CN1333068C - 生物催化制备(s)－4－氯－3－羟基丁酸酯的菌种和方法 - Google Patents
生物催化制备(s)－4－氯－3－羟基丁酸酯的菌种和方法 Download PDFInfo
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一株产高立体选择性羰基还原酶的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)CGMCC No.1244，以及利用该出芽短梗霉菌催化不对称还原反应生产手性卤代羟基丁酸酯的微生物转化方法。该方法在优化条件下发酵产酶，游离酶或其固定化细胞用于4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)的不对称还原，生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)；在单一水相体系中微生物酶催化不对称还原COBE生成的(S)-CHBE对映体过量值达到97%e.e.，在水/溶剂双相体系中，通过供给能量物质，连续补加底物，可以获得高光学纯度、高反应产率、高产物浓度，更主要的是在整个反应过程中不需要添加辅酶。
Description
所属领域
本发明涉及一株产高立体选择性羰基还原酶的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)CGMCC No.1244，以及利用该出芽短梗霉菌催化不对称还原反应生产手性卤代羟基丁酸酯的微生物转化方法。
背景技术
4-氯-3-羟基丁酸乙酯(ethyl 4-chloro-3-hydroxybutyrate，CHBE或ECHB)是一种重要的有机中间体，分子中有多功能基团，其手性单一对映异构体体(R)和(S)-CHBE均是非常有前景的重要的手性砌块，还可经由氯基的置换反应、还原等反应，导入所需的手性药物中间体。(R)-CHBE可用于合成L-肉碱及1，4-二氢吡啶类β-阻滞剂等，(S)-CHBE可用于很多活性药物的合成，如他汀类药物——羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和4-羟基吡咯烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等。
由于4-氯乙酰乙酸乙酯(ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate/ethyl4-chloroacetoacetate，COBE/ECAA/CAAE)易于合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获取手性CHBE是非常经济有效的制备途径。而且反应产物(S)-CHBE不易为微生物代谢利用，用微生物活细胞催化方法制备(S)-CHBE非常有利。
目前所知的从COBE还原为手性醇的方法主要有三条路径：
1、化学催化剂不对称还原法：所用催化剂包括铑、钌等金属的价格昂贵，另外的问题是产物立体选择性不够高，催化还原反应需要很高的氢气压，耗能高；
2、酶催化不对称还原法，用提取纯化后的酶(商品酶)如乙醛还原酶等进行不对称还原，缺点是需要添加昂贵的辅酶；
3、微生物催化不对称还原法，即通过完整的微生物细胞(如面包酵母)的立体选择性生物催化来实现，但要筛选获得高立体选择性的优良微生物菌株比较困难；同时也需要添加辅酶，并不断供给能量物质，另外还有底物对菌体的毒性及在水溶液中的不稳定性问题。
技术方案
本发明的目的是提供一种产高立体选择性羰基还原酶的微生物新菌株，提供一种新的能有效催化不对称还原反应生产手性卤代羟基丁酸酯的方法，并利用该微生物菌株催化COBE不对称还原，以获得高光学纯度、高反应产率、高产物浓度的(S)-CHBE。
本发明的能有效催化不对称还原反应生产手性卤代羟基丁酸酯的微生物新菌株，在麦芽汁琼脂培养基上，菌落初期粘稠，白色，之后转变为淡绿色，长时间放置后变成黑色皮革状，菌落边缘呈明显的丝状。从细胞形态上观察，该菌具有酵母型及菌丝型形态特征。培养初期的幼龄菌丝通常壁薄，透明，分隔，隔距较长。菌丝分枝，菌丝的各处均可出芽形成出芽型的分生孢子，分生孢子形状为细长的椭圆形；通常二次分生孢子是由初级分生孢子的酵母状出芽过程中形成的；随着菌体的老化，菌丝分节断裂形成分节型的厚垣孢子。据其形态特征和孢子产生的特征，按照Hermanides-Nijhof的分类系统(De Hoog G S and Hermanides-Nijhof E J.The blackyeasts and allied hyphomycetes.Studies in Mycology，1977，15：141-177)，初步认为应属于短梗霉属的出芽短梗霉，拟命名为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)SW0202。
