CN101280333B - 一种利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法，包括：(1)菌种选择，(2)斜面培养，(3)摇瓶发酵培养，(4)发酵罐扩大培养，(5)收集发酵产物，(6)青霉源性抗菌肽的分离纯化等步骤；本发明方法可以快速大量获得高纯度的青霉源性抗菌肽，并且方法简便、成本低、周期短、技术上容易实现，适于工业化生产，分离纯化后的青霉源性抗菌肽最终纯度大于97％以上，可明显抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗药株，MIC为500μg/ml，极具应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗菌活性的青霉源性抗菌肽的制备方法，尤其涉及一种利用灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)制备青霉源性抗菌肽的方法。属生物制药领域。
背景技术
抗生素的抗药性问题日益严重，目前常见病原菌(如金黄色葡萄球菌、肠球菌、肺炎链球菌)等的抗药株不断增加，且在不同抗生素间普遍有交叉抗药性；致使医院在治疗病原菌引起的临床感染时可选用的抗生素十分有限。由于临床用药的迫切需要，近年来人们已越来越重视寻找抗抗药性金葡菌、肠球菌和肺炎链球菌的抗生素。
抗菌肽以其广谱、高效、不易产生抗性菌等特点在临床上日益受到重视。抗菌肽对生物有天然免疫作用，具有广谱的抗菌性能，对革兰氏阴性和阳性细菌均具有杀灭或抑制作用，对真菌、病毒、癌细胞也有作用，被称为“第二防御体系”。抗菌肽作用于细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，使小分子代谢物快速流出细胞外，使细菌不能保持正常渗透压而死亡，细菌难以对其产生抗药性。随着对抗菌肽了解的增多和新型抗菌肽的发现，抗菌肽已经成为人类对抗病原细菌和真菌感染的新兴药物的重要成员。一些生物技术公司已经建立了抗菌肽在疾病治疗中的应用平台。Datamonitor公司的研究报告显示：蛋白质类药物市场在今后10年内将快速增长，并更具吸引力，其中，多肽药物是不容忽视的亮点。2002年，美国、英国、德国、法国、意大利、西班牙和日本这世界七大药物市场上的抗菌药物总值高达150亿美元，肽类药物占有绝对份额。2002年世界七大药物市场中用于治疗革兰氏阳性抗药菌株引致感染的抗生素销售额约为3亿美元，而肽类药物占了这一细分市场近80％的份额。美国占有全球肽类药物市场的65％，欧洲占30％，其中主要市场在德国和英国；亚洲的主要市场在日本。
虽然抗菌肽在医药工业中有广阔的应用前景，但要成为能实际应用于临床的抗感染类药物，还存在一些亟待解决的问题：(1)现有抗菌肽多采用化学方法合成，成本偏高；(2)若采用基因工程方法合成，目前又尚未形成一种适用于工业化生产的方法；(3)外源性的抗菌肽会被体内蛋白酶降解，尚未有成熟的方法解决这一问题。
实验证实，微生物来源的抗菌肽不存在上述问题。目前，有近2 000万株微生物药物产生菌被分离出来，被描述的微生物药物有20 000种，每年有200多种微生物来源的新化合物被报道，但迄今为止，已明确结构的真菌源抗菌肽不足500种，实际应用于临床的更少。因此，从微生物中寻找开发具有自主知识产权的抗抗药菌的肽类抗生素具有重要的现实意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提出一种利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法，以实现从灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)发酵液中提取并获得能抑制抗性病原菌的肽类抗菌物质的目的。
本发明所述的灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)已于2008年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国北京)，其保藏编号为CGMCC No.2325。
上述灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)基本特征是：菌落在查氏琼脂(CA)平板上生长适度，25℃7天直径26-28mm；有辐射状波纹；质地绒状；边缘白色，中部暗黄绿色，反面黄白色。分生孢子梗发生于气生菌丝，孢梗茎180-350×2.5-3.5μm，壁平滑；帚状枝双轮生，少见生有副枝者，双轮生者每轮梗基2-4个，排列紧密，10-14×2.5-3.2μm；瓶梗安瓿瓶，每轮4-8个，8.5-11.5×2.0-2.5μm；分生孢子球形、近球形，2.5-3.5μm，平滑，分生孢子链长。
利用本发明所述灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)制备青霉源性抗菌肽的方法，具体步骤如下：
(1)菌种选择：选用灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)CGMCC No.2325；
