CN100489085C - 一种红酵母细胞以及生产光学纯手性仲醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红酵母细胞(Rhodotorula sp.ECU316-1)，保藏号为CGMCC1735，以及生产光学纯手性仲醇的方法。采用本发明的红酵母细胞生产光学纯手性仲醇，具有显著的优点，底物的转化率可达到95%以上，能够合成高光学纯度(＞99%)的手性仲醇，且催化剂易于制备、反应条件温和、底物适应性广，具有很好的工业应用开发前景。

Description

一种红酵母细胞以及生产光学纯手性仲醇的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一种红酵母细胞以及生产光学纯手性仲醇的方法。

技术背景

光学活性手性仲醇是手性药物，如(R)-硝苯洛尔、(R)-托莫西汀，以及其它手性化学品合成的重要中间体。目前通常采用的手性仲醇制备方法包括：消旋醇或酯的对映选择性拆分以及潜手性酮的不对称还原。如文献生物加工过程，2005，3(3)：1-8所介绍的方法。

酯酶或脂肪酶催化的外消旋仲醇的对映选择性酯化或转酯化拆分以及外消旋酯的对映选择性水解拆分是制备光学活性手性仲醇最常用的方法，这种方法的主要优点在于：目前商品脂肪酶的种类较多，针对特定的底物，能比较容易地选出具有高活力和高对映选择性的酶。但该方法有一个最大的缺点，即目标对映体产物的最高收率不超过50％。另外，对于脂肪酶催化的外消旋酯水解拆分，必须事先合成外消旋的底物酯，对于工业化生产而言，不仅增加了操作步骤，而且增加了额外的成本。

潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇的重要方法，该方法在理论上能将底物酮100％地转化为单一对映体的手性醇，具有较高的工业应用价值。化学法对潜手性酮的不对称还原通常使用手性氨基醇或过渡金属配合物等作为催化剂，用化学还原剂实现酮的还原。化学法催化的酮不对称还原虽然具有较高的产率，但其主要缺点是反应的立体选择性往往不够理想，产品的光学纯度常常不能达到制药行业的要求，而且手性催化剂的制备和回收比较困难，价格比较昂贵。

生物法催化的潜手性酮不对称还原具有立体专一性高的优势，还原产物仲醇的光学纯度通常很高。生物法催化酮不对称还原所使用的生物催化剂一般包括脱氢酶制剂和微生物活性整细胞。使用分离纯化的脱氢酶制剂催化酮的不对称还原，操作简单，没有副反应，产物提取方便，但其最大缺点是反应体系中需要额外添加还原型辅酶NADH或NADPH，而这些辅酶非常昂贵，难以用于大规模产品生产。目前虽然已报道了一些双酶耦合的体外辅酶再生系统，但其大规模应用还有很多问题有待解决。而使用活性整细胞催化酮的还原相对要方便得多，细胞体内存在完整的辅酶再生系统，只需加入适量的辅底物(如葡萄糖或乙醇等)，即可进行辅酶的自发循环再生，无须额外添加价格昂贵的还原型辅酶，并且整细胞的使用可以免去酶的提取纯化过程，更适合于工业规模生产。

面包酵母是一种常用的生物还原催化剂，但是面包酵母细胞内含有多种立体选择性不同甚至完全相反的羰基还原酶组分，当应用于潜手性酮的不对称还原反应时，其产物手性仲醇的光学纯度往往比较低。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种红酵母细胞以及生产光学纯手性仲醇的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的红酵母细胞(Rhodotorula sp.ECU316-1)是一种属于红酵母属的菌种，该菌种是从上海植物园的土壤中分离，并经过多轮紫外诱变筛选后获得的，于2006年6月14日在中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC1735。

本发明的菌种具有如下的微生物学特征：

1.形态特征：

(1)细胞的形态和大小：卵形，2.3～5.0×4.0～10.0μm；

(2)掷胞子的形成：无；

2.在各种培养基上的生长状态：

(1)牛肉浸膏琼脂平板培养(30℃，36小时)