此菌株是选择出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW13-02为出发菌株，按常规方法进行紫外线、Co-60诱变处理制得。紫外线照射为15W，距离27cm，时间2～3分钟；Co-60照射为剂量2～8万伦琴，时间为20～30分钟。经处理的菌丝体移种到含0.1％～1.0％COBE的麦芽汁琼脂培养基上，20～40℃培养3～7天，检出在含高浓度COBE培养基上生长的菌落。
含COBE的麦芽汁琼脂培养基由麦芽粉配成10°Be′的麦芽汁加2％的琼脂制成。
此菌株已于2004年11月17日保存在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，地址：北京市中关村北一条13号中科院微生物研究所，保存号CGMCC No.1244。
本发明催化COBE不对称还原生产(S)-CHBE的微生物转化方法，包括以下3个步骤：
步骤(1)：将菌株SW0202，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获得湿菌体；
步骤(2)：以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为原料，用磷酸盐缓冲溶液配制成溶液，或直接加入反应体系作为生物催化用底物；
步骤(3)：将步骤(1)的发酵液、湿菌体或用载体固定化后加入到步骤(2)的底物溶液中进行转化反应。
其中：
步骤(3)中底物溶液浓度为0.1-50％，加湿菌体量为1～40/g底物，酶反应温度为20-50℃，酶解时间为1-20小时。
步骤(1)中产酶发酵培养的培养基组成为：麦芽糖0.5～5.0％，酵母膏1～5％，蛋白胨0.5～2％，硫酸铵0.1～1.0％、磷酸二氢钾0.1～0.5％，硫酸镁0.01～0.1％，pH值为4～9，温度20-40℃，培养1-5天。
步骤(3)中用载体固定化是指湿菌体用生理盐水制成菌悬液，以载体包埋制得固定化细胞，载体为海藻酸钠、卡拉胶、明胶、几丁质。
步骤(3)的转化反应可以采用分批补料转化法或有机溶剂/水双相体系转化法，有机溶剂/水双相体系转化法是指培养细胞在含20～60％有机溶剂与水的双相体系中进行生物转化，有机溶剂为癸醇、十二醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、辛烷、壬烷、十一烷或十二烷。
反应完毕后得到的转化液，用乙酸乙酯萃取，再脱水，脱色，蒸发回收溶剂，得到无色油状液体(S)-CHBE。
以下具体描述各个步骤：
催化用菌株的培养和发酵：
斜面培养：配制含葡萄糖1～10％，麦芽粉浸汁5～30％，琼脂1～2.5％，pH6～9的培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml，下同。100～120℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却、制成斜面、接种，20～40℃培养3～7天。
种子培养和发酵：麦芽糖0.5～5.0％，酵母膏1～5％，蛋白胨0.5～2％，硫酸铵0.1～1.0％、磷酸二氢钾0.1～0.5％，硫酸镁0.01～0.1％，pH值为4～9的培养基，装液量20～150ml/250ml三角瓶，100～120℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却、接种，接种量5～10％，20～40℃，摇瓶转速100～250r/min。在上述条件下进行摇瓶发酵试验，培养1～5天，分别作为种子或发酵培养液。
底物COBE溶液的制备：以常规化学合成方法制备得到的商品COBE，检验合格后用0.1M，pH6.6磷酸盐缓冲溶液配制成所需浓度溶液，或直接按需要量加入反应体系，经微孔滤膜无菌过滤后作为生物催化用底物。
微生物转化反应：
用培养后的发酵液获得的湿菌体作为酶源，以COBE磷酸盐缓冲溶液为底物，底物浓度为0.1-50％，加湿菌体量为1～40g/g底物，转化反应温度为20～50℃，转化反应时间为1～20小时。在此条件下所得的转化液进行手性气相色谱分析(GC)测定表明，已转化的主要组分为(S)-CHBE。
或者，发酵产得湿菌体，或用生理盐水制成菌悬液，以海藻酸钠、卡拉胶、明胶、几丁质等载体包埋等方法制得固定化细胞。以此作为酶源进行生物转化。菌丝体或固定化细胞可反复回用，进行多次生物转化反应。
分批补料转化法：于发酵培养基中，或菌体悬浮液中，每小时一次加入0.1～2.0％的COBE底物进行转化，连续6～7次，最后一次加底物后再转化1小时，产物(S)-CHBE的浓度可以达到1.5～20％，摩尔转化率70～80％，对映体过量值为97～98％e.e.。
有机溶剂/水双相体系转化法：培养细胞在含20～60％的癸醇，或十二醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、辛烷、壬烷、十一烷、十二烷等有机溶剂与水的双相体系中，在最佳条件下，定期添加COBE，葡萄糖，有机相中(S)-CHBE的浓度可以达到20～60g/L，mol转化率80～100％，对映体过量值为97～98％e.e.
