CN103122319B

CN103122319B - 一株具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌及其生物拆分制备s-型利斯的明的方法

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Publication number: CN103122319B
Application number: CN201210581957.0A
Authority: CN
Inventors: 刘宏民; 李永红; 单丽红; 秦上尚; 郑甲信; 赵俊杰; 田丹
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: CN103122319A

Abstract

本发明涉及一株具有立体选择性脂肪酶活的酵母菌，及利用其进行生物转化制备S-型利斯的明的方法。该方法从土壤中筛选到一株具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌，并将其用于生物拆分，以制备S-型利斯的明，转化18h，转化液中含ee值90%以上的S-型目的产物。利用该菌种可对含有酰基的对映体进行拆分。本发明提供了该菌种的培养方法、手性拆分的方法，在双相体系中的转化方法。利用该菌种可对利斯的明等手性中心含有酰基或羟基的化合物进行手性拆分。对推动我国手性药物的开发进程有着重要的应用价值。

Description

一株具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌及其生物拆分制备S-型利斯的明的方法

技术领域

本发明涉及一株具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌，及利用其进行生物拆分制备S-型利斯的明的方法，属生物化工领域。

背景技术

阿尔茨海默症(AD)是1907年德国神经病理学家阿尔茨海默首次发现并报道的，是一种进行性神经退化疾病，其特征是记忆和认知功能渐进的损伤。已成为年龄在65岁以上的人第四大死亡原因。轻中度的阿尔茨海默症(AD)表现为轻度语言、记忆功能障碍，但并未完全丧失自理能力；重度阿尔茨海默症(AD)则基本丧失语言表达、认知和记忆能力，甚至出现大小便不能自理的现象，已失去自理能力。1993年我国制订的诊断阿尔茨海默症(AD)标准1. 通过智力检测证实为痴呆；2. 有2项及更多项的识别功能障碍；3. 记忆和识别障碍进行性逐渐加重；4. 无意识障碍；3. 40岁至90岁时发病；4. 没有其他躯体或脑部疾病。

目前，阿尔茨海默症已经成为主要的公共健康问题。据统计，年龄大于80岁的人口中有20%受到阿尔茨海默症的侵害。而阿尔茨海默症患病的百分比随着年龄的增长而变大：65~75岁患病者为该年龄段人口的1%，而80岁患病者高于该年龄段人口的8%。据报道，阿尔茨海默症是仅次于癌症和心脏疾病之后的第三种威胁人类健康的疾病^[。此外，年龄超过65岁的痴呆症患者中约有50~60%是阿尔茨海默症患者，女性发病率较男性略高。阿尔茨海默症对人类健康的危害和医疗费用的增加都使得寻找一种有效的治疗方案显得尤为重要。

利斯的明（Rivastigmine），又称卡巴拉汀，化学名(S)-N-乙基-[3-（1-二甲基氨基）乙基]-N-甲基-氨基甲酸苯酯，结构式如式1，是氨基甲酸酯类脑选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂，选择性地作用于大脑区域内并有较长持续时间的活性。

它的酒石酸盐的商标名称为氨基甲酸铵 Exelon。1997年在瑞士上市，2000年经FDA批准在美国上市，其后在世界160多个国家上市，我国SFDA(国家食品监督管理局)也于2000年批准Exelon胶囊在国内上市。利斯的明对轻中度阿尔茨海默症（AD）有温和节制作用，对帕金森症^]和路易小体引起的痴呆症以及血管性痴呆^[也具有良好的治疗效果。临床证明其安全性和耐受性较好，没有肝脏毒性，是唯一不经过P450酶代谢的药物，其疗效较其他胆碱酯酶抑制剂更好。

式1 S-型利斯的明的结构式

迄今为止，得到单一构型S-型利斯的明途径有：手性酸拆分外消旋体（参考文献：(S)-N-乙基-N-甲基-3-[1-(二、甲胺基)-乙基]-氨基甲酸苯酯及其酒石酸盐的制备方法，WO2007025481, 2007-03-08）；过渡金属催化（参考文献：M. Hu, F.-L. Zhang and M.-H. Xie, Novel Convenient Synthesis of Rivastigmine[J]. Synth. Commun., 2009, 39: 1527~1533； Alessandro A. Boezio, Julien Pytkowicz, Alexandre Co te′ , and Andre′ B. Charette Asymmetric, Catalytic Synthesis of γ-Chiral Amines Using a Novel Bis(phosphine) Monoxide Chiral Ligand[J]. J. AM. CHEM. SOC. 2003, 125:14260~14261.）；脂肪酶催化拆分羟基中间体（参考文献：Juan Mangas-Sanchez, Mar′a Rodr′guez-Mata, Eduardo Busto.Chemoenzymatic Synthesis of Rivastigmine Based on Lipase-Catalyzed Processes[J]. J. Org. Chem. 2009, 74:5304~5310.）。这些方法都具有一定的缺陷，复杂的合成步骤、金属中的杂质以及多步手性盐的重结晶过程等。