(2)斜面培养：将上述菌种接种于种子培养基中，25～30℃条件下，静止培养2～5d；
(3)摇瓶发酵培养：用灭菌蒸馏水冲洗步骤(2)培养后的菌株，收集洗下的孢子并用玻璃珠充分摇散，制成孢子悬浮液；在无菌条件下以体积比为1～8％的接种量，将孢子悬浮液加入装有100～200mL发酵培养基的500ml三角瓶中，置120rpm摇床，25～30℃条件下，振荡培养4～5d，制得种子液；
(4)发酵罐扩大培养：无菌条件下以体积比为1～10％的接种量，将种子液接种于装有4～6L发酵培养基的7～10L发酵罐中，然后按照2～3滴/L的量加入消泡剂，密闭，以搅拌速度300～350rpm，25～30℃条件，振荡培养68～80小时；
(5)收集发酵产物：将步骤(4)所得的发酵液用两层纱布过滤除去菌丝，滤液于12000rpm离心30～40min，收集上清液；
上清液经截留分子量5000的滤膜(Amicon)超滤1次，滤过液以温度为-50℃±1℃，真空压力为0.13mbar±0.01mbar的条件进行低温减压干燥，得到的黄褐色粉末即为青霉源性抗菌肽的粗品；
(6)青霉源性抗菌肽的分离纯化：将步骤(5)中获得的青霉源性抗菌肽的粗品用蒸馏水溶解使浓度为1g/3ml，通过Sephadex LH-20分子筛柱层析进行初步分离；上样量3ml(1g)，双蒸水洗脱，流速5ml/20min，220nm检测，每20min收集一管，留取洗脱体积150ml～200ml时的洗脱液，以温度为-50℃±1℃，真空压力为0.13mbar±0.01mbar的条件进行低温减压干燥，得黄色粉末；将制得的黄色粉末进行第一次HPLC分离，柱型：SCR-101C Ca型糖柱(Waters)，7.9mm×30cm；上样量30μl；流速0.5ml/min；折光示差检测器；流动相：Milipure水；收集第4个洗脱峰，洗脱液以前述条件进行低温减压干燥，得淡黄色粉末；将制得的淡黄色粉末进行第二次HPLC分离，分离条件同第一次，洗脱峰只有一个单峰，收集洗脱液并以前述条件进行低温减压干燥，得白色粉末即为青霉源性抗菌肽纯品。
上述种子培养基配方为：麸皮100g，水1L，煮沸30min；过滤，添加琼脂15～20g。
上述发酵培养基配方为：每1000毫升蒸馏水中添加麦芽糖15g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，(NH4)2SO4 18g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g；pH7.0。
上述利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法中：步骤(2)、(3)、(4)中所述的培养温度优选25℃。
上述利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法中：步骤(4)中所述消泡剂是“泡敌”。
上述利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法中：步骤(4)中所述振荡培养时间优选80小时。
上述利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法中：步骤(6)中所述洗脱液的收集是以抑菌圈法的抑菌活性测定结果为指标进行的。
利用本发明方法可以快速大量获得高纯度的青霉源性抗菌肽，并且方法简便、成本低、周期短、技术上容易实现，适于工业化生产，分离纯化后的青霉源性抗菌肽最终纯度大于97％以上，可以直接用于制剂的研究和制备。
本发明所述方法制备的青霉源性抗菌肽呈白色粉末状，极易溶于水，难溶于有机溶剂，分子量在2000以下。茚三酮、双缩脲反应呈阳性；Seliwanoff反应呈鲜红色。热稳定性好，50℃保温30min活性不下降；煮沸30min活性仍保持50％以上。在pH 2-10范围内稳定。活性不受β-内酰胺酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、羟胺影响。推测为含有糖基的抗菌肽类物质。
试验显示：本发明制备的青霉源性抗菌肽能破坏细菌细胞膜，引起胞内物质泄漏，可以明显抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗药株，尤其是对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)多抗菌株(青霉素、庆大霉素、头孢菌素、链霉素、氯霉素、四环素、利福平)抑制作用显著，MIC为500μg/ml，具有极大的应用前景。
附图说明
本发明提供的菌株灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)已于2008年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏编号为CGMCC No.2325。
图1本发明所述抗菌肽的Sephadex LH-20分子筛柱层析图谱。
图2LH-20分子筛柱层析后青霉源性抗菌肽的抑菌活性。
其中：1：层析后；2：层析前；3：空白对照。