底物COBE与产物CHBE的气相色谱(GC)测定：反应结束后，用适量的乙酸乙酯萃取，无水MgSO4脱水，过滤，用GC分析。使用VARIAN3900气相色谱仪，VARIAN CPWAX 52CB极性色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，色谱条件为：进样量：0.5μl，进样口：250℃，检测器：250℃，流量：2.0ml/min，采用程序升温：100℃保留2min，以5℃/min升温至180℃，保留7min，载气H2流速：30ml/min，尾吹N2流速：25ml/min，燃烧气H2流速：30ml/min，空气流速：300ml/min。
产物CHBE对映异构体过量值(e.e.)测定采用手性气相色谱法(Allan C.Dahland Jorgen gaard Madsen；Tetrahedron：Asymmetry，1998，9，4395～4417)。样品处理方法：取乙酸乙酯萃取液0.5ml，置于5ml具塞试管中，常温蒸发去溶剂。然后，滴入2滴乙酸酐和2滴吡啶，置于沸水浴中保持1h，冷后加5ml乙酸乙酯稀释；手性色谱柱：CP-Chifasil Dex CB 0.25mm×25m 0.25nm；色谱条件为：110℃保留2min，以2℃/min升温至126℃，保留2min，以5℃/min升温至160℃，保留2min；进样量0.2ul；柱流速2.0ml/min；载气H2流速30ml/min，燃烧气H2流速30ml/min，空气流速300ml/min，尾吹N2流速25ml/min；进样口：250℃，检测器：250℃，分流比：50∶1。
产物(S)-CHBE的提取：转化反应结束后，将反应液离心(10,000rpm，20min，4℃)，上清液用等体积的乙酸乙酯进行萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，再向其中加入1～5％(w/v)的无水硫酸镁，搅匀后静置过夜，除去残余的水份。将有机相用滤纸过滤，收集有机相。40℃水浴旋转蒸发回收溶剂，得到无色油状液体(S)-CHBE。取(S)-CHBE 0.05g，溶于乙酸乙酯中，定容至5ml，用GC-MASS进行定性分析，样品与标准品(Sigma Co.)的离子流图与质谱图对照，确定为同一物质。
有益效果
本发明微生物转化法相对于传统的化学不对称合成法、面包酵母氧化还原方法或用添加辅酶NADH/NAD+的酶催化不对称还原方法具有以下优点：①生成的(S)-CHBE对映体过量值高，达到97％e.e.以上；②生物催化剂为微生物菌体，可以自行发酵生产，质量稳定，成本低廉，还可制备成固定化细胞，进行多次生物转化反应；③在水/溶剂双相体系中，通过供给能量物质，连续补加底物，可以获得高光学纯度、高反应产率、高产物浓度；④在整个反应过程中不需要添加辅酶；⑤反应条件温和，环境友好。
本发明的特点是选育了一株高对映体选择性菌株——出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202(即CGMCC1244)，在单一水相体系中催化不对称还原COBE生成的产物(S)-CHBE对映体过量值达到97％e.e。在水/溶剂双相体系中，通过供给能量物质，连续补加底物，可以获得高光学纯度、高反应产率、高产物浓度，更主要的是在整个反应过程中不需要添加辅酶。本发明的转化工艺可以直接用发酵培养液添加底物COBE进行转化，也可以用发酵后分离得到的游离菌体或其固定化细胞加底物COBE溶液进行转化，菌体或其固定化细胞可反复利用多次。
实施例
实施例1
斜面培养；培养基为100ml麦芽汁(含麦芽粉10％)，葡萄糖2g，琼脂2g，pH6.5，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种，菌种为表1所示的各种微生物菌株，28℃培养2天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵：培养基为麦芽糖3％，酵母膏2％，蛋白胨0.5％，(NH4)2SO40.5％，KH2PO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.07％，pH7.0，装液量为250ml三角瓶装液50ml，120℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，160转/分钟摇床，28℃培养2天，作为种子或发酵酶液。