自从微生物拆分应用于生产后，一般以化学法与微生物拆分相结合来制备手性药物。生物拆分反应立体选择性和区域选择性强；反应条件温和，可避免或减少使用强酸、强碱和一些有毒原料，改善操作条件，减少环境污染；可避免使用不对称合成中所必需的昂贵的手性试剂或手性催化剂。生物催化剂生产成本低廉，可大规模生产，生产周期短，不受季节影响，且催化剂可重复利用，进一步降低成本。Kiwon Han^[等人于2009年报道了化学-酶法制备S-型利斯的明的方法（Kiwon Han, Cheolwoo Kim, Jaiwook Park, and Mahn-Joo Kim Chemoenzymatic Synthesis of Rivastigmine via Dynamic Kinetic Resolution as a Key Step[J]. J. Org. Chem. 2010, 75:3105~3108.），该路线以间羟基苯乙酮为起始原料，与N-甲基-N-乙基甲酰氯发生酯化反应，再被硼氢化钠还原成醇，然后以异丙烯基乙酸酯为酰基供体，在弱碱性条件下，由聚苯乙烯树脂固载的金属Ru配合物与脂肪酶Novozym-435联合催化，N-乙基-3-[(1-羟基)乙基]-N-甲基氨基甲酸苯酯（化合物1）经一步反应实现了动力学拆分（DKR）与酰化反应得到R-构型的1-[3-(乙基(甲基)氨基甲酰氧基)苯基]乙酸乙酯（化合物2）（ee 99%），再经水解、甲磺酰化、胺化得到利斯的明(产率77%，ee 97%)。该路线虽简短、反应条件温和、产率及光学活性较高，但动态动力学拆分(DKR)所用金属钌配合物及脂肪酶Novozym-435价格昂贵。因此，筛选立体选择性强、催化效率高且稳定性好的微生物酶，并在此基础上开发出具有自主知识产权的制备S-型利斯的明的新工艺，具有重要意义。

Kiwon Han等人报道的制备S-型利斯的明工艺路线

发明内容

本发明的目的是提供一株立体选择性强、催化效率高且稳定性好的酵母菌株；另一目的在于提供利用其作为催化剂，通过立体拆分制备S-型利斯的明的方法。

为实现本发明目的，本发明提供的酵母菌为季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii），能产生立体选择性脂肪酶，2012-11-7经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No.6783 。其可对手性中心含有酰基或羟基的化合物进行对映体拆分。

本发明从土壤中筛选具有立体选择性脂肪酶活性的微生物，筛选方法如下：

1. 称取1.5 g取自不同地区的土样，溶于无菌水中，震荡10 min后，将上层清夜倒入富集培养基中培养。

2. 将1中培养液用无菌水稀释后，涂布至以底物为唯一碳源的平板上，于28℃培养。

3. 将2中长出的菌落挑出，分离纯化。

4. 将3中纯化后的菌种用罗丹明B指示平板法进行复筛。在紫外灯下观察，产脂肪酶的微生物生成的菌落周围有红色荧光环。

5. 将4中筛选出的菌种摇瓶发酵培养后，加入底物进行拆分试验，用TLC法检测有无产物生成，保留有产物点生成的菌株。

6. 将5中筛选出的菌种经摇瓶发酵培养后，加入底物进行拆分试验，用乙酸乙酯萃取拆分产物液后，蒸干溶剂，用HPLC法检测产物的ee值，选出ee值最高的菌种保留。

将薄层色谱法筛选出的14种菌株分别进行摇瓶发酵培养，拆分化合物2，用HPLC法对乙酸乙酯萃取产物进一步测定，结果如表1所示：

表1 菌种复筛HPLC结果

菌种编号	HPLC（ee值/%）	HPLC（转化率/%）	菌种编号	HPLC（ee值/%）	HPLC（转化率/%）
						Rnn02	91.124	50.5	Sdjn02A	69.1	13.2
zz01C	83.476	36.4	Gxnno1B	29.4	22.8
						Gxnno2B	19.58	75.4	bj02Aα	0	0
Gxnno1A	24.018	80.8	zz01Dβ	81.25	15.9
						Gxnno2	39.9	17.4	Gxnno2D	0	0
zz03	18.466	75
						Gxnno3B	6.56	23.9
Gxnno1C	11.87	25.3
						xx02	18.16	15