图3青霉源性抗菌肽(AF)在HPLC糖柱上的第一次分离图谱。
图4青霉源性抗菌肽(AF)在HPLC糖柱上的第二次分离图谱。
具体实施方式
实施例1：灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)CGMCC No.2325的筛选。
经过常规富集培养，平板划线等方法将采集的霉菌样品进行筛选，获得了一株高抗菌肽分泌量灰玫瑰青霉菌株，所述灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)基本特征是：菌落在查氏琼脂(CA)平板上生长适度，25℃7天直径26-28mm；有辐射状波纹；质地绒状；边缘白色，中部暗黄绿色，反面黄白色。分生孢子梗发生于气生菌丝，孢梗茎180-350x 2.5-3.5μm，壁平滑；帚状枝双轮生，少见生有副枝者，双轮生者每轮梗基2-4个，排列紧密，10-14×2.5-3.2μm；瓶梗安瓿瓶，每轮4-8个，8.5-11.5×2.0-2.5μm；分生孢子球形、近球形，2.5-3.5μm，平滑，分生孢子链长。
上述菌株灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)，已于2008年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏编号为CGMCC No.2325。
实施例2：利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法，具体步骤如下：
(1)菌种选择：选用灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)CGMCC No.2325；
(2)斜面培养：将上述菌种接种于种子培养基中，25℃条件下，静止培养5d；
(3)摇瓶发酵培养：用灭菌蒸馏水冲洗步骤(2)培养后的菌株，收集洗下的孢子并用玻璃珠充分摇散，制成孢子悬浮液；在无菌条件下以体积比为5％的接种量，将孢子悬浮液加入装有150mL发酵培养基的500ml三角瓶中，置120rpm摇床，25℃条件下，振荡培养5d，制得种子液；
(4)发酵罐扩大培养：无菌条件下以体积比为8％的接种量，将种子液接种于装有5L发酵培养基的7L发酵罐中，然后按照2滴/L的量加入消泡剂(泡敌)，密闭，以搅拌速度300rpm，25℃条件，振荡培养80小时；
(5)收集发酵产物：将步骤(4)所得的发酵液用两层纱布过滤除去菌丝，滤液于12000rpm离心30min，收集上清液；
上清液经截留分子量5000的滤膜超滤1次，滤过液以温度为-50℃±1℃，真空压力为0.13mbar±0.01mbar的条件进行低温减压干燥，得到的黄褐色粉末即为青霉源性抗菌肽的粗品(1L发酵液约得7.1g粗样品)；
(6)青霉源性抗菌肽的分离纯化：将步骤(5)中获得的青霉源性抗菌肽的粗品用蒸馏水溶解使浓度为1g/3ml，通过Sephadex LH-20分子筛柱层析进行初步分离；上样量3ml(1g)，双蒸水洗脱，流速5ml/20min，220nm检测，每20min收集一管，留取洗脱体积150ml～200ml时的洗脱液(洗脱液的收集是以抑菌圈法的抑菌活性测定结果为指标进行的，见图1、图2)，以温度为-50℃±1℃，真空压力为0.13mbar±0.01mbar的条件进行低温减压干燥，得黄色粉末(1L发酵液约得0.5g黄色粉末)；将制得的黄色粉末进行第一次HPLC分离，柱型：SCR-101C Ca型糖柱(Waters)，7.9mm×30cm；上样量30μl；流速0.5ml/min；折光示差检测器；流动相：Milipure水；收集第4个洗脱峰(见图3)，洗脱液以前述条件进行低温减压干燥，得淡黄色粉末；将制得的淡黄色粉末进行第二次HPLC分离，分离条件同第一次，洗脱峰只有一个单峰(见图4)，收集洗脱液并以前述条件进行低温减压干燥，得白色粉末即为青霉源性抗菌肽纯品(1L发酵液约得白色粉末80mg)。
其中：上述种子培养基配方为：麸皮100g，水1L，煮沸30min；过滤，添加琼脂15～20g；
上述发酵培养基配方为：每1000毫升蒸馏水中添加麦芽糖15g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，(NH4)2SO4 18g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g；pH7.0。
实施例3：利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法，具体步骤如下：
(1)菌种选择：选用灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)CGMCC No.2325；
(2)斜面培养：将上述菌种接种于种子培养基中，28℃条件下，静止培养4d；
(3)摇瓶发酵培养：用灭菌蒸馏水冲洗步骤(2)培养后的菌株，收集洗下的孢子并用玻璃珠充分摇散，制成孢子悬浮液；在无菌条件下以体积比为6％的接种量，将孢子悬浮液加入装有200mL发酵培养基的500ml三角瓶中，置120rpm摇床，28℃条件下，振荡培养4d，制得种子液；
