CN104651243B - 膜醭毕赤酵母及其在手性合成(r)‑1,3‑丁二醇中的应用 - Google Patents

膜醭毕赤酵母及其在手性合成(r)‑1,3‑丁二醇中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株膜醭毕赤酵母及其在手性合成(R)‑1,3‑丁二醇中的应用。膜醭毕赤酵母PGU，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 9096。膜醭毕赤酵母PGU以4‑羟基‑2‑丁酮为底物手性合成(R)‑1,3‑丁二醇的方法，包括：1）预培养：膜醭毕赤酵母PGU接入共底物溶液，培养2 h；2）转化：向含有膜醭毕赤酵母PGU的共底物溶液中加入4‑羟基‑2‑丁酮，生物转化，得到(R)‑1,3‑丁二醇。本发明提供的膜醭毕赤酵母PGU能够将4‑羟基‑2‑丁酮转化为(R)‑1,3‑丁二醇，收率88.0%，生产率0.649 g/(L h)，产物对映体过量值99%。

Description

膜醭毕赤酵母及其在手性合成(R)-1,3-丁二醇中的应用
技术领域
本发明涉及一株膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）及其在手性合成(R)-1,3-丁二醇中的应用，属于生物催化技术领域。
背景技术
(R)-1,3-丁二醇是合成青霉烯类和碳青霉烯类非典型β-内酰胺抗生素的关键手性中间体。在非典型β-内酰胺抗生素中，唯独青霉烯类对于静止状态细菌具有抗菌作用，而碳青霉烯类的抗菌谱最广、抗菌活性最强；两者已经成为治疗革兰氏阳性耐药菌感染包括多重耐药菌感染的有效药物。因而，(R)-1,3-丁二醇的市场需求非常强劲（Llarrull LI,et al. Curr Opin Microbiol, 2010, 13:551-7）。
(R)-1,3-丁二醇可由化学反应或者生物手段获得。化学法或以苏氨酸为起始原料经过亚硝化脱氨、甲酯化、钯催化氢化和氢化铝锂还原而得（Larcheveque M, et al.Synth Commun, 1991, 21:2295-300），或以轴向手性配体制备的钌基络合物催化4-羟基-2-丁酮不对称氢化而得（Boaz NW, et al. Tetrahedron Lett, 2006, 47:4033-5）。最经典的是日本Daicel化学工业株式会社所开发的技术：乙醛在碱性条件下缩合成3-羟基丁醛，再由骨架镍催化而加氢生成1,3-丁二醇，然后拆分；但是，设备投资大，技术难度高，产品分离纯化困难，对环境不友好。
生物法已有研究报道，包括：微生物不对称还原4-羟基-2-丁酮（Matsuyama A, et al. J Mol Catal B: Enzym, 2001, 11:513-21）；微生物对映选择性氧化外消旋体中的(S)-1,3-丁二醇（Matsuyama A, et al. J Mol Catal B: Enzym, 2001, 11:513-21）；脂肪酶在有机溶剂中催化1,3-丁二醇进行对映选择性双酰基化，所得产物再行水解（EguchiT, et al. Biotechnol Lett, 1993, 15:955-60）。
生物法较之化学法具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、原料成本低、产品纯度高、工艺简单易控、环境亲和等优点，是最绿色的手性化合物制备技术。生物合成比生物拆分的原料利用率更高。因而，获取具有卓越的羰基不对称还原能力的菌株，是生物法生产(R)-1,3-丁二醇的基础和关键。近年来，国内开展相关研究。郑仁朝等人分离得到克鲁斯假丝酵母（Candida krusei）ZJB 09162，该菌株能够将45 g/L 4-羟基-2-丁酮转化为38.7g/L (R)-1,3-丁二醇，产物对映体过量值99%（Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 94:969-76）。杨套伟等人分离得到杰丁毕赤酵母（P. jadinii）HBY61，该菌株能够将45 g/L 4-羟基-2-丁酮转化为38.3 g/L (R)-1,3-丁二醇，产物对映体过量值100%（J Ind MicrobiolBiotechnol, 2014, 10.1007/s10295-014-1521-5）。
发明内容
本发明提供一株能够以4-羟基-2-丁酮为底物手性合成(R)-1,3-丁二醇的菌株，为进一步开发生物法(R)-1,3-丁二醇生产技术丰富选择、夯实基础。所述菌株为膜醭毕赤酵母（P. membranaefaciens）PGU，其特征在于，已于2014年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 9096。
塞罗吉萨毕赤酵母（P. cellokiesa）、希德毕赤酵母（P. heedii）、杰丁毕赤酵母（P. jadinii）、林德毕赤酵母（P. lindnerii）和巴斯德毕赤酵母（P. pastoris）也能够将4-羟基-2-丁酮不对称还原为(R)-1,3-丁二醇（Yang TW, et al. J Ind MicrobiolBiotechnol, 2014, 10.1007/s10295-014-1521-5），但是，膜醭毕赤酵母未见于相关报道。
