CN111662898A - 一种脂肪酶固定化新技术及其应用于对映体拆分的方法 - Google Patents
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Abstract
本专利介绍了一种采用物理吸附法制备固定化酶(PCL@ZIF‑8)，并将其应用于催化水解2‑苯基丙酸异丁酯制备(S)‑2‑苯基丙酸和酯交换外消旋1‑苯乙醇制备(S)‑1‑苯乙醇。在选择性催化水解2‑苯基丙酸异丁酯中，反应前2 h，固定化酶的反应速率为游离脂肪酶的3倍，反应平衡时，底物的单一转化率为92.33%，产物光学纯度为99.62%，循环4次后，固定化后的脂肪酶仍保持了良好的催化活性。在选择性催化酯交换1‑苯乙醇中，固定化脂肪酶催化效率比游离酶略高，且展现了优异的重复使用性能，循环6次后，依然保持其初始活性的69.33%。与游离脂肪酶相比，该固定化酶展现了优异的催化效率，且具有良好的重复使用性能。MOFs具有合成简单、种类丰富、稳定性好等优点，是一种潜在的固定化酶载体，在工业应用中具有广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，利用生物催化法制备光学纯手性化合物，利用物理吸附法将游离的洋葱假单胞菌脂肪酶(PCL)固定在沸石咪唑骨架材料(ZIF-8)，制备固定化酶(PCL@ZIF-8)。将PCL@ZIF-8作为生物催化剂立体选择性催化水解拆分2-苯基丙酸对映体和酯交换拆分1-苯乙醇对映体。
背景技术
2-芳基丙酸类药物是一种非甾体抗炎药，具有优异的抗炎，解热和镇痛作用。一般来说，(S)-对映体的药理活性比(R)-对映体高，副作用少。如(S)-布洛芬的抗炎镇痛作用是(R)-布洛芬的100倍；(S)-氟比洛芬的药效是(R)-氟比洛芬30倍。2-苯基丙酸(PPA)，是合成多种2-芳基丙酸类药物的重要中间体，因此，手性拆分PPA对映体对制备光学纯(S)-2-芳基丙酸类药物具有重要意义。手性醇是一类可用于合成多种治疗心血管、高血压等疾病的药物。1-苯乙醇是一种重要药物合成前体。(S)-1-苯乙醇可用于合成盐酸舍曲林，可治疗抑郁症的相关症状，还可用于合成哮喘和免疫增强药物。(R)-1-苯乙醇可用于合成抑制胆固醇吸收的药物。因此，制备单一的1-苯乙醇对映体在医药工业中具有重要意义。
单一对映体制备方法，主要包括不对称合成法和外消旋体拆分法两类。不对称合成法是通过控制反应条件，合成目标单一对映体。外消旋体拆分法是通过分离外消旋体而得到单一对映体，包括结晶拆分法、色谱法、膜拆分法和手性溶剂萃取法等。不对称合成法的优势在于可以直接得到手性纯的对映体，原子经济性高，但是不对称合成法通常需要手性源、手性助剂和手性试剂，经济成本较高，对环境依赖较大，并且合成的产物光学纯度不高。相比不对称合成法，外消旋体拆分法主要是通过物理、化学或生物等方法实现外消旋体的高效拆分，从而获得高光学纯度的单一对映体，并且开发时间较短，操作比较简便，操作成本较低，目前工业上制备单一对映体主要采用拆分法。酶拆分法具有条件温和，选择性高，副反应少，杂质成分少，产率高，反应操作简单等优点，并且污染少，很大程度降低了化工生产对环境造成的影响，符合绿色化学理念。目前，工业上制备光学纯醇类和胺类化合物最普遍的方法是酶拆分法，但是游离酶具有难以分离、稳定性差和无法重复使用等缺陷。酶固定化技术能有效提高酶的稳定性、增强酶活性和拓展操作范围，是解决游离酶缺陷的有效策略之一。
固定化可能导致酶的物理化学性质发生改变，而所选用的载体和固定化方法是导致这些变化的关键因素。针对酶的固定化已经被广泛报道，可供选用的载体较多，如溶胶-凝胶基质、水凝胶、有机微粒以及介孔二氧化硅等。但这些载体都存在一定的缺陷，如溶胶-凝胶基质容易导致酶变性，且底物在其内部传质受限；由于易发生膨胀和降解，固定于水凝胶、有机微粒上的酶容易流失、变性，且传质效率低；介孔二氧化硅虽然具有多方面的优点，但也存在结构无法合理设计，表面容易发生改变从而使酶变性或流失等问题。