发酵酶液中湿菌体量为2.5g/100ml，离心10分钟(8,000转/分钟)收集菌体，用磷酸钾缓冲液(0.1M，pH6.6)清洗两次，将菌体转入25ml含葡萄糖的相同的缓冲液中，使菌体浓度为发酵液中的两倍，同时加入0.3g底物(COBE)，于30℃，160转/分钟下反应。反应结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgSO4干燥过夜，过滤后进行气相色谱分析(S)-CHBE含量与对映体过量值。结果如表1：
表1：产羰基还原酶微生物菌株的筛选
| 微生物菌株 | 对映体过量值(％e.e) | mol转化率(％) | 产物构型 |
| 酿酒酵母SW-4.1(Saccharomyces cerevisiae) | 53.66 | 23.93 | S |
| 酿酒酵母SW-57(Saccharomyces cerevisiae) | 55.56 | 26.36 | S |
| 酿酒酵母724(Saccharomyces cerevisiae) | 55.17 | 39.80 | S |
| 酿酒酵母K(Saccharomyces cerevisiae) | 80.52 | 25.84 | S |
| 酿酒酵母1308(Saccharomyces cerevisiae) | 52.94 | 40.41 | S |
| 葡萄酒酵母SW-58(Saccharomyces uvarum) | 66.40 | 19.59 | S |
| 异常汉逊氏酵母SW-410(Hansenula anomala) | 28.68 | 34.17 | R |
| 异常汉逊氏酵母AS 2.297(Hansenula anomala) | 54.82 | 35.25 | S |
| 异常汉逊氏酵母AS 2.300(Hansenula anomala) | 54.17 | 37.05 | S |
| 出芽短梗霉菌SW0202(Aureobasidium pullulans) | 97.80 | 47.15 | S |
| 热带假丝酵母(Candida tropicalis) | 48.40 | 25.53 | S |
| 异常毕赤酵母AS2.238(Pichia anomala) | 58.86 | 23.89 | S |
实施例2
用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202(即CGMCC 1244)，按实例1方法发酵培养48小时后，称取12g湿菌体加于250ml三角瓶装50ml 0.1M，pH6.6磷酸钾缓冲液中，含底物COBE量为0.5g，分别添加0％，1％，3％，5％，7％，9％的葡萄糖，于30℃，160r/min下进行转化反应，反应过程中必要时用Na2CO3调节pH使其维持pH6.5～pH6.6，反应4小时后结束，测定其产物量及对映体过量值。反应液离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgSO4干燥，过滤后进行气相色谱分析(S)-CHBE含量与对映体过量值。结果如表2：
表2：添加不同葡萄糖浓度对转化的影响
| 葡萄糖浓度(％) | mol转化率(％) | 对映体过量值(％e.e.) |
| 0 | 40.1 | 97.1 |
| 1 | 47.2 | 97.2 |
| 3 | 48.4 | 97.1 |
| 5 | 49.1 | 97.5 |
| 7 | 50.8 | 97.1 |
| 9 | 53.1 | 97.3 |
由表2可以看出，添加葡萄糖并不影响产物的对映体过量值，而其产率则随葡萄糖浓度的增加有所增加。
实施例3
用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202(即CGMCC 1244)，按实例1方法发酵培养48小时后，发酵酶液中湿菌体量为2.5g/100ml，称取3～18g湿菌体加于250ml三角瓶装0.1M，pH6.6磷酸钾缓冲液50ml(测定干菌体浓度约为16～96g/L)，起始底物COBE量为0.5g，于30℃，160转/分钟下进行转化反应。4小时后反应结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgSO4干燥，过滤后进行气相色谱分析(S)-CHBE含量与对映体过量值。结果如表3：
表3：不同的菌体量对转化的影响