拆分产物用HPLC法进行分析，HPLC测定条件为：以手性Lux 3u Cellulose-1柱为固定相，正己烷-异丙醇（92.5：7.5）为流动相，流速0.8 mL /min，检测波长为217 nm。

拆分产物的ee值通过样品HPLC图谱上两个异构体的峰面积来计算，公式为：ees(%) = (峰面积S-峰面积R)/ (峰面积S+峰面积R)*100。

对于具有立体选择性的酶，立体选择性是一个重要的技术指标，这一指标用E值表示， E值越大，菌种的立体选择性越好。E=ln[(1-c)(1-ees)]/ln[(1-c)(1+ees)]= ln[1-c (1+eep)]/ln[1-c (1-eep)] ，其中eep=([P]-[Q])/([P]+[Q]),eeS=([B]-[A])/([B]+[A]),c= eeS/( eeS+ eep)。A、B分别为底物的两种对映体；P、Q分别为产物的两种对映体。本发明最后筛选出的菌种拆分化合物2的E值是89.53 。

产物结构用核磁共掁法（NMR）进行鉴定。

根据拆分产物的ee值和TLC结果来确定菌种的拆分能力。优良菌种的拆分产物应该具较大的ee值，菌株编号Rnn02对外消旋化合物2的拆分效果最好。TLC结果应证实其产生了不同于底物的新物质。最后对具有上述性质的拆分产物进行分离，得到纯的产物，并通过NMR来确定其结构。

通过对菌落形态、菌体细胞形状和大小、有无孢子和菌丝形成以及繁殖方式的观察对菌种进行初步鉴定。经过对该菌株26S rDNA 的分析，进行菌种的准确鉴定，确定其为季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）。

本发明利用该微生物作为催化剂，通过立体拆分制备S-型利斯的明的方法通过如下步骤实现：

(1) 将季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）在如下条件下进行培养、发酵，获得细胞培养液或湿菌体，将其作为酶制剂；

(a) 斜面培养基为：蔗糖0~2%，蛋白胨0~1%，玉米浆0~0.5%，琼脂2%，余量为蒸馏水，各成份以重量百分比计；

(b) 种子及发酵培养基为：蔗糖0~2%，蛋白胨0~1%，玉米浆0~0.5%，余量为蒸馏水，各成份以重量百分比计，初始pH 5～10;

(c)培养条件为：温度20～50℃，时间5～48 h ，装液量系数10～60%;

(2) 将上述酶制剂接种于组成为：蔗糖0~2%，蛋白胨0~1%，玉米浆0~0.5%，余量为蒸馏水，初始pH 4～10培养基中，各成份以重量百分比计，于20℃～50℃培养12～48 h，然后加入1-[3-(乙基(甲基)氨基甲酰氧基)苯基]乙酸乙酯 0.5 ～12 g/L做为底物，于20℃～50℃转化5～50 h，生成中间转化产物S构型N-乙基-3-[(1-羟基)乙基]-N-甲基氨基甲酸苯酯，用HPLC法测定转化率和产物ee值；

（3）S构型N-乙基-3-[(1-羟基)乙基]-N-甲基氨基甲酸苯酯再经水解、甲磺酰化、胺化得到S-型利斯的明。

步骤(2)中也可以用细胞培养液直接进行转化，底物浓度为1～10 g/L，温度为20～50℃，转化时间为5～50 h。

在上述转化体系中加入乙醇、乙腈或乙酸乙酯等有机溶剂，有利于提高转化速度，有机溶剂加入量为底物重量的1～10%。

步骤(2)中也可以采用静息细胞在pH 5～10的缓冲液中进行转化，缓冲体系为Na₂HPO₄-柠檬酸、Tris-HCl Na₂HPO₄-KH₂PO₄、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄或K₂HPO₄-KH₂PO₄，底物浓度为1～10 g/L，转化温度为20～50℃，转化时间为5～50 h。

本发明有益效果：提供了一株具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii），该菌株立体选择性强、催化效率高且稳定性好，利用该菌种可进行利斯的明等手性中心含有酰基或羟基的化合物的手性拆分。相对化学法来说，本发明采用生物催化剂，拆分反应速度快、立体选择性较好，价格低廉、转化反应条件温和，环境友好。对推动我国手性药物的开发进程具有重要的应用价值。