与上述载体相比，金属有机框架化合物(MOFs)作为一类新型固定化载体日益受重视。MOFs具有高比表面积、孔体积，容易调节的孔道尺寸，方便调变的金属节点和配体，良好的热稳定性以及较温和的合成条件等优点。同时，由于节点和配体可以形成丰富多样的几何连接，MOFs具有丰富多样的结构，且其结构可针对具体的应用进行设计和调节。ZIF-8是沸石咪唑骨架材料中的一种，具有沸石拓扑结构。相比于一般的MOFs材料，ZIF-8除了具有MOFs的基本优点以外，还具有更加优良的热稳定性和水溶液稳定性。
本发明利用物理吸附法将洋葱假单胞菌脂肪酶固定在ZIF-8空腔内(PCL@ZIF-8)，利用PCL@ZIF-8优异的催化活性和立体选择性，在水相中催化水解拆分外消旋体2-苯基丙酸异丁酯，制备高光学活性的(S)-2-苯基丙酸和(R)-2-苯基丙酸异丁酯（式1）；此外，使用PCL@ZIF-8在有机相中催化酯交换拆分外消旋体1-苯乙醇，制备高光学活性的(S)-1-苯乙醇和(R)- 1-苯乙醇乙酸酯（式2）。本方法将PCL@ZIF-8与游离 PCL进行了活性对比，PCL@ZIF-8具有更高的催化活性，且保持高的立体选择性。PCL@ZIF-8在水相和有机相中都具有优良的分散性和稳定性，并且易于分离和重复使用，显著降低生产成本。该技术解决了游离酶在酶拆分法中所存在的无法重复使用，难以分离产物与酶及反应时间长的问题，同时该方法反应条件温和、绿色环保、操作简便；
式1. 脂肪酶催化拆分2-苯基丙酸异丁酯对映体
式2. 脂肪酶催化拆分1-苯乙醇对映体。
发明内容
本发明提出了一种采用物理吸附法将洋葱假单胞菌脂肪酶固定在ZIF-8空腔内(PCL@ZIF-8)，并将PCL@ZIF-8应用于催化水解拆分2-苯基丙酸对映体和酯交换拆分1-苯乙醇对映体。研究了在两种体系中催化性能，获得了优异的产率和纯度。游离脂肪酶通过固定化之后，显著提高了脂肪酶的热稳定性、催化活性和重复使用性。
本发明的技术方案：本发明以Zn(NO3)2•6H2O为金属离子中心， 2-甲基咪唑为有机配体，DMF为反应介质，制备了ZIF-8晶体；然后以ZIF-8为固定化载体，在磷酸缓冲液中，通过物理吸附法将洋葱假单胞菌脂肪酶固定在ZIF-8空腔内。在水解拆分2-苯基丙酸对映体反应中，以磷酸缓冲液作为反应介质，以外消旋2-苯基丙酸异丁酯作为底物，2-苯基丙酸异丁酯对映体的浓度为5-20 mmol/L，加入2-20 mg/mL PCL@ZIF-8作为生物催化剂，在温度25-70oC下，搅拌和加热反应一定时间。反应结束后，取一定量的样品通过高效液相色谱仪对产物进行定性和定量检测，并计算底物转化率和对映体过剩量。在酯交换拆分1-苯乙醇对映体反应中，以正己烷作为反应介质，以外消旋1-苯乙醇和乙酸乙烯酯作为反应底物，将其底物溶解在正己烷中，1-苯乙醇的浓度为10-40 mmol/L，乙酸乙烯酯浓度为100-600mmol/L，加入2-20 mg/mL PCL@ZIF-8作为生物催化剂，在温度范围为20-50oC下，于25mL的封闭反应管体系中搅拌、加热反应一定时间。反应结束后，取一定量的样品通过高效液相色谱仪对产物进行定性和定量检测，并计算底物转化率和对映体过剩量。
本发明相比现有技术有如下优势：
本发明利用介孔ZIF-8作为固定化载体，通过简单的物理吸附法，成功制备PCL@ZIF-8。由于PCL@ZIF-8是一种多孔材料，它可以吸附底物，降低传质阻力，以PCL@ZIF-8作为反应催化剂时，可以改善脂肪酶不稳定、活性不高、与产物难以分离等缺陷，同时获得高产率和高纯度的目标产物。同时，由于PCL@ZIF-8既不溶于水相，又不溶于有机相，PCL@ZIF-8具有良好的重复使用性能。本方法实施操作简便，绿色环保，产物易于分离，催化剂重复使用率高。
【具体实施方案】
本发明具体的方法步骤如下：
一、测试与分析
在水解学拆分2-苯基丙酸对映体反应中，产物的光学纯度和底物转化率采用美国Waters 1525高效液相色谱仪分析，Inertsil ODS-3 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)。流动相组成为V(乙腈)：V(水)=20：80流速为1 mL/min，UV检测波长为225 nm，柱温为25.0oC，进样量10 μL。在酯交换拆分1-苯乙醇对映体反应中，产物的光学纯度和底物转化率采用美国Waters 1525高效液相色谱仪分析，Chiralcel® OJ-RH手性柱 (250 mm × 4.6mm, 5 μm)。流动相组成为V(甲醇)：V(水)=20：80，流速为0.5 mL/min，UV检测波长为210nm，柱温为25.0oC，进样量10 μL。