菌落形状：圆形；

菌落表面隆起：平滑、有光泽、菌落粘稠

大小：2～4mm；

色调：粉红色。

(2)牛肉浸膏明胶穿刺培养(20℃，6天)

不液化明胶

3.生理生化特征：

(1)硝酸盐利用(28℃，5天)：能利用；

(2)胞外类淀粉化合物产生：不产生；

(3)尿素水解：阳性

(4)甲基红试验：阴性；

(5)对氧的需求：好气；

(6)高渗培养基耐受性：能耐受含20％NaCl的高渗培养基

(7)碳源同化

阳性：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、淀粉和肌醇

阴性：乳糖

(8)碳源发酵：不发酵碳源

(9)生长pH范围：5.0～8.0；

(10)生长最适宜温度：25～35℃；

根据文献：“酵母菌的特征与鉴定手册”提供的鉴定方法和上述的试验结果表明，该细胞属于红酵母菌类群，但又与以前报道的红酵母细胞有明显的不同，其主要不同之处在于：一般的红酵母细胞不能耐受高渗培养基，而本发明的红酵母细胞能耐受高渗培养基，并且对许多底物的对映选择性有显著提高，如催化还原产物对硝基苯乙醇的ee值由原先的96％提高到高于99％。

本发明的红酵母Rhodotorula sp.ECU316-1可以用于生产光学纯手性仲醇，包括如下步骤：

(1)对红酵母Rhodotorula sp.ECU316-1进行摇瓶培养：

培养基配方为：葡萄糖10～30g/L，酵母膏0～20g/L，蛋白胨0～20g/L，KH₂PO₄ 1～5g/L，NaCl 1～10g/L，MgSO₄ 0.5～5g/L，pH6～8，摇瓶装液量为10～30％，基于培养基的体积，接种量为2～10％，培养温度为25～40℃，摇床转速为100～200rpm，培养时间为15～30hr。

(2)发酵罐培养：

培养基配方与摇瓶培养基配方相同，发酵罐装液量以体积计为60～80％，基于培养基的体积的2～10％的比例接入种子液。培养温度为25～40℃，通气量为0.5～1.5vvm，搅拌转速为300～600rpm，发酵时间为20～35hr。离心收获细胞。

(3)直接用红酵母整细胞或将其固定化后作为生物催化剂，置于水或水与有机溶剂的两相体系中，催化底物酮的不对称还原，然后从反应产物中收集还原产物——光学纯的手性仲醇，具体包括如下步骤：

将红酵母整细胞或固定化后的红酵母细胞置于水、缓冲液或水与有机溶剂的两相体系中，使细胞浓度为50～500g(湿重)/L，加入羰基底物，羰基底物浓度为10～200mM，反应温度为25～40℃，反应时3～48小时，并通过薄板层析监测反应进行的程度，待反应完成后，从反应产物中收集还原产物——光学纯的手性仲醇，转化率可达到95％以上。

所说的羰基底物的结构通式为：R₁COR₂；

其中R₁和R₂分别代表-CH₃，-CH₂CH₃，-CH₂X，-CH₂CH₂X，-C₆H₅，-C₆H₄X，且R₁和R₂不相同；X代表F，Cl，Br，I，OH，NH₂，NO₂，N₃；

优选的羰基底物选自苯环、甲基取代的苯乙酮衍生物、乙酰吡啶衍生物、α-酮酯或β-酮酯；

所说的缓冲液可选用pH为6-8的磷酸钾缓冲液或Tris-HCl缓冲液；

所说的有机溶剂选自环己烷、正己烷、正庚烷、异辛烷、异丙醚、甲基叔丁基醚或甲苯等溶剂其中的一种，有机相与水相的体积比为1:5至5:1；

所说的固定化后的红酵母细胞是海藻酸钙包埋的红酵母细胞，制备方法如下：

将红酵母湿细胞与海藻酸钠水溶液混合，湿细胞终浓度为10～30％，海藻酸钠终浓度为2～4％。将混合物逐滴滴入浓度为0.05～0.2M的CaCl₂溶液中，凝固成球。生成的固定化细胞凝胶颗粒在8～12mM CaCl₂溶液中固化10～12小时，储存备用。