季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）于2012-11-7经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所)，保藏号：CGMCC No.6783 。

附图说明

图1为本发明工艺路线路；

图2为化合物1的HPLC图谱；

图3为化合物2的HPLC图谱；

图4为化合物2和化合物1混合样品的HPLC图谱；

图5为本发明菌株生物拆分反应液的HPLC图；

图6为本发明拆分产物的¹HNMR与化合物1的¹HNMR比较谱图；图中1为本发明拆分产物的¹HNMR，2为化合物1的¹HNMR。

具体实施方式

为对本发明进行更好地说明，特举实施例如下。

实施例1 菌株的选育

通过对拆分反应底物和产物的HPLC保留行为及核磁氢谱的研究，从而确定编号Rnn02的菌株是符合本发明要求的菌株。将本发明的拆分底物、产物及相应标准品的HPLC色谱保留时间与文献报道的数据比较，从附图2-5对比及表2可以看出S-化合物2的峰消失，拆分反应液HPLC图中有少量拆分底物的R-化合物2的峰，大量拆分产物S-化合物1和少量R-化合物1的峰，证明我们得到的拆分产物是S-化合物1和少量R-化合物1，并将拆分产物与化合物1的的¹HNMR谱图进行比较，发现两者一样，证明拆分产物是化合物1。

表2 本发明生物拆分产物、底物与相应标准品HPLC谱图的比较

通过对菌落形态、菌体形状和大小、有无孢子和菌丝生成以及繁殖方式的观察对菌种进行初步鉴定。结果如下：

细胞有圆形（4.5 μm）和椭圆形（4×4.5 μm~5.5×6 μm），无孢子，无假菌丝，主要为裂殖，少数为芽殖。

该菌株在不同培养基上的形态不同，具体形态如下：

豆汁培养基：菌苔较大，呈乳白色，表面有褶皱，比较湿润，菌苔边缘比较透明、整齐，没有孢子及假菌丝，容易挑取，呈粘稠状，无味，细胞分为圆形（5.5 μm）和椭圆形（5.5×6 μm）。

麦芽汁培养基：菌苔较小，呈乳白色，表面有褶皱，比较干燥，菌苔边缘比较透明、整齐，没有孢子及假菌丝，容易挑取，呈粘稠状，无味，细胞以圆形（4 μm）居多。

YEPD(一)培养基：菌苔较小，呈乳白色，表面有褶皱，比较干燥，菌苔边缘比较透明、整齐，没有孢子及假菌丝，容易挑取，呈粘稠状，无味，细胞为圆形（4 μm）和椭圆形（4×4.5 μm）。

YEPD（二）培养基：菌苔较小，呈乳白色，表面光滑，比较湿润，菌苔边缘比较透明、整齐，没有孢子及假菌丝，容易挑取，呈粘稠状，无味，细胞为圆形（4.5 μm）和椭圆形（5×5.5 μm）。

PDA培养基：菌苔较小，呈乳白色，表面有褶皱，比较湿润，菌苔边缘比较透明、整齐，没有孢子及假菌丝，容易挑取，呈粘稠状，无味，细胞椭圆形（4×6 μm）居多。

豆芽汁培养基：菌苔较大，呈乳白色，表面有褶皱，比较湿润，菌苔边缘比较透明、整齐，没有孢子及假菌丝，容易挑取，呈粘稠状，无味，细胞分为圆形（5.5 μm）和椭圆形（5.5×6 μm）。

根据编号Rnn02的菌株的细胞形态和菌落形态的结果及与相关资料对比，初步判断该菌为酵母菌。

对该菌株26S rDNA的分析结果表明，该菌株的基因与季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）一致，经基因库检索该菌株为季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）。

实施例2 生物拆分反应条件研究

将菌种接入培养基（玉米浆0.5%、蛋白胨1%、蔗糖2%，余量为蒸馏水，各成份以重量百分比计，初始pH 8.0）中，500 mL三角瓶装100 mL（即20%），于28℃培养48 h后加入拆分底物，于28℃反应12 h、用乙酸乙酯萃取产物、合并乙酸乙酯层、蒸干溶剂、柱层析纯化（石油醚：丙酮=5:1），结果转化率为50.6%，R-化合物2的ee值为92.22%，S-化合物1的ee值为93.22%。

