CN109486897A - 一种立体选择性酶催化水解拆分2-苯基丙酸对映体的方法 - Google Patents
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Abstract
本专利公开了一种高效拆分2‑苯基丙酸对映体的方法。应用脂肪酶较高活性和立体选择性的特性,在单一水相体系中催化水解外消旋2‑苯基丙酸酯获得(S)‑2‑苯基丙酸和(R)‑2‑苯基丙酸酯,实现了2‑苯基丙酸对映体的拆分。洋葱假单胞菌脂肪酶和荧光假单胞菌脂肪酶均表现出优异的立体选择性,其产物的光学纯度均>99%,而洋葱假单胞菌脂肪酶表现出更高的活性,转化率>45%。与他拆分技术相比,该方法反应条件温和,操作简单,无溶剂污染,产物纯度高,成本低等优势。
Description
技术领域
本发明属于手性分离技术领域,特别涉及一种通过脂肪酶立体选择性催化水解拆分2-苯基丙酸的方法。
背景技术
上世纪90年代以来,随着人们对药品安全的重视,手性药物进入市场的种类和销售额呈逐年稳定而迅速增长态势。手性药物的疗效是原来消旋药物的几倍甚至几十倍,且副作用较小。另外,与研制新药相比,开发手性药物风险小、周期短、耗资少、成果显著。目前,制备手性药物的方法主要有不对称合成法和外消旋拆分法两种。通常,不对称合成法比较费时又不经济。目前工业上仍以外消旋拆分法为主,包括结晶法,色谱法,膜拆分法,萃取法,酶或微生物法等。
2-苯基丙酸作为一种结构简单的手性芳基丙酸,是合成多种芳基丙酸类消炎镇痛药的中间体。研究表明,其(S)-对映体比(R)-对映体更具活性且副作用少。例如,(S)-布洛芬的抗炎镇痛作用是(R)-布洛芬的100倍,(S)-氟比洛芬是(R)-氟比洛芬的30倍。因此,手性拆分2-苯基丙酸制备单一(S)-2-苯基丙酸对映体在手性制药工业中具有重要意义。目前,已有文献报道用色谱法和萃取法拆分2-苯基丙酸,但色谱法费用高、制备规模小,萃取法选择性较低,有机溶剂易污染环境。 Gilligan报道用TG328修饰的腈水合酶制备(S)-2-苯基丙酸,但是该方法采用两步法,操作过程较为复杂。先用腈水合酶将(R,S)-2-苯基丙腈转化为(R,S)-2-苯基丙酰胺,然后用立体选择性酶催化(R,S)-2-苯基丙酰胺,得到(S)-2-苯基丙酸。针对上述拆分方法的缺点,本文应用脂肪酶在单一水相体系中选择性水解2-苯基丙酸酯,实现了2-苯基丙酸的拆分。该方法不仅立体选择性高、产率高,而且反应条件温和、操作简便、无溶剂污染,大大降低了化工污染对人类生活的影响,符合绿色环保的可持续发展理论,有较好的发展前景。
发明内容
本发明的目的是提出一种拆分2-苯基丙酸对映体的方法。针对其他外消旋体拆分法所存在的产物光学纯度不高,反应条件苛刻,溶剂污染等难题,提出应用脂肪酶在单一水相体系中立体选择性催化水解2-苯基丙酸酯,实现拆分2-苯基丙酸对映体的目的。
本发明采用的技术方案是:
(1)合成外消旋酯:一定量的2-苯基丙酸和不同的醇以摩尔比1:1在甲苯溶剂中反应,对甲基苯磺酸为催化剂,反应温度为110 °C,反应12小时。反应液用饱和NaHCO3溶液洗涤两次(2×20 mL),再用去离子水洗涤至中性,用无水MgSO4干燥,抽滤,旋转蒸发得到浅黄色2-苯基丙酸酯液体。
(2)在反应管中加入一定量的缓冲溶液,以外消旋2-苯基丙酸酯为反应底物,加入一定量的脂肪酶,在一定温度下,加热搅拌反应一定时间,反应结束后,取一定量的样品通过高效液相色谱仪对产物进行定性和定量检测,并计算产物光学纯度和底物转化率。其反应方程如式1:
式1脂肪酶催化水解拆分2-苯基丙酸
其中,R表示-CH3、-C2H5、-n-C4H9、-iso-C4H9、-n-C5H11、-iso-C5H11、-C6H13 -C7H15、-C8H17。
所述脂肪酶选自褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶A、南极假丝酵母脂肪酶B、荧光假单胞菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、米曲霉、疏棉状嗜热胞菌脂肪酶、米黑根毛脂肪酶、雪白根霉。优选洋葱假单胞菌脂肪酶。
所述缓冲溶液选自磷酸氢二钠和磷酸、乙酸铵和乙酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和盐酸缓冲对水溶液。优选磷酸氢二钠和磷酸缓冲溶液。
本发明相比现有技术有如下优势:
本发明利用脂肪酶较高的催化活性和立体选择性的特性,在单一水相体系中拆分2-苯基丙酸,得到高光学纯度的产物(S)-2-苯基丙酸。相比于其他拆分方法,该方法反应条件温和,操作简单,无溶剂污染,且光学纯度≥99.59%,转化率≥45.56%。
【具体实施方案】
本发明具体的方法步骤如下:
一、测试与分析
本发明所述实施例中产物的光学纯度和底物转化率采用美国Waters 1525高效液相色谱仪分析,Inertsil® ODS-3色谱柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm))。流动相组成为V甲醇:V水=20:80,其中水相含0.5%(v:v)乙酸和25 mmol/L的羟丙基-β-环糊精,水相pH = 4.0(用三乙胺调节)。流速为1.0 mL/min,UV检测波长为225 nm,柱温为25 °C,进样量10 μL;产物光学纯度用对映体过剩量值(ee p )评价,按下式计算:
反应转化率(c)按下式计算:
其中,下标0表示初始值。
二、实施例
实施例1
将0.020 mmol的外消旋2-苯基丙酸甲酯置于10 mL反应管中,以1 mL的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(pH = 6.0)为反应介质,分别加入20 mg不同的商品化脂肪酶,在800 rpm、55 °C条件下反应18 h。反应结束后,将产物过滤,用高效液相色谱进行分析。结果表明:当以洋葱假单胞菌脂肪酶和荧光假单胞菌脂肪酶为催化剂时,其ee p 分别为98.96%,98.64%,转化率分别为32.27%,22.02%。