| 菌体量(湿菌体/g) | mol转化率(％) | 对映体过量值(％e.e.) |
| 3 | 17.3 | 96.7 |
| 6 | 43.4 | 97.0 |
| 9 | 68.0 | 97.1 |
| 12 | 76.6 | 97.3 |
| 15 | 72.0 | 97.1 |
| 18 | 65.0 | 97.9 |
实施例4
用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按实例1方法发酵产酶，按实例2方法进行转化反应，50ml反应体系中含底物COBE量为1.22g。于反应不同时间取样，进行气相色谱分析(S)-CHBE含量并计算转化产率。结果如表4：
表4：转化时间曲线
| 对间(min) | CHBE浓度(g/L) | mol转化率(％) | 对映体过量值(％e.e.) |
| 0 | 0 | 0 | 0 |
| 15 | 11.67 | 47.33 | 97.12 |
| 30 | 12.60 | 51.10 | 97.20 |
| 45 | 18.11 | 73.43 | 97.66 |
| 60 | 18.41 | 74.65 | 97.71 |
| 120 | 20.32 | 82.42 | 97.54 |
| 180 | 17.53 | 71.09 | 97.53 |
| 240 | 16.12 | 68.69 | 97.74 |
| 300 | 15.24 | 65.86 | 97.27 |
| 360 | 16.55 | 67.10 | 97.44 |
| 420 | 17.94 | 65.36 | 97.46 |
| 480 | 14.48 | 58.70 | 97.45 |
| 600 | 13.87 | 56.25 | 97.16 |
| 720 | 14.33 | 58.13 | 97.28 |
实施例5
用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按实例1方法发酵产酶，于250ml三角瓶装0.1M，pH6.6磷酸钾缓冲液50ml，加入12g湿菌体，加入溶解有3.6g COBE的苯二甲酸二丁酯溶液50ml，按实例2方法进行转化反应，8小时后反应结束，用手性柱进行气相色谱分析，反应液有机相中(S)-CHBE含量达到58.8g/L，水相中(S)-CHBE含量10.0g/L，相应mol转化率为94.8％(w/w)，(S)-CHBE对映体过量值为97.1％e.e.。
实施例6
用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按实例1方法发酵产酶，于250ml三角瓶装0.1M，pH6.6磷酸钾缓冲液50ml中加入12g湿菌体(测定干菌体浓度约为49.2gDCW/L)，按实例5方法进行转化反应，转化4小时，取样测定反应液有机相中(S)-CHBE含量，反应结束后分离出反应液有机相，再次加入新的有机相底物(含底物COBE量为2％的乙酸正丁酯)与葡萄糖，进行转化，在同一条件转化4小时，如此反复转化重复利用5次。结果如表5所示。
表5发酵湿菌体反复分批转化结果
| 反复利用次数 | mol转化率(％) | 对映体过量值(％e.e.) |
| 1 | 78.98 | 96.51 |
| 2 | 65.45 | 97.33 |
| 3 | 63.60 | 97.03 |
| 4 | 47.05 | 97.10 |
实施例7
按实例1方法，发酵，得湿菌体100g，加100ml生理盐水制成菌体悬液，30℃保温；另称取20g卡拉胶，加400ml生理盐水，加热溶解后，冷却到55℃保温。两者在50℃以下混匀，倒入平皿，冷却，加KCl溶液，放冰箱中硬化3小时，称重得约500g固定化细胞。将此固定化细胞，按实例5方法进行转化。反复分批转化5次结果见表6。
表6 固定化细胞反复分批酶转化结果
| 反复利用次数 | mol转化率(％) | 对映体过量值(％e.e.) |
| 1 | 32.39 | 96.22 |
| 2 | 53.03 | 97.32 |
| 3 | 48.79 | 96.84 |
| 4 | 51.22 | 95.91 |
| 5 | 23.65 | 67.65 |
| 6 | 21.32 | 69.58 |
实施例8