本发明还提供上述的膜醭毕赤酵母以4-羟基-2-丁酮为底物手性合成(R)-1,3-丁二醇的方法，包括如下步骤：
1）预培养：膜醭毕赤酵母PGU接入共底物溶液，培养时间为2 h；
2）转化：向步骤1）得到的含有膜醭毕赤酵母PGU的共底物溶液中加入4-羟基-2-丁酮，以供膜醭毕赤酵母PGU进行生物转化，得到所述(R)-1,3-丁二醇。
优选地，步骤1）所述共底物溶液为在pH值为7.0的0.1 mol/L磷酸钾缓冲溶液中加入共底物得到的溶液，所述共底物为蔗糖、葡萄糖、甘油或乙醇中的一种。
优选地，步骤1）所述共底物溶液为在含有9 g/L磷酸氢二钾、6 g/L磷酸二氢钾、0.5 g/L硫酸铜、0.2 g/L氯化钴、0.1 g/L钼酸钠、0.1 g/L硫胺素和0.1 g/L生物素的水溶液中加入共底物得到的溶液，所述共底物为蔗糖、葡萄糖、甘油或乙醇中的一种。
进一步优选地，所述共底物为蔗糖，其在共底物溶液中的浓度为60 ~ 120 g/L；更优选地，为90 g/L。
优选地，步骤1）中所述膜醭毕赤酵母的接入密度为6 × 106 ~ 16 × 106 /mL；更优选地，为12 × 106 /mL。
优选地，步骤1）和步骤2）的温度控制在26 ~ 34°C；更优选地，控制在32°C。
优选地，步骤1）和步骤2）中通气搅拌以保持共底物溶液的溶氧水平高于1 mg/L；更优选地，高于1.5 mg/L。
优选地，步骤2）的转化时间为15 ~ 75小时；更优选地，为68 h。
优选地，步骤2）中4-羟基-2-丁酮以10 ~ 55 g/L的浓度添加在含有膜醭毕赤酵母PGU的共底物溶液中；更优选地，第一次加入4-羟基-2-丁酮至15 g/L，然后每隔12 h分4批等量加入4-羟基-2-丁酮，直至累积浓度达到49 g/L。
步骤2）后还包括(R)-1,3-丁二醇的分离和纯化步骤：离心分离步骤2）所得的转化液，收集上清液，先用氯化钠饱和，再用等量的乙酸乙酯萃取3次，减压至绝对压力35 ~ 45kPa，蒸发萃取相，得到转化产物。
本发明能够达到以下有益效果：提供了一株能够以4-羟基-2-丁酮为底物手性合成(R)-1,3-丁二醇的膜醭毕赤酵母PGU。充分活化的所述酵母在优选的培养条件下，能够将49 g/L 4-羟基-2-丁酮转化为44.1 g/L (R)-1,3-丁二醇。(R)-1,3-丁二醇收率88.0%，生产率0.649 g/(L h)。产物对映体过量值99%，符合药物合成的光学纯度要求。本发明可以作为进一步开发生物法(R)-1,3-丁二醇生产技术的起点和基础。
附图说明
图1膜醭毕赤酵母（P. membranaefaciens）PGU以4-羟基-2-丁酮为底物的转化产物的核磁共振谱。
图2膜醭毕赤酵母（P. membranaefaciens）PGU以4-羟基-2-丁酮为底物的转化产物的红外光谱。
菌株的保藏
本发明的膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）PGU，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No. 9096，保藏日期：2014年4月28日。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
酵母的氧化还原酶系发挥催化作用，将前手性酮、二酮和酮酯还原为手性醇，业已引起科学和产业界的重视并得到应用，因为手性醇是合成催化剂、液晶、香料、农业化学品和药物的重要原料。不同酵母具有不同的氧化还原能力和立体选择性。
本发明采用的筛选方案具体如下：将本发明人所保藏和自主获取的酵母菌株分别在YPD培养基上30°C培养48 h，转入麦芽汁培养基中30°C摇床培养48 h；离心收集的菌体经无菌生理盐水洗涤2次后，转入以pH值为7.0的0.1 mol/L磷酸钾缓冲溶液配制的50 g/L葡萄糖溶液中30°C摇床培养2 h；向葡萄糖溶液中加入4-羟基-2-丁酮至10 g/L，继续30°C摇床培养24 h；离心收集上清液，先用氯化钠饱和，再用等量的乙酸乙酯萃取；无水硫酸钠干燥萃取相，气相色谱检测其(R)-1,3-丁二醇和(S)-1,3-丁二醇浓度；计算(R)-1,3-丁二醇收率和产物对映体过量值，分析酵母不对称还原羰基的特性和能力。所述YPD培养基的配方：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，琼脂20 g/L。所述麦芽汁培养基的配方：粉碎麦芽65°C糖化4 h，其滤液稀释至5°Bx。
本发明筛选到一株能够将49 g/L 4-羟基-2-丁酮转化为44.1 g/L (R)-1,3-丁二醇的菌株，(R)-1,3-丁二醇收率88.0%、生产率0.649 g/(L h)，产物对映体过量值99%。经18S rDNA鉴定（其序列如SEQ No. 1），命名为膜醭毕赤酵母（P. membranaefaciens）PGU。其产物根据核磁共振谱和红外光谱（见图1和2）进一步确定为(R)-1,3-丁二醇。
