转化率在70％左右，ees值>80％，酶活力保留87％以上。在第16和17个反应批次中酶活分别降低了17.0％和21.2％，固定化酶具有良好的操作稳定性。

Claims (10)

1.一种(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯酶法合成方法，其特征在于所述方法为：以(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯为底物，以水解酶为催化剂，以pH 5-9的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20-40℃、100-200rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯；所述水解酶为蛋白酶6SD或固定化蛋白酶6SD。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述底物加入量以缓冲液体积计为2-14g/L，催化剂加入量以缓冲液体积计为1-20g/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应介质由有机溶剂与缓冲液以体积比1:4-20组成，所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、己烷、甲基叔丁基醚或环己烷中的一种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应介质由甲基叔丁基醚与pH 8.0、100mM的磷酸钠缓冲液以体积比1:9组成。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述催化剂为固定化蛋白酶6SD。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述固定化蛋白酶6SD按如下方法制备：(1)将戊二醛加入pH 5.0-9.0缓冲液并用磷酸氢二钠调节pH至7.8-8.2，制成体积浓度1-5％的戊二醛溶液；将载体加入体积浓度1-5％戊二醛溶液中，于10-35℃、200-300rpm浴摇床中恒温孵育1h后，离心，弃滤液，滤饼即为预处理后的载体；所述载体包括氨基树脂、环氧树脂或多壁碳纳米管；
(2)将蛋白酶6SD酶粉溶于pH 5-9缓冲液中，再加入预处理后的载体，于10℃-35℃、200-300rpm水浴摇床中恒温孵育12-36h后，离心，弃滤液，沉淀用100mM、pH 8.0磷酸钠缓冲液清洗后，获得固定化蛋白酶6SD。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(1)所述戊二醛溶液体积用量以载体重量计为100mL/g。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(1)所述载体为氨基化多壁碳纳米管。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述氨基化多壁碳纳米管长度为8-15nm，外直径为50μm。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(2)所述预处理后载体与蛋白酶6SD酶粉质量比为1:0.1-1.0；所述缓冲液体积用量以预处理后载体质量计为100mL/g。
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