二、实施例
实施例1
将7.5 mmol Zn(NO3)2•6H2O和2.5 mmol 2-甲基咪唑加入到圆底烧瓶中，再以600 mLDMF为反应介质，将圆底烧瓶放入到超声清洗器中，超声至固体完全溶解，再将圆底烧瓶放入到油浴锅中，在140oC下，反应10-24 h，最后进行抽滤，得到ZIF-8晶体。将300 mL含1600mg的洋葱假单胞菌脂肪酶溶液加入到锥形瓶中，再加入400 mg的ZIF-8，在25oC温度下振荡12-24 h，离心分离，用去离子水洗涤，再进行冷冻干燥，得到固定化酶。
实施例2
在10 mL反应管中，加入0.02 mmol外消旋2-苯基丙酸异丁酯对映体，再加入25 mg固定化酶或5mg游离脂肪酶作为催化剂，以2 mL磷酸缓冲液（pH=6，0.1mmoL/L）为反应溶液，在55oC、400 rpm下反应 16 h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和底物对映体过剩量进行分析。分析结果表明：以游离脂肪酶为催化剂的反应中，(S)-2-苯基丙酸的产率为46.29%，底物的对映体过剩量为99.09%；以固定化酶为催化剂的反应中，(S)-2-苯基丙酸的产率为79.07%，底物的对映体过剩量为99.67%。
实施例3
在10 mL反应管中，加入0.02 mmol外消旋2-苯基丙酸异丁酯对映体，再加入25 mg固定化酶或5mg游离脂肪酶作为催化剂，以2 mL磷酸缓冲液（pH=6，0.1mmoL/L）为反应溶液，在55oC、400 rpm下反应 2 h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和底物对映体过剩量进行分析。分析结果表明：以游离脂肪酶为催化剂的反应中，(S)-2-苯基丙酸的产率为9.47%，底物的对映体过剩量为99.23%；以固定化酶为催化剂的反应中，(S)-2-苯基丙酸的产率为28.35%，底物的对映体过剩量为99.54%。
实施例4
在25 mL反应管中，分别加入0.06 mmol 外消旋1-苯乙醇对映体和0.3 mmol 乙酸乙烯酯，再加入25 mg 固定化酶或5mg游离脂肪酶作为催化剂，以3mL正己烷作为反应介质，在500 rpm、37oC条件下反应6 h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和底物的对映体过剩量进行分析。分析结果表明：以游离脂肪酶为催化剂的反应中，(R)-1-苯乙醇的转化率为74.53%，底物的对映体过剩量为99.59%；以固定化酶为催化剂的反应中，(R)-1-苯乙醇的转化率为70.76%，底物的对映体过剩量为99.24%。
实施例5
在25 mL反应管中，分别加入0.06 mmol 外消旋1-苯乙醇对映体和0.3 mmol 乙酸乙烯酯，再加入25 mg 固定化酶或5mg游离脂肪酶作为催化剂，以3mL正己烷作为反应介质，在500 rpm、37oC条件下反应10 h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和底物的对映体过剩量进行分析。分析结果表明：以游离脂肪酶为催化剂的反应中，(R)-1-苯乙醇的转化率为82.49%，底物的对映体过剩量为99.09%；以固定化酶为催化剂的反应中，(R)-1-苯乙醇的转化率为89.19%，底物的对映体过剩量为99.43%。
实施例6
在10 mL反应管中，加入0.02 mmol外消旋2-苯基丙酸异丁酯对映体和25 mg固定化酶，再加入2 mL磷酸缓冲液（pH=6，0.1mmoL/L），在55oC、400 rpm下反应 28 h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对产率和产物对映体过剩量进行分析。再将反应体系固液分离，固体部分冷冻干燥后回收固定化酶PCL@ZIF-8，再在相同条件下进行催化反应。分析结果表明：反应重复二次后，(S)-2-苯基丙酸的产率为67.74%，底物的对映体过剩量为98.16%；反应重复四次后，(S)-2-苯基丙酸的产率为28.22%，底物的对映体过剩量为98.35%。