实施例2
将0.020 mmol不同种类的外消旋2-苯基丙酸酯置于10 mL反应管中,以1 mL的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(pH =6.0)为反应介质,加入20 mg洋葱假单胞菌脂肪酶,在800 rpm、55°C条件下反应18 h。反应结束后,将产物过滤,用高效液相色谱进行分析。结果表明:底物为2-苯基丙酸异丁酯时,其ee p 为99.4%,c为41.59%。
实施例3
将0.020 mmol不同种类的外消旋2-苯基丙酸酯置于10 mL反应管中,以1 mL的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(pH =6.0)为反应介质,加入20 mg荧光假单胞菌脂肪酶,在800 rpm、55°C条件下反应18 h。反应结束后,将产物过滤,用高效液相色谱进行分析。结果表明:底物为2-苯基丙酸庚酯时,其ee p 为99.33%,c为36.50%。
实施例4
将0.020 mmol的外消旋2-苯基丙酸异丁酯置于10 mL反应管中,以1 mL的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(pH = 6.0)为反应介质,加入20 mg洋葱假单胞菌脂肪酶,在800 rpm、50 °C条件下反应18 h。反应结束后,将产物过滤,用高效液相色谱进行分析。结果表明:其ee p 为98.18%,c为29.92%。
实施例5
将0.020 mmol的外消旋2-苯基丙酸异丁酯置于10 mL反应管中,以1 mL的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(pH = 5.5)为反应介质,加入20 mg洋葱假单胞菌脂肪酶,在800 rpm、55 °C条件下反应18 h。反应结束后,将产物过滤,用高效液相色谱进行分析。结果表明:其ee p 为99.15%,c为26.42%。
实施例6
将0.030 mmol的外消旋2-苯基丙酸异丁酯置于10 mL反应管中,以1 mL的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(pH = 6.0)为反应介质,加入5 mg洋葱假单胞菌脂肪酶,在800 rpm、55 °C条件下反应18 h。反应结束后,将产物过滤,用高效液相色谱进行分析。结果表明:其ee p 为99.40%,c为41.33%。
实施例7
将0.030 mmol的外消旋2-苯基丙酸异丁酯置于10 mL反应管中,以1 mL的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(pH = 6.0)为反应介质,加入20 mg洋葱假单胞菌脂肪酶,开始反应,在800rpm、55 °C条件下反应26 h。反应结束后,将产物过滤,用高效液相色谱进行分析。结果表明:其ee p 为99.59%,c为45.56%。
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但其技术范围不受限于以上实施方式。对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,可以做各种改进并实施,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种采用脂肪酶立体选择性催化水解外消旋2-苯基丙酸酯拆分2-苯基丙酸对映体的方法。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包含下述操作步骤:在单一水相体系中,加入一定量的外消旋2-苯基丙酸酯和脂肪酶,在一定温度下搅拌反应一定时间;反应结束后,将产物过滤并用高效液相色谱进行分析。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述水相体为缓冲溶液。缓冲溶液是选自磷酸氢二钠、乙酸铵、三羟甲基氨基甲烷(Tris),分别用磷酸、乙酸、盐酸调pH。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,反应底物为2-苯基丙酸甲酯、2-苯基丙酸乙酯、2-苯基丙酸丁酯、2-苯基丙酸异丁酯、2-苯基丙酸戊酯、2-苯基丙酸异戊酯、2-苯基丙酸己酯、2-苯基丙酸庚酯、2-苯基丙酸辛酯。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述脂肪酶选自褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶A、南极假丝酵母脂肪酶B、荧光假单胞菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、米曲霉、疏棉状嗜热胞菌脂肪酶、米黑根毛脂肪酶、雪白根霉等类型的脂肪酶。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,反应温度为45 °C-70 °C。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,缓冲溶液的pH值为4.0-8.0。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,脂肪酶的用量为5-40 mg/mL。
9.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,每1m L反应介质,外消旋体底物的投加量为0.01-0.05 mmol。
10.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,水解反应的时间为1-36 h。
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