按照本发明优选的方法，反应体系中可以添加帮助底物分散的表面活性剂，优选的表面活性剂为吐温-80，加入量为反应体系质量的0.2％～5％。

采用本发明的红酵母细胞生产光学纯手性仲醇，具有显著的优点，底物的转化率可达到95％以上，能够合成高光学纯度(>99％)的手性仲醇，而且催化剂易于制备、反应条件温和、底物适应性广，具有很好的工业应用开发前景。

具体实施方式

实施例1

培养基配方为：葡萄糖15g/L，酵母膏7.5g/L，蛋白胨7.5g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO₄ 0.5g/L，pH 7.0。121℃高温灭菌20min。

取4℃保存的红酵母斜面菌种，挑取一环接种至装有50ml培养基的250ml摇瓶中，在30℃下，160rpm振摇培养20hr，按5％的接种量转接至盛有100ml培养基的500ml摇瓶中，于160rpm、30℃继续培养20hr，离心收获细胞。发酵液酶活力约为20U/L，细胞浓度约40g(湿重)/L，单位细胞的酶活为0.5U/g湿细胞。

细胞活力单位定义为：30℃，pH 7.0的条件下，每分钟催化苯乙酮还原生成1.0μmol苯乙醇所需的细胞量。

实施例2

发酵培养基配方：葡萄糖30g/L，酵母膏15g/L，蛋白胨15g/L，KH₂PO₄ 2.0g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO₄ 0.5g/L，调节pH为7.0。121℃高温灭菌20min。

种子液培养基同实施例1。挑取斜面菌种，分别接种至装100ml培养基的500ml摇瓶中，在30℃，160rpm振摇培养20hr，按5％的接种量转接至盛有3L发酵培养基的5L搅拌发酵罐中，通气量为3.0L/min，培养温度恒定为30℃，搅拌转速为400rpm。发酵培养30h，离心收获细胞。发酵液酶活力为79.5U/L。

实施例3

在50g湿细胞中加入100ml生理盐水(0.9％NaCl溶液)，悬浮调匀，随后与预先加热溶解的海藻酸钠溶液混合，加水定容至250ml，搅拌均匀，海藻酸钠终浓度为2.5％(w/v)。将此混合物逐滴滴入0.1M的CaCl₂溶液中，凝固成球。生成的固定化细胞凝胶颗粒在10mM CaCl₂溶液中固化12h，然后储存于4℃，待用。

实施例4～13

红酵母整细胞催化苯乙酮衍生物的不对称还原

取12g红酵母湿细胞悬浮于100mL磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.0)中，分别加入1.0mmol不同结构的底物羰基化合物，反应混合物在30℃，160rpm条件下在恒温摇床上振摇反应，间歇取样测定反应转化率，转化完全时结束反应。8,000×g离心8min，上清液用乙酸乙酯萃取，萃取液加无水硫酸钠干燥后旋转蒸发除去溶剂，用硅胶柱层析法纯化粗产品，用手性气相、液相色谱或通过比旋光度的测定分析产物的光学纯度。反应结果以及产物的构型和光学纯度如下表所示。

实施例14～16

红酵母整细胞催化乙酰吡啶的不对称还原：

取12g红酵母湿细胞悬浮于100mL磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.0)中，分别加入10.0mmol的羰基底物乙酰吡啶，反应混合物在30℃，160rpm条件下在恒温摇床上振摇反应，间歇取样测定反应转化率，转化完全时结束反应。8,000×g离心8min，上清液用乙酸乙酯萃取，萃取液加无水硫酸钠干燥后旋转蒸发除去溶剂，用硅胶柱层析法纯化粗产品，用手性气相色谱分析产物的光学纯度。反应结果以及产物的构型和光学纯度如下表所示。