膜醭毕赤酵母（P. membranaefaciens）PGU按照如下方案活化和增殖：将保藏于–70ºC的25%甘油溶液中的所述酵母接入麦芽汁培养基，32°C摇床活化48 h，再转入新鲜的麦芽汁培养基，接入密度10 × 106 /mL，通气搅拌以保持溶氧水平高于1.2 mg/L，32°C培养48 h，离心分离，所得酵母用无菌生理盐水洗涤2次。其中，所述麦芽汁培养基的配方：粉碎麦芽65°C糖化4 h，其滤液稀释至5°Bx。
(R)-1,3-丁二醇按照如下方案分离和纯化：离心分离转化液，收集上清液，先用氯化钠饱和，再用等量的乙酸乙酯萃取3次，减压至绝对压力35 ~ 45 kPa，蒸发萃取相，得到转化产物。
实施例1
将膜醭毕赤酵母PGU接入以pH值为7.0的0.1 mol/L磷酸钾缓冲溶液配制的90 g/L蔗糖溶液，接入密度12 × 106 /mL，通气搅拌以保持转化过程的溶氧水平高于1.5 mg/L，32°C预培养2 h。向蔗糖溶液中加入4-羟基-2-丁酮至15 g/L，转化时间22 h。离心收集上清液，先用氯化钠饱和，再用等量的乙酸乙酯萃取3次。减压（绝对压力35 ~ 45 kPa）蒸发萃取相，得到产物。根据核磁共振谱和红外光谱，鉴定产物为(R)-1,3-丁二醇。气相色谱检测结果表明，转化液中(R)-1,3-丁二醇含量为13.3 g/L。转化过程的(R)-1,3-丁二醇收率86.7%、生产率0.605 g/(L h)，产物对映体过量值99%。
气相色谱条件：色谱柱Varian CP-cyclo dextrin-β-236-M-19（50 m × 0.32 mm× 0.25 µm），氢火焰离子化检测器，色谱柱温度260°C，进样口温度250°C，检测器温度260°C，氮气作载气，流速50 cm/s，内标物乙二醇进样量1 µL。
(R)-1,3-丁二醇收率 = [(p R / MP) / (s / MS)] × 100%
(R)-1,3-丁二醇生产率 = p R / t
产物对映体过量值 = [(p R – p S ) / (p R + p S )] × 100%
式中，s为转化过程中所添加的4-羟基-2-丁酮累积浓度（mol/L），p R 和p S 分别为转化结束时的(R)-1,3-丁二醇和(S)-1,3-丁二醇浓度（mol/L），t为转化时间，MP和MS分别为(R)-1,3-丁二醇和4-羟基-2-丁酮的分子量。
实施例2
将膜醭毕赤酵母PGU接入以pH值为7.0的0.1 mol/L磷酸钾缓冲溶液配制的90 g/L蔗糖溶液，接入密度12 × 106 /mL，通气搅拌以保持转化过程的溶氧水平高于1.5 mg/L，32°C预培养2 h。向蔗糖溶液中加入4-羟基-2-丁酮至30 g/L，转化时间48 h。离心收集上清液，先用氯化钠饱和，再用等量的乙酸乙酯萃取3次。减压（绝对压力35 ~ 45 kPa）蒸发萃取相，得到(R)-1,3-丁二醇。气相色谱检测结果表明，转化液中(R)-1,3-丁二醇含量为20.6g/L。转化过程的(R)-1,3-丁二醇收率67.1%、生产率0.429 g/(L h)，产物对映体过量值99%。
实施例3
将膜醭毕赤酵母PGU接入含有9 g/L磷酸氢二钾、6 g/L磷酸二氢钾、0.5 g/L硫酸铜、0.2 g/L氯化钴、0.1 g/L钼酸钠、0.1 g/L硫胺素和0.1 g/L生物素的90 g/L蔗糖溶液，接入密度12 × 106 /mL，通气搅拌以保持转化过程的溶氧水平高于1.5 mg/L，32°C预培养2 h。向蔗糖溶液中加入4-羟基-2-丁酮至15 g/L，然后每隔12 h分4批等量加入4-羟基-2-丁酮，直至累积浓度达到49 g/L，转化时间68 h。离心收集上清液，先用氯化钠饱和，再用等量的乙酸乙酯萃取3次。减压（绝对压力35 ~ 45 kPa）蒸发萃取相，得到(R)-1,3-丁二醇。气相色谱检测结果表明，转化液中(R)-1,3-丁二醇含量为44.1 g/L。转化过程的(R)-1,3-丁二醇收率88.0%、生产率0.649 g/(L h)，产物对映体过量值99%。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
<110> 温州大学
<120> 膜醭毕赤酵母及其在手性合成(R)-1,3-丁二醇中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1050
<212> DNA
<213> 膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）PGU
<400> 1
ataaccgtgg aaaatctaga gctaatacat gcgtaaagcc ccgacttcgg gaggggtgta 60
tttattagat aaaaaatcaa tgccctcggg ccttttgatg attcataata acttttcgaa 120
gcccatggcc ttgtgccggc ggctggttca ttcaaatttc tccctatcac tttcgatggt 180
aggatagagg cctaccatgg ttttcacggg taacggggaa taagggttcg attccggaga 240
gggagcctga gagacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat 300