实施例7
在25 mL反应管中，分别加入0.06 mmol 外消旋1-苯乙醇对映体和0.3 mmol 乙酸乙烯酯，再加入25 mg 固定化酶，以3mL正己烷作为反应介质，在500 rpm、37oC条件下反应10 h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对产率和产物对映体过剩量进行分析。再将反应体系固液分离，固体部分冷冻干燥后回收固定化酶PCL@ZIF-8，再在相同条件下进行催化反应。分析结果表明：反应重复四次后，(R)-1-苯乙醇的转化率为76.16%，底物的对映体过剩量为98.55%；反应重复六次后，(R)-1-苯乙醇的转化率为56.01%，底物的对映体过剩量为99.49%。
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但其技术范围不受限于以上实施方式。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做各种改进并实施，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种应用于手性对映体拆分的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述的方法是通过物理吸附法把脂肪酶固定在沸石咪唑骨架材料(ZIF-8)空腔内，并将该固定化酶用于催化水解拆分2-苯基丙酸对映体和酯交换拆分1-苯乙醇对映体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包含下述操作步骤：
在合成固定化酶过程中，选择合适的酶溶液浓度，加入一定量的ZIF-8，在一定的温度下振荡反应一定时间，反应结束后，过滤并冷冻干燥得到固定化酶；在用固定化酶催化水解拆分2-苯基丙酸对映体中，选择选择合适pH值的磷酸缓冲液为反应介质，加入一定量的外消旋2-苯基丙酸异丁酯，再向反应管中投加一定量的固定化酶作为催化剂，在一定的温度下搅拌反应一定时间，反应结束后，取一定体积的反应液进行检测；在用固定化酶催化酯交换拆分1-苯乙醇对映体中选择一种有机溶剂作为反应介质，加入一定量的外消旋1-苯乙醇和乙酸乙烯酯，再向反应管中投加一定量的固定化酶作为生物催化剂，在一定的温度下搅拌反应一定时间，反应结束后，取一定体积的反应液稀释，取样进行检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在合成固定化酶过程中，所述酶溶液浓度为2-20 mg/mL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在合成固定化酶过程中，所述ZIF-8的浓度范围为1-10 mg/mL。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在合成固定化酶过程中，固定化反应温度为5-40oC。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在合成固定化酶过程中，吸附振荡时间为12-24 h。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，拆分2-苯基丙酸对映体中，所述2-苯基丙酸异丁酯的浓度为5-20 mmol/L，固定化酶的浓度为2-20 mg/mL，pH范围为3-8，反应温度为25-70oC，反应时间为1-40 h。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，拆分1-苯乙醇对映体中，所述1-苯乙醇的浓度为10-40 mmol/L，乙酸乙烯酯浓度为100-600 mmol/L，固定化酶的浓度为2-20 mg/mL，反应温度为20-50oC，反应时间为1-30 h。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，固定化酶可重复利用，操作步骤为：反应结束后，过滤将固定化酶从反应介质中分离，固定化酶经冷冻干燥后重复使用。
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