实施例17～23

红酵母整细胞催化α-酮酯以及β-酮酯的不对称还原：

取12g红酵母湿细胞悬浮于100mL磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.0)中，分别加入不同浓度的α-酮酯或β-酮酯，反应混合物在30℃，160rpm条件下在恒温摇床上振摇反应，间歇取样测定反应转化率，转化率达到100％时结束反应。8,000×g离心8min，上清液用乙酸乙酯萃取，萃取液加无水硫酸钠干燥后旋转蒸发除去溶剂，用硅胶柱层析法纯化粗产品，用手性气相、液相色谱或通过比旋光度的测定分析产物的光学纯度。反应结果以及产物的构型和光学纯度如下表所示。

实施例24

取15g红酵母湿细胞，放在500ml摇瓶中，加入含有1g葡萄糖的100ml磷酸钾缓冲液(50mM，pH7.o)重新悬浮细胞，加入100ml异辛烷和0.6ml苯乙酮，在恒温摇床上，恒温30℃，160rpm条件下振摇反应30h，获得(S)-1-苯乙醇，转化率为96％。

实施例25

取100g海藻酸钙包埋固定化细胞，放在500ml摇瓶中，加入200ml Tris-HCl缓冲液(50mM，pH7.0)，2g葡萄糖，1.2ml苯乙酮和0.4g吐温-80，在恒温摇床上，恒温30℃，160rpm反应24h，获得(S)-1-苯乙醇，转化率为95％。

实施例26

在2L搅拌反应器中，加入200g红酵母湿细胞，1.0L自来水，10g葡萄糖，6ml苯乙酮，2g吐温-80，反应温度恒定为30℃，搅拌转速为300rpm，反应17h，获得(S)-1-苯乙醇，转化率98％。

用500ml乙酸乙酯萃取反应液，重复两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，旋转蒸发浓缩，浓缩液过硅胶柱分离，洗脱液比例为：石油醚/乙酸乙酯＝5：1，合并含有产物苯乙醇的洗脱液，旋转蒸发除去溶剂，得产品5.1g。以手性气相色谱分析，产物的光学纯度为99.1％ee。

Claims (7)

1.一种红酵母细胞(Rhodotorula sp.)，保藏号为CGMCC1735。

2.一种以红酵母细胞催化剂制备光学纯手性仲醇的方法，其特征在于：该方法包括先培养保藏号为CGMCC1735的红酵母细胞(Rhodotorula sp.)，然后再将培养所得的红酵母细胞或将其固定化之后置于水、或者缓冲液、或者水与有机溶剂的两相体系中，加入羰基底物，催化羰基底物的不对称还原，然后从反应产物中收集还原产物——光学纯的手性仲醇；

所说的羰基底物的结构通式为：R₁COR₂；其中R₁和R₂分别代表-CH₃，-CH₂CH₃，-CH₂X，-CH₂CH₂X，-C₆H₅，-C₆H₄X，且R₁和R₂不相同；X代表F，Cl，Br，I，OH，NH₂，NO₂，N₃；

所说的有机溶剂选自环己烷、正己烷、正庚烷、异辛烷、异丙醚、甲基叔丁基醚或甲苯中的一种，有机相与水相的体积比为1:5至5:1。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，水、或者缓冲液、或者水与有机溶剂的两相体系中，细胞浓度为50～500g湿重/L。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，羰基底物浓度为10～200mM。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，反应温度为25～40℃，反应时间为3-48小时，所说的缓冲液pH为6-8。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的固定化是指海藻酸钙包埋。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，反应体系中添加吐温-80，加入量为反应体系质量的0.2％～5％。