cctgacacag ggaggtagtg acaatatata acgatacggg ccattggtct tgtaattgga 360
atgagtacaa tgtaaatacc ttaacgagga acaattggag ggcaagtctg gtgccagcag 420
ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata ttaaagttgt tgcagttaaa aagctcgtag 480
ttgaagtttg ggcctgggcg ggcggtctac ctatggtgag tactgctgcg gccgggtctt 540
tccttctggc tagcccttgt ggcgaaccag gacgattact ttgaggaaat tagagtgttc 600
aaagcaggcc tttgctcgaa tatattagca tggaataata gaataggacg tatggttcta 660
ttttgttggt ttctaggacc atcgtaatga ttaataggga cggtcggggg catcagtatt 720
cagttgtcag aggtgaaatt cttggattaa caaggacgtt ttcattaatc aagaacgaaa 780
gttaggggat cgaagatgat cagataccgt cgtagtctta accataaact atgccgacta 840
gggatcgggt ggcgctttgt ggcccactcg gcaccttagg agaaatcaaa gtctttgggt 900
tctgggggga gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca 960
ggagtggagc ctgcggctta atttgactca acacggggaa actcaccagg tccagacgta 1020
ataaggattg acaagttaga gacttctctt 1050

Claims (10)

1.一株膜醭毕赤酵母，其特征在于，所述菌株为膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）PGU，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 9096，保藏日期：2014年4月28日。
2.权利要求1所述的膜醭毕赤酵母以4-羟基-2-丁酮为底物手性合成(R)-1,3-丁二醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）预培养：膜醭毕赤酵母PGU接入共底物溶液，培养时间为2 h；
2）转化：向步骤1）得到的含有膜醭毕赤酵母PGU的共底物溶液中加入4-羟基-2-丁酮，以供膜醭毕赤酵母PGU进行生物转化，得到所述(R)-1,3-丁二醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）所述共底物溶液为在pH值为7.0的0.1 mol/L磷酸钾缓冲溶液中加入共底物得到的溶液，所述共底物为蔗糖、葡萄糖、甘油或乙醇中的一种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）所述共底物溶液为在含有9 g/L磷酸氢二钾、6 g/L磷酸二氢钾、0.5 g/L硫酸铜、0.2 g/L氯化钴、0.1 g/L钼酸钠、0.1 g/L硫胺素和0.1 g/L生物素的水溶液中加入共底物得到的溶液，所述共底物为蔗糖、葡萄糖、甘油或乙醇中的一种。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述共底物为蔗糖，其在共底物溶液中的浓度为60 ~ 120 g/L。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述膜醭毕赤酵母的接入密度为6 × 106 ~ 16 × 106 /mL。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）和步骤2）的温度为26 ~ 34°C。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）和步骤2）中通气搅拌以保持共底物溶液的溶氧水平高于1 mg/L。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）中4-羟基-2-丁酮以10 ~ 55 g/L的浓度添加在含膜醭毕赤酵母PGU的共底物溶液中，转化时间为15 ~ 75小时。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）后还包括(R)-1,3-丁二醇的分离和纯化步骤：离心分离步骤2）所得的转化液，收集上清液，先用氯化钠饱和，再用等量的乙酸乙酯萃取3次，减压至绝对压力35 ~ 45 kPa，蒸发萃取相，得到转化产物。
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