将本发明所述菌种的静息细胞在选定培养基的基础上（蔗糖2%，蛋白胨1%，玉米浆0.5%，余量为蒸馏水，各成份以重量百分比计,），用Na₂HPO₄-柠檬酸、Tris-HCl、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄、K₂HPO₄-NaOH 缓冲体系调pH至8.0，于28℃培养48 h后，加入0.1%化合物2于同样条件下反应16 h，考察不同缓冲体系对反应的影响，结果见表3：

表3 缓冲体系的选择

缓冲体系	Na ₂HPO₄-柠檬酸	Tris-HCl	NaH ₂PO₄-Na₂HPO₄	K₂HPO₄-NaOH
					转化率（%）	50	50.8	25.7	51.6
ee值（%）	89.546	92.186	80.086	85.876

表3所示结果表明，Tris-HCl为最佳缓冲体系。

在选定培养基的基础上，用不同的溶剂(200 μL)溶解底物进行拆分试验，考察有机溶剂的影响。结果见表4

表4有机溶剂对反应的影响

有机溶剂	转化率（%）	ee值(%)	有机溶剂	转化率（%）	ee值(%)
						乙醚	44.2	85.84	乙醇	41	91.738
石油醚	44.2	86.864	乙腈	44.8	91.004
						甲苯	15.6	84.68	异丙醇	45.8	88.624
甲醇	45.5	87	丙酮	45.3	86.57
						四氢呋喃	46	89.01	乙酸乙酯	34.7	94.55
DMF	45.5	89.59	氯仿	44.4	84.05
						二氯甲烷	43.4	88.99

从表4可以看出，甲苯对反应有明显的抑制作用。乙醇、乙腈及乙酸乙酯做为溶剂时，效果较好，其中以乙腈效果最佳。

实施例3 立体拆分制备S-型利斯的明的方法

1、底物的制备

以间羟基苯乙酮为原料，与N-甲基-N-乙基甲酰氯酯化后，经硼氢化钠还原成化合物1. 在 4-二甲氨基吡啶的催化条件下，以三乙胺为碱，用氮气保护，化合物1与醋酸酐发生酰化反应，得到化合物2。

2、生物转化反应

将本发明菌株接种于培养基（玉米浆0.5～4%、蛋白胨0.5～4%、蔗糖0.5～4%，余量为蒸馏水，各成份以重量百分比计，初始pH 4～12）中，于25℃～32℃培养，然后加入上述底物1 ～2.5 g/L，再于20℃～32℃转化8～24 h。转化产物用HPLC法测定转化率和产物ee值，得到S-化合物1。

3、S-型利斯的明的合成

由上述生物拆分反应的产物S-化合物1再经水解、甲磺酰化、胺化得到S-型利斯的明。

实施例4 立体拆分制备S-型利斯的明的方法

步骤(2)中用细胞培养液直接进行转化，底物浓度为1～10 g/L，转化温度为20～50℃，转化时间为5～50 h。在转化体系中加入乙腈有机溶剂，有机溶剂加入量为底物重量的1～10%。其它同实施例2。

实施例5 立体拆分制备S-型利斯的明的方法

步骤(2)中用静息细胞在pH 5～10的缓冲液中进行转化，缓冲体系为Na₂HPO₄-柠檬酸、Tris-HCl Na₂HPO₄-KH₂PO₄、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄或K₂HPO₄-KH₂PO₄，底物浓度为1～10 g/L，转化温度为20～50℃，转化时间为5～50 h。其它同实施例2。

Claims

1.一株具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌，其特征在于，该菌株为季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii），经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No.6783。

2.如权利要求1所述的酵母菌生物拆分制备S-型利斯的明的方法，其特征在于，通过如下步骤：

3.根据权利要求2所述的酵母菌生物拆分制备S-型利斯的明的方法，其特征在于：步骤(2)中用细胞培养液直接进行转化，底物浓度为1～10 g/L，转化温度为20～50℃，转化时间为5～50 h。

4.根据权利要求2或3所述的酵母菌生物拆分制备S-型利斯的明的方法，其特征在于：在转化体系中加入乙醇、乙腈或乙酸乙酯有机溶剂，有机溶剂加入量为底物重量的1～10%。

5.根据权利要求2所述的酵母菌生物拆分制备S-型利斯的明的方法，其特征在于：步骤(2)中用静息细胞在pH 5～10的缓冲液中进行转化，缓冲体系为Na₂HPO₄-柠檬酸、Tris-HCl Na₂HPO₄-KH₂PO₄、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄或K₂HPO₄-KH₂PO₄，底物浓度为1～10 g/L，转化温度为20～50℃，转化时间为5～50 h。