(4)发酵罐扩大培养：无菌条件下以体积比为5％的接种量，将种子液接种于装有4L发酵培养基的7L发酵罐中，然后按照2滴/L的量加入消泡剂(泡敌)，密闭，以搅拌速度320rpm，28℃条件，振荡培养68小时；
(5)收集发酵产物：将步骤(4)所得的发酵液用两层纱布过滤除去菌丝，滤液于12000rpm离心35min，收集上清液；
上清液经截留分子量5000的滤膜超滤1次，滤过液以温度为-50℃±1℃，真空压力为0.13mbar±0.01mbar的条件进行低温减压干燥，得到的黄褐色粉末即为青霉源性抗菌肽的粗品；
(6)青霉源性抗菌肽的分离纯化：将步骤(5)中获得的青霉源性抗菌肽的粗品用蒸馏水溶解使浓度为1g/3ml，通过Sephadex LH-20分子筛柱层析进行初步分离；上样量3ml(1g)，双蒸水洗脱，流速5ml/20min，220nm检测，每20min收集一管，留取洗脱体积150ml～200ml时的洗脱液，以温度为-50℃±1℃，真空压力为0.13mbar±0.01mbar的条件进行低温减压干燥，得黄色粉末；将制得的黄色粉末进行第一次HPLC分离，柱型：SCR-101C Ca型糖柱(Waters)，7.9mm×30cm；上样量30μl；流速0.5ml/min；折光示差检测器；流动相：Milipure水；收集第4个洗脱峰，洗脱液以前述条件进行低温减压干燥，得淡黄色粉末；将制得的淡黄色粉末进行第二次HPLC分离，分离条件同第一次，洗脱峰只有一个单峰，收集洗脱液并以前述条件进行低温减压干燥，得白色粉末即为青霉源性抗菌肽纯品。
其中：上述种子培养基配方为：麸皮100g，水1L，煮沸30min；过滤，添加琼脂15～20g；
上述发酵培养基配方为：每1000毫升蒸馏水中添加麦芽糖15g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，(NH4)2SO4 18g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g；pH 7.0。
实施例4：利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法，具体步骤如下：
(1)菌种选择：选用灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)CGMCC No.2325；
(2)斜面培养：将上述菌种接种于种子培养基中，30℃条件下，静止培养2d；
(3)摇瓶发酵培养：用灭菌蒸馏水冲洗步骤(2)培养后的菌株，收集洗下的孢子并用玻璃珠充分摇散，制成孢子悬浮液；在无菌条件下以体积比为8％的接种量，将孢子悬浮液加入装有100mL发酵培养基的500ml三角瓶中，置120rpm摇床，30℃条件下，振荡培养4.5d，制得种子液；
(4)发酵罐扩大培养：无菌条件下以体积比为10％的接种量，将种子液接种于装有6L发酵培养基的10L发酵罐中，然后按照3滴/L的量加入消泡剂(泡敌)，密闭，以搅拌速度350rpm，30℃条件，振荡培养100小时；
(5)收集发酵产物：将步骤(4)所得的发酵液用两层纱布过滤除去菌丝，滤液于12000rpm离心40min，收集上清液；
上清液经截留分子量5000的滤膜超滤1次，滤过液以温度为-50℃±1℃，真空压力为0.13mbar±0.01mbar的条件进行低温减压干燥，得到的黄褐色粉末即为青霉源性抗菌肽的粗品；
(6)青霉源性抗菌肽的分离纯化：将步骤(5)中获得的青霉源性抗菌肽的粗品用蒸馏水溶解使浓度为1g/3ml，通过Sephadex LH-20分子筛柱层析进行初步分离；上样量3ml(1g)，双蒸水洗脱，流速5ml/20min，220nm检测，每20min收集一管，留取洗脱体积150ml～200ml时的洗脱液，以温度为-50℃±1℃，真空压力为0.13mbar±0.01mbar的条件进行低温减压干燥，得黄色粉末；将制得的黄色粉末进行第一次HPLC分离，柱型：SCR-101C Ca型糖柱(Waters)，7.9mm×30cm；上样量30μl；流速0.5ml/min；折光示差检测器；流动相：Milipure水；收集第4个洗脱峰，洗脱液以前述条件进行低温减压干燥，得淡黄色粉末；将制得的淡黄色粉末进行第二次HPLC分离，分离条件同第一次，洗脱峰只有一个单峰，收集洗脱液并以前述条件进行低温减压干燥，得白色粉末即为青霉源性抗菌肽纯品。
其中：上述种子培养基配方为：麸皮100g，水1L，煮沸30min；过滤，添加琼脂15～20g；
上述发酵培养基配方为：每1000毫升蒸馏水中添加麦芽糖15g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，(NH4)2SO4 18g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g；pH7.0。
Claims (4)
1.一种利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法，具体步骤如下：
(1)菌种选择：选用灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)CGMCC No.2325；