用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按实例1方法发酵产酶，按实例2方法进行转化，于0.1M，pH6.6磷酸钾缓冲液100ml中，加湿菌体50g，加入3.65g的COBE，分为一次性加入、两次加入、三次加入、五次加入和十次加入。每次加入量，分别为3.65g，1.825g，1.217g，0.913g，0.73g，0.365g。同时测定pH，若低于pH6.6，则用1mol/LNa2CO3调至pH6.6，反应结束，进行气相色谱分析，结果如表7：
表7：分次添加底物的转化结果
| 序号 | COBE添加总量(g) | 产物浓度(g/L) | mol转化率(％) | 添加方式 |
| 1 | 3.65 | 9.33 | 25.24 | 一次加入 |
| 2 | 3.65 | 11.34 | 30.65 | 两次加入 |
| 3 | 3.65 | 14.89 | 40.25 | 三次加入 |
| 4 | 3.65 | 17.36 | 46.94 | 五次加入 |
| 5 | 3.65 | 19.67 | 53.18 | 十次加入 |
实施例9
用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按实例1方法发酵产酶，按实例7方法进行转化，转化反应结束后，将反应液离心(10,000转/分钟，20分钟，4℃)得上清液，上清液用等体积的乙酸乙酯进行萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，再向其中加入1～3％(w/v)的无水硫酸镁，搅拌后静置过夜，除去残余的水份。将所得有机相用滤纸过滤，收集有机相。40℃水浴旋转蒸干溶剂，所得油状物用减压蒸馏的方法提纯，在4～6mmHg条件下，收集80～84℃的馏分，经GC分析，纯度为78.04％。
粗产品用精馏方法或硅胶柱纯化(己烷/乙酸乙酯＝3/1，v/v)，得到(S)-CHBE成品(含量98％，光学纯度97.8％e.e.)，[α]D 25＝-21.40°(c＝7.0，CHCl3)。用GC-MASS进行定性分析，与标样离子流图和质谱图对照，确定样品与标准品为同一物质(图谱略)。
Claims (6)
1.一种高对映体选择性羰基还原酶的微生物菌株，它是出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，即CGMCC No.1244。
2.一种制造手性卤代羟基丁酸酯的方法，包括以下3个步骤：
步骤(1)：将权利要求1所述的菌株SW0202，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获得湿菌体；
步骤(2)：以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料，用磷酸盐缓冲溶液配制成溶液，或直接加入反应体系作为生物催化用底物；
步骤(3)：将(1)的发酵液、湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到(2)的底物溶液中进行转化反应。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中底物溶液浓度为0.1-50％，加湿菌体量为1～40g/g底物，酶反应温度为20-50℃，酶解时间为1-20小时。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中用于发酵的培养基组成为：麦芽糖0.5～5.0％，酵母膏1～5％，蛋白胨0.5～2％，硫酸铵0.1～1.0％、磷酸二氢钾0.1～0.5％，硫酸镁0.01～0.1％，pH值为4～9，温度20-40℃，培养1-5天。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中用载体固定化是指湿菌体用生理盐水制成菌悬液，以载体包埋制得固定化湿菌体，载体为海藻酸钠、卡拉胶、明胶、几丁质。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)的转化反应采用有机溶剂/水双相体系转化法：培养湿菌体在含20～60％有机溶剂与水的双相体系中进行生物转化，有机溶剂为癸醇、十二醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、辛烷、壬烷、十一烷或十二烷。
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