(2)斜面培养：将上述菌种接种于种子培养基中，25～30℃条件下，静止培养2～5d；
(3)摇瓶发酵培养：用灭菌蒸馏水冲洗步骤(2)培养后的菌株，收集洗下的孢子并用玻璃珠充分摇散，制成孢子悬浮液；在无菌条件下以体积比为1～8％的接种量，将孢子悬浮液加入装有100～200mL发酵培养基的500ml三角瓶中，置120rpm摇床，25～30℃条件下，振荡培养4～5d，制得种子液；
(4)发酵罐扩大培养：无菌条件下以体积比为1～10％的接种量，将种子液接种于装有4～6L发酵培养基的7～10L发酵罐中，然后按照2～3滴/L的量加入消泡剂，密闭，以搅拌速度300～350rpm，25～30℃条件，振荡培养68～100小时；
(5)收集发酵产物：将步骤(4)所得的发酵液用两层纱布过滤除去菌丝，滤液于12000rpm离心30～40min，收集上清液；
上清液经截留分子量5000的滤膜超滤1次，滤过液以温度为-50℃±1℃，真空压力为0.13mbar±0.01mbar的条件进行低温减压干燥，得到的黄褐色粉末即为青霉源性抗菌肽的粗品；
(6)青霉源性抗菌肽的分离纯化：将步骤(5)中获得的青霉源性抗菌肽的粗品用蒸馏水溶解使浓度为1g/3ml，通过Sephadex LH-20分子筛柱层析进行初步分离；上样量3ml，双蒸水洗脱，流速5ml/20min，220nm检测，每20min收集一管，留取洗脱体积150ml～200ml时的洗脱液，以温度为-50℃±1℃，真空压力为0.13mbar±0.01mbar的条件进行低温减压干燥，得黄色粉末；将制得的黄色粉末进行第一次HPLC分离，柱型：SCR-101C Ca型糖柱，7.9mm×30cm；上样量30μl；流速0.5ml/min；折光示差检测器；流动相：Milipure水；收集第4个洗脱峰，洗脱液以前述条件进行低温减压干燥，得淡黄色粉末；将制得的淡黄色粉末进行第二次HPLC分离，分离条件同第一次，洗脱峰只有一个单峰，收集洗脱液并以前述条件进行低温减压干燥，得白色粉末即为青霉源性抗菌肽纯品；
其中：上述种子培养基配方为：麸皮100g，水1L，煮沸30min；过滤，添加琼脂15～20g；
上述发酵培养基配方为：每1000毫升蒸馏水中添加麦芽糖15g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，(NH4)2SO4 18g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g；pH7.0。
2.如权利要求1所述利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法，其特征是：步骤(1)所述灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)CGMCC No.2325已于2008年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
3.如权利要求1所述利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法，其特征是：步骤(2)、(3)、(4)中所述的培养温度是25℃。
4.如权利要求1所述利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法，其特征是：步骤(4)中所述振荡培养时间是80小时。
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| CN1073117C (zh) * | 1996-01-16 | 2001-10-17 | 中国农业科学院生物技术研究中心 | 抗菌肽及其生产方法和应用 |
| CN101020916A (zh) * | 2006-10-23 | 2007-08-22 | 中国海洋大学 | 一种抗果蔬病原菌活性肽的制备方法 |
-
2008
- 2008-02-15 CN CN2008100145611A patent/CN101280333B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1073117C (zh) * | 1996-01-16 | 2001-10-17 | 中国农业科学院生物技术研究中心 | 抗菌肽及其生产方法和应用 |
| CN101020916A (zh) * | 2006-10-23 | 2007-08-22 | 中国海洋大学 | 一种抗果蔬病原菌活性肽的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 杨炜华.真菌产生的低分子活性物质研究.《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》.2006, * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101280333A (zh) | 2008-